楊一帆 秦 一 徐唯哲 徐平湘 薛 明*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院國(guó)家藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，北京 100069；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100045;4.中國(guó)民用航空局民用航空醫(yī)學(xué)中心(民航總醫(yī)院)，北京 100123；5.首都醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)與儀器北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

·基礎(chǔ)研究 ·

吡硫醇在低氧與常氧環(huán)境下大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究

楊一帆1,2秦 一3徐唯哲4徐平湘1,5薛 明1,5*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系，北京 100069；2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院國(guó)家藥物臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)，北京 100069；3.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100045;4.中國(guó)民用航空局民用航空醫(yī)學(xué)中心(民航總醫(yī)院)，北京 100123；5.首都醫(yī)科大學(xué)生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)與儀器北京實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

目的 研究比較吡硫醇在低氧和常氧狀態(tài)大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征。方法 將SD大鼠采用數(shù)字表法隨機(jī)分為低氧組與常氧組，低氧動(dòng)物預(yù)處理后進(jìn)行吡硫醇單次灌胃給藥的藥代動(dòng)力學(xué)研究。采用本課題組建立的快速靈敏的超高效液相質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定不同時(shí)間的血藥濃度，用DAS2.0軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，并用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果 吡硫醇在常氧和低氧大鼠體內(nèi)的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)分別為：AUC(0-t)(88.26±9.86)ng·h·mL-1和(80.67±8.95)ng·h·mL-1；MRT(0-t)(4.14±0.32)h和(3.67±0.26)h；t1/2(3.72±1.82)h和(3.14±1.42)h；tmax(0.58±0.20)h和(0.67±0.26)h；Cmax(30.12±2.36)ng/mL和(20.05±1.31)ng/mL。與常氧狀態(tài)大鼠的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)相比，低氧狀態(tài)下吡硫醇在大鼠體內(nèi)的Cmax和MRT(0-t)有顯著性降低，而其他主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 低氧影響藥物在大鼠體內(nèi)達(dá)峰濃度，進(jìn)而可影響藥物的穩(wěn)態(tài)血藥濃度、治療效果和毒性反應(yīng)。

吡硫醇；藥代動(dòng)力學(xué)；低氧；常氧；超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

低氧不僅影響機(jī)體細(xì)胞的生命活動(dòng)、自身平衡和內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)定，也影響著相關(guān)疾病的發(fā)生和發(fā)展[1]。低氧可以導(dǎo)致組織器官的代謝功能、甚至形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生異常變化，這些變化均可能影響藥物在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)化等藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程，進(jìn)而影響藥物的治療效果和不良反應(yīng)[2-3]。高原低氧環(huán)境的影響和急進(jìn)高原人群的快速增加，致使機(jī)體的適應(yīng)性對(duì)藥物的影響等研究引起了廣泛關(guān)注[4-5]。隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的深入發(fā)展和低氧環(huán)境用藥的臨床需要，抗低氧藥物的藥代動(dòng)力學(xué)亟待深入研究，以滿(mǎn)足不同病人的臨床個(gè)體化治療要求。

吡硫醇(Pyritinol)又稱(chēng)腦復(fù)新，是腦代謝改善和促智藥，臨床用于腦震蕩綜合征以及腦外傷、腦炎及腦膜炎后遺癥等引起的頭痛、頭暈、失眠、記憶力減退、注意力不集中、情緒變化等癥狀的改善，亦可用于腦動(dòng)脈硬化癥和老年性癡呆等[6]。吡硫醇可促進(jìn)腦內(nèi)葡萄糖及氨基酸的代謝，改善機(jī)體同化作用，并可增加頸動(dòng)脈血流量，改善腦血流量。進(jìn)一步研究[7]表明，吡硫醇可降低糖尿病大鼠的傷害感受和氧化應(yīng)激反應(yīng)。與長(zhǎng)春西丁聯(lián)合用藥可降低血液黏稠度[8]。吡硫醇耐酸、不受胃酸破壞，胃腸道吸收好，血藥濃度穩(wěn)定。已知吡硫醇的藥理作用與其藥代動(dòng)力學(xué)密切相關(guān)，然而，目前缺乏更加靈敏的吡硫醇血藥濃度測(cè)定方法，因此，本課題組應(yīng)用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS/MS)建立了吡硫醇的靈敏快速的體內(nèi)測(cè)定方法，研究比較了低氧和常氧狀態(tài)下大鼠體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特征，結(jié)果為吡硫醇的低氧臨床用藥提供了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康Sprague-Dawley (SD) 大鼠，雄性，體質(zhì)量220～260 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK (京) 2012-0001。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

超高效液相色譜與串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜備用(ACQUITY UPLCTQD，美國(guó)Waters公司)；ACQUITY BEH C18色譜柱(2.1×50 mm, 1.7 μm,美國(guó)Waters公司)，高速離心機(jī)(美國(guó)eppendorf公司)；2D5-2A型低速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠(chǎng))；萬(wàn)分之一電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)；旋渦混合器(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)；Milli-Q超純水機(jī)(德國(guó)默克公司)；超低溫冰箱(日本三澤公司)。

1.3 藥品與試劑

吡硫醇(批號(hào)：068F03031V，圖1)和甘草素(批號(hào)：XH-13050901，圖1)標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度≥98%；乙腈(色譜純，美國(guó)Thermo Fisher公司)；甲醇(色譜純，美國(guó)Thermo Fisher公司)；水為超純水；甲酸(色譜純，北京Dikma公司)；實(shí)驗(yàn)所用其他試劑純度均為色譜純。

圖1 吡硫醇和內(nèi)標(biāo)甘草素的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.4 色譜與質(zhì)譜條件

采用超高效液相色譜和三重四級(jí)桿質(zhì)譜串聯(lián)，MassLynxV4.1工作站。選用C18色譜柱。流動(dòng)相∶乙腈-水[0.1 %(體積分?jǐn)?shù))甲酸]=2∶98，流速：0.3 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。電噴霧離子化離子源(electron spray ionization, ESI)選用正離子檢測(cè)模式；離子源溫度110 ℃；去溶劑溫度400 ℃；毛細(xì)管電壓為600 V。掃描方式為多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(multiple reaction monitoring, MRM)，定量分析的離子(m/z)分別為369→153(吡硫醇，26 V)和255→135(內(nèi)標(biāo)甘草素，15 V)。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別精密稱(chēng)取吡硫醇5 mg于5 mL容量瓶中，用甲醇溶解并(體積分?jǐn)?shù))少量0.1%甲酸溶解之后用甲醇定容，分別配制成的吡硫醇(1 mg/mL)，同法配置內(nèi)標(biāo)甘草素儲(chǔ)備液(1 mg/mL)。儲(chǔ)備液存放在4 ℃冰箱中。用流動(dòng)相將吡硫醇儲(chǔ)備液稀釋成不同梯度工作液：1 000、500、250、100、50、25、10、5、2.5、1 ng/mL，同時(shí)將內(nèi)標(biāo)甘草素儲(chǔ)備液稀釋成100 ng/mL的工作液。

1.6 血漿樣品處理

取1.5 mL離心管，準(zhǔn)確吸取大鼠血漿樣品100 μL，依次加入內(nèi)標(biāo)(甘草素)溶液(100 ng/mL)20 μL，甲醇300 μL，渦旋2 min使其混合混勻。于13 000 r/min高速離心10 min，吸取上清液。使用0.22 μm的濾膜過(guò)濾，之后轉(zhuǎn)移到樣品瓶中，5 μL上樣。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備及精密度準(zhǔn)確度考察

取大鼠空白血漿0.1mL，依次加入吡硫醇系列標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，配制成吡硫醇濃度分別為0.2、0.5、1、2、5、10、20、100、200 ng/mL的溶液，加入100 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，按照“1.6血漿樣品處理”項(xiàng)下操作，按1.4色譜質(zhì)譜條件測(cè)定。

按“1.6血漿樣品處理”項(xiàng)下操作分別配成低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度各重復(fù)5份，連續(xù)測(cè)定3批樣品，計(jì)算樣品和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，進(jìn)行日內(nèi)和日間準(zhǔn)確度與精密度考察。

1.8 吡硫醇的藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

常氧實(shí)驗(yàn)：使用配對(duì)比較法隨機(jī)分組，選擇插管大鼠進(jìn)入常氧實(shí)驗(yàn)組，編號(hào)后在室溫常氧條件下進(jìn)行預(yù)適應(yīng)。給藥前禁食12 h，給予自由飲水。稱(chēng)體質(zhì)量后根據(jù)每只大鼠的體質(zhì)量按照40 mg/kg的劑量口服灌胃給藥。給藥前(0 min)及給藥后5、10、15、30 min及1、2、4、8、12 h共10個(gè)時(shí)間點(diǎn)，頸靜脈取血約0.4 mL，置于含肝素的EP管中，立即13 000 r/min離心10 min獲取血漿，保存于-80 ℃冰箱中。按“1.6血漿樣品處理”項(xiàng)下操作處理血漿樣品。

低氧實(shí)驗(yàn)：使用配對(duì)比較法隨機(jī)分組，取1只大鼠放入低氧箱[9%(體積分?jǐn)?shù)) 氧分壓]內(nèi)，持續(xù)低氧72 h并且給藥前禁食12 h，自由飲水。根據(jù)大鼠體質(zhì)量按照40 mg/kg的劑量口服灌胃給藥。重復(fù)上述操作6次。每次分別于給藥前(0 min)及給藥后5、10、15、30 min及1、2、4、8、12 h頸靜脈取血約0.4 mL，置于含肝素的EP管中，立即13 000 r/min離心10 min獲取血漿。保存于-80 ℃冰箱中。按“1.6血漿樣品處理”項(xiàng)下操作處理血漿樣品。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用 DAS 2.0 軟件處理吡硫醇的經(jīng)時(shí)血藥濃度數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)距方法計(jì)算其藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，主要包括藥時(shí)曲線(xiàn)下面積(area under concentration-time curve,AUC)，平均滯留時(shí)間(mean retention time， MRT)，血漿半衰期(t1/2)，達(dá)峰濃度(Cmax)和達(dá)峰時(shí)間(tmax)等。采用SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)常氧和底氧條件下的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行兩獨(dú)立樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)，考察主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)是否存在差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

2.1.1 方法的專(zhuān)屬性

按照1.4的質(zhì)譜條件，分別對(duì)吡硫醇和甘草素進(jìn)行質(zhì)譜掃描，測(cè)得吡硫醇(m/z369→153)詳見(jiàn)圖2。與甘草素(m/z 255→119)的子離子圖譜(圖3)。大鼠空白血漿、空白血漿加對(duì)照品、樣品血漿的MRM模式色譜圖見(jiàn)圖4，吡硫醇和內(nèi)標(biāo)甘草素的出峰時(shí)間分別為2.2 min和2.6 min。由圖可知血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)吡硫醇與甘草素的測(cè)定均不產(chǎn)生干擾。

圖2 吡硫醇子離子圖譜

圖3 甘草素(內(nèi)標(biāo))子離子圖譜

圖4 大鼠血漿中吡硫醇和甘草素的色譜圖

A:blank rat plasma;B:blank rat plasma spiked with Pyritinol (50 ng/mL) and Liquiritigenin (100 ng /mL); C:rat plasma sample obtained 8 h after p.o. administration with a dose of 40 mg/kg of Pyritinol.

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備及定量下限

記錄藥物和內(nèi)標(biāo)的峰面積，以?xún)烧咧葃為縱坐標(biāo)對(duì)吡硫醇濃度x加權(quán)線(xiàn)性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為y=0.074 4+0.032 8x,r=0.997，在0.2～200 ng/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，其最低定量下限為0.2 ng/mL。

2.1.3 準(zhǔn)確度與精密度

日內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation RSD)值在2.5%～11.1%，日間RSD值在3.6%～10.4%，符合生物樣品分析要求測(cè)定要求。結(jié)果詳見(jiàn)表1。

表1 大鼠血漿中吡硫醇的精密度與準(zhǔn)確度

Added/(ng·mL-1)Intra?dayAccuracyPrecisionInter?dayAccuracyPrecision0．597．2±10．811．190．9±10．49．610．093．2±3．94．291．1±3．84．2200．0105．8±2．62．5102．7±3．63．5

2.1.4 提取回收率

低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品各5份，測(cè)定所得吡硫醇的峰面積與空白血漿經(jīng)樣品處理后加入對(duì)應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積之比，結(jié)果詳見(jiàn)表2，提取回收率均符合要求。

表2 大鼠血漿中吡硫醇的提取回收率

Added/(ng·mL-1)RecoveryRSD0．599．2±11．011．110．0100．7±5．45．4200．0104．4±1．71．6

RSD：relative standard deviation

2.1.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品各5份，分別考察室溫放置24 h、反復(fù)凍融3次、-80 ℃放置30 d穩(wěn)定性。結(jié)果詳見(jiàn)表3，表明吡硫醇在這3種條件下的樣品穩(wěn)定存在。

2.2 吡硫醇在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)比較

對(duì)于正常狀態(tài)下和低氧狀態(tài)下的大鼠，分別給藥后使用液質(zhì)聯(lián)用測(cè)定其相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的血漿中的吡硫醇濃度，經(jīng)過(guò)DAS軟件擬合，得到常氧條件下與低氧條件下相同劑量組的大鼠對(duì)應(yīng)的藥物濃度-時(shí)間曲線(xiàn)，與常氧相比，低氧條件下30 min血藥濃度明顯降低。詳見(jiàn)圖5。

表3 大鼠血漿中吡硫醇的穩(wěn)定性

Added/(ng·mL-1)Stability/%24hFreezingandthawing3times-80℃，30d0．594．4±8．485．6±6．886．8±4．210．091．4±2．788．8±4．090．4±2．4200．0103．7±1．298．5±1．599．4±1．7

圖5 大鼠灌胃給藥后吡硫醇(10 mg/kg)在常氧與低氧狀態(tài)下的血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)

使用DAS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理后得到正常條件下與低氧條件下大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，與常氧組相比，低氧組的MRT和Cmax差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)表4。

表4 吡硫醇在大鼠體內(nèi)的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較

*P<0.05 ，**P<0.01vsnormoxic.

3 討論

本文參考常用低氧動(dòng)物模型，采用特制的低氧操作裝置，保持9 %(體積分?jǐn)?shù))氧分壓，建立了常壓大鼠急性低氧模型。在測(cè)定方法方面，以往采用分光光度法[9]或高效薄層色譜-紫外檢測(cè)，之后使用質(zhì)譜進(jìn)一步定性[10]。鑒于臨床用藥方面，酸堿度對(duì)于吡硫醇的穩(wěn)定性影響很大[11-12]，因此建立更加穩(wěn)定準(zhǔn)確的吡硫醇的體內(nèi)測(cè)定方法是進(jìn)一步確證血藥濃度關(guān)系的關(guān)鍵。吡硫醇是維生素B6類(lèi)似物，文獻(xiàn)[13-16]報(bào)道靜脈注射給藥后體內(nèi)代謝迅速，血藥濃度較低。因此這些方法在靈敏度方面不能滿(mǎn)足科研和臨床進(jìn)一步的需求，采用液質(zhì)聯(lián)用方法可以彌補(bǔ)這一點(diǎn)。

從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在常氧條件下，吡硫醇在大鼠體內(nèi)的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)為：AUC(0-t)88.257 ng·h·mL-1，MRT(0-t)4.14 h，t1/23.722 h，Cmax(30.12±2.36)ng/mL。表明吡硫醇口服后在大鼠體內(nèi)的吸收較好，體內(nèi)存留量適宜。從MRT和t1/2值看出，吡硫醇在體內(nèi)的消除較慢，在一定時(shí)間內(nèi)可以維持穩(wěn)定的藥物治療濃度。吡硫醇在低氧條件下的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)為：AUC(0-t)80.665 ng·h·mL-1，MRT(0-t)3.67 h，t1/23.138 h，Cmax20.05 ng/mL。表明在低氧環(huán)境下，吡硫醇口服后在大鼠體內(nèi)的體內(nèi)過(guò)程基本類(lèi)似，顯示其吸收較好，體內(nèi)存留量適宜，體內(nèi)消除較慢，在一定時(shí)間內(nèi)也可維持穩(wěn)定的藥物治療濃度。

比較低氧與常氧狀態(tài)下，吡硫醇的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)發(fā)現(xiàn)，低氧時(shí)吡硫醇的Cmax和MRT(0-t)明顯降低，提示低氧狀態(tài)下吡硫醇在大鼠體內(nèi)的吸收和相應(yīng)的體內(nèi)平均駐留時(shí)間明顯下降。而低氧時(shí)的其他藥動(dòng)學(xué)參數(shù)則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究結(jié)果表明，低氧降低吡硫醇在大鼠體內(nèi)的達(dá)峰濃度和體內(nèi)平均駐留時(shí)間，進(jìn)而影響藥物的穩(wěn)態(tài)血藥濃度和治療效果和毒性反應(yīng)，提示在臨床缺氧環(huán)境使用吡硫醇時(shí)，給藥劑量需要相應(yīng)增大。本研究為吡硫醇在低氧環(huán)境下的給藥方案的調(diào)整和優(yōu)化提供了堅(jiān)實(shí)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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編輯 孫超淵

Pharmacokinetic comparison of Pyritinol in rats under normoxic and hypoxic condition

Yang Yifan1,2，Qin Yi3，Xu Weizhe4, Xu Pingxiang1，5, Xue Ming1,5*

(1.DepartmentofPharmacology,SchoolofBasicMedicalSciences,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China；2.NationalDrugChinicalTrialInstitution,BeijingYouanHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China；3.DepartmentofPharmacy,BeijingChilderen’sHospital,CapitalMedicaluniversity,Beijing100045,China; 4.CivilAviationMedicineCenter,CivilAviationAdministrationofChina(CivilAviationHospital),Beijing100123,China；5.BeijingLaboratoryforBiomedicalDetectionTechnologyandInstrument,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

Objective To determine and compare the pharmacokinetic parameters of Pyritinol in rat plasma under normoxic and hypoxic conditions. Methods An effective and rapid ultra-performance liquid chromatography with tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method with positive electrospray ionization source was successfully developed and validated for quantification of Pyritinol in rat plasma. Sprague-Dawley rats were randomly divided into the hypoxia and normoxic groups. Each rat obtained a single dose of Pyritinol through intragastric administration. The plasma samples were drawn through jugular veins to measure the drug concentrations at different times. The pharmacokinetics parameters were processed via the DAS 2.0 software, and the comparison of main pharmacokinetic parameters in rats between normoxic and hypoxic groups was calculated by the SPSS software via an independent sample t test method. Results The main pharmacokinetic parameters of Pyritinol between the hypoxia and the normoxic rats were as follows: the AUC(0-t)(88.26±9.86) ng·h·mL-1and (80.67±8.95)ng·h·mL-1, MRT(0-t)(4.14±0.32)h and (3.67±0.26)h, t1/2(3.72±1.82) h and (3.14±1.42)h, tmax(0.58±0.20)h and (0.67±0.26)h, Cmax(30.12±2.36)ng/mL and (20.05±1.31)ng/mL, respectively. The values of Cmaxand MRT(o-t) for Pyritinol in hypoxic rats were statistically lower than that in normoxic rats, and other main pharmacokinetic parameters did not have significant differences. Conclusion Hypoxia affects drug peak concentration in rats, and furthermore affects the steady-state blood concentrations of drugs, which could interfere the therapeutic effect and toxic reaction.

Pyritinol; pharmacokinetics; hypoxia; normoxia; UPLC-MS/MS

國(guó)家自然科學(xué)基金(81173121， 81573683)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81173121， 81573683)

時(shí)間：2017-04-13 19∶55

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20170413.1955.032.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.02.016]

R96

2016-09-09)

*Corresponding author， E-mail：xuem@ccmu.edu.cn