［KH－*3D］周大祥，熊書

(1．重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶404100;2．重慶大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶400300;3．重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，重慶404120)

EMA-qPCR方法快速檢測(cè)番茄潰瘍病菌活菌研究

［KH－*3D］周大祥1，2，熊書3*

(1．重慶三峽學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，重慶404100;2．重慶大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶400300;3．重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，重慶404120)

將疊氮溴乙錠(EMA)與實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)相結(jié)合(EMA-qPCR)，建立一種有效快速檢測(cè)番茄潰瘍病活菌的方法。以番茄潰瘍病菌Pat-1基因?yàn)闄z測(cè)靶標(biāo)，菌體經(jīng)EMA滲透處理，再進(jìn)行qPCR特異性擴(kuò)增。結(jié)果顯示，qPCR檢測(cè)靈敏度為1．0×101CFU/mL;當(dāng)EMA的濃度為2．0 μg/mL時(shí)，能有效抑制1．0×107CFU/mL滅活死菌的擴(kuò)增，對(duì)活菌的擴(kuò)增沒有影響。當(dāng)活菌數(shù)在1．0×101～1．0×105CFU內(nèi)，每個(gè)qPCR反應(yīng)體系中活菌CFU數(shù)與Ct值呈線性相關(guān)(R2=0．987)。不同溫度處理后EMA-qPCR檢測(cè)番茄潰瘍病菌的存活情況并與平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行比較，表明待檢樣品可在4和20℃短期保存。對(duì)疑似帶病番茄種子樣品進(jìn)行EMA-qPCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)EMA-qPCR方法能減少番茄潰瘍病菌PCR檢測(cè)的假陽性結(jié)果。本研究建立的EMA-qPCR方法是一種能有效檢測(cè)番茄潰瘍病活菌的方法，并能有效避免PCR檢測(cè)實(shí)際樣品可能造成的假陽性結(jié)果。

番茄潰瘍病菌;疊氮溴乙錠(Ethidium monoazide bromide，EMA);實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)

番茄潰瘍病作為番茄生產(chǎn)中最嚴(yán)重的病害之一，Clavibactermichiganensissubsp．michiganensis (CMM)是其病原菌［1］。目前，番茄瘍病菌的檢測(cè)主要通過PCR技術(shù)，常規(guī)PCR技術(shù)既能對(duì)活菌的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，還能將自由狀態(tài)的DNA或死菌的DNA擴(kuò)增［2］，導(dǎo)致檢測(cè)出現(xiàn)假陽性，因此急需建立一種快速有效檢測(cè)待檢樣品中番茄潰瘍病菌的方法。

疊氮溴乙錠(Ethidium monoazide bromide，EMA)是一種染料，能夠與核酸結(jié)合，當(dāng)光解后生成的氮賓化合物能夠穿過死菌的細(xì)胞膜，與菌體DNA發(fā)生不可逆共價(jià)結(jié)合，PCR擴(kuò)增被抑制，但不會(huì)抑制細(xì)胞膜完整的活菌PCR擴(kuò)增［3－5］。EMA-PCR方法僅以活菌DNA分子為檢測(cè)靶標(biāo)，克服了傳統(tǒng)PCR檢測(cè)假陽性較高的缺點(diǎn)，使結(jié)果更加有效、可靠。因此，本研究擬通過EMA-qPCR對(duì)番茄潰瘍病菌進(jìn)行快速檢測(cè)，分析EMA對(duì)PCR檢測(cè)番茄潰瘍病菌死活細(xì)菌的影響;同時(shí)，初步優(yōu)化了番茄種子中潰瘍病菌活菌的EMA-qPCR檢測(cè)體系。

1 材料與方法

1．1 材料

菌株:番茄潰瘍病菌由西南大學(xué)植保學(xué)院提供，本實(shí)驗(yàn)室保存。

試劑:疊氮溴乙錠(Ethidium monoazide bromide，EMA，Invitrogen)，SYBRPremix Ex Taq TMⅡMix(TaKaRa)，523固體培養(yǎng)基，LB液體培養(yǎng)基。

1．2 方法

1．2．1 番茄潰瘍病菌活菌和死菌的制備挑取523培養(yǎng)基上的番茄潰瘍病菌，接種到20 mL LB液體培養(yǎng)基中，28℃，250 r/min培養(yǎng)10 h，調(diào)整菌懸液濃度為1．0×107CFU/mL。將一半活菌懸液100℃水浴加熱10 min，獲得死菌懸液。

1．2．2 DNA模板制備將番茄潰瘍病菌接種至LB液體培養(yǎng)基，28℃，250 r/min培養(yǎng)10 h，使OD600值在0．4～0．8，按照《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》的操作提取DNA［6］。

1．2．3 番茄潰瘍病菌檢測(cè)特異性引物及熒光定量PCR條件參考Dreier等［7］的報(bào)道，根據(jù)番茄潰瘍病菌Pat-1基因設(shè)計(jì)特異引物PadF(5'-GGTTCTCTATTTCCTCGGTTCCAC-3')和PadR(5'-CCATCCAGCACTTCCCTATGTCT-3')，引物由北京華大基因公司合成。qPCR檢測(cè)使用儀器為CFX96 Real-Time PCR System(BIO-RAD，USA)，熒光染料SYBR GreenⅠ染色。反應(yīng)體系25 μl:12．5 μl SYBR Premix Ex Taq mix(TaKaRa)，引物PadF/PadR(10 μM)各0．75 μl，模板2 μl，加超純水補(bǔ)至25 μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性10 s(95℃15 s，60℃1 min，循環(huán)40次)，qPCR擴(kuò)增完成后隨即分析熔解曲線，擴(kuò)增特異性驗(yàn)證。

1．2．4 熒光定量PCR靈敏度實(shí)驗(yàn)將新鮮培養(yǎng)的番茄潰瘍病菌連續(xù)10倍進(jìn)行稀釋，取稀釋后的菌液各1 mL進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，同時(shí)取對(duì)應(yīng)稀釋的菌液各1 mL涂布平板，28℃培養(yǎng)48～72 h計(jì)數(shù)，重復(fù)3次。

1．2．5 EMA-qPCR條件優(yōu)化(1)死、活細(xì)菌的EMA用量優(yōu)化:黑暗中，分別取1 mL番茄潰瘍病菌的活菌和死菌懸液(1．0×107CFU/mL)，避光加入不同終濃度的EMA，避光室溫靜置5 min，將離心管置于冰上，打開管蓋，距離650 W鹵鎢燈15 cm，持續(xù)曝光8 min［8－9］，EMA激活。

(2)EMA滲透處理死、活混合菌懸液:將5．0× 106CFU的死菌分別與5×108、2．5×108、5×107、2．5×107、5×106、2．5×106、5×105、2．5×105、5× 104、2．5×104、5×103CFU的活菌混合，形成相應(yīng)的死、活菌混懸液，將優(yōu)化出的EMA測(cè)定濃度分別按1．2．5(1)的條件進(jìn)行處理。

1．2．6 EMA-qPCR法和平板計(jì)數(shù)法比較不同溫度處理后番茄潰瘍病菌的存活情況取1 mL濃度為1．0×107CFU/mL的新鮮番茄潰瘍病菌活菌懸液，10 000 r/min離心5 min，然后加1 mL的超純水混勻，分別進(jìn)行－20℃冷凍、4℃冷藏和20℃常溫各處理24、48和72 h，避光添加EMA，使終濃度為3．0 μg/mL，按1．2．5(1)的條件進(jìn)行處理，提取模板DNA，進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。取對(duì)應(yīng)的菌液涂板，28℃培養(yǎng)48～72 h計(jì)數(shù)。

1．2．7 EMA-qPCR檢測(cè)方法的假陽性驗(yàn)證按1．2．1制備的濃度為107、106、105CFU/mL的番茄潰瘍病菌死菌溶液，比較常規(guī)qPCR法、EMA-qPCR法和平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)對(duì)滅活死菌的檢測(cè)差異，驗(yàn)證EMA-qPCR方法檢測(cè)的假陽性。

1．2．8 番茄種子樣品中番茄潰瘍病菌的EMA-qPCR擴(kuò)增將重慶、四川等地采集的11份疑似番茄潰瘍病癥狀的種子去皮，無菌操作取0．1 g種子，充分吹打攪拌，分別添加無菌Milli-Q水800 μl靜置2 h，取上層液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)(保留部分上層液經(jīng)6 h富集培養(yǎng)備用)。沒有富集培養(yǎng)的上層液加入終濃度為4．0 μg/mL的EMA(比純菌條件下稍高)，以相應(yīng)的上層液熱致死處理后再加入EMA為對(duì)照。按1．2．5(1)的條件進(jìn)行EMA靜置曝光處理。

1．2．9 數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS19．0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0．05表示具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2．1 熒光定量PCR靈敏度

當(dāng)番茄潰瘍病菌濃度降低，Ct值逐漸增大，通過平板計(jì)數(shù)的菌濃度為1×100CFU/mL時(shí)，熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果為陰性，因此，熒光定量PCR檢測(cè)靈敏度為1×101CFU/mL(圖1)。

2．2 抑制純培養(yǎng)死菌DNA擴(kuò)增的最適EMA濃度

對(duì)死菌的EMA-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，添加EMA的各組Ct值與未添加EMA的對(duì)照組相比均顯著增加(P＜0．05)，當(dāng)EMA終濃度≥2．0 μg/mL時(shí)，死菌的PCR擴(kuò)增被徹底抑制(圖2A)。低濃度的EMA(≤10 μg/mL)對(duì)活菌PCR擴(kuò)增抑制不顯著(P＞0．05)。但是，當(dāng)EMA≥20 μg/mL時(shí)，可顯著抑制活菌的PCR擴(kuò)增(P＜0．05)(圖2B)?？梢?，抑制死菌DNA擴(kuò)增的最低EMA濃度(2．0 μg/mL)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于影響活菌DNA擴(kuò)增的最小EMA濃度(20 μg/mL)。因此，使用終濃度為3．0 μg/mL的EMA作為純菌培養(yǎng)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最佳濃度。

圖1 熒光定量PCR檢測(cè)番茄潰瘍病菌的靈敏度Fig．1The detection limit of qPCR for CMM

圖2 番茄潰瘍病菌EMA-qPCR檢測(cè)體系中最適EMA濃度Fig．2Optimization of the EMA concentration in EMA-qPCR

2．3 死活菌混合體系中EMA-qPCR選擇性擴(kuò)增活菌

用5．0×106CFU的死菌與不同數(shù)目的活菌混勻后，加入EMA(終濃度3．0 μg/mL)。發(fā)現(xiàn)死菌DNA的擴(kuò)增被徹底抑制，隨著活菌數(shù)目降低，Ct值逐漸增加，檢測(cè)最低限度達(dá)到1．0×101(Ct為34．03)個(gè)活菌(圖3A)。在活菌為1．0×101～1．0× 105CFU內(nèi)，其CFU數(shù)與Ct值呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為R2=0．987(圖3B)。此時(shí)，以Ct值對(duì)qPCR中活菌CFU數(shù)可進(jìn)行快速定量測(cè)定。

2．4 EMA-qPCR檢測(cè)不同溫度處理后番茄潰瘍病菌的存活情況

在－20、4和20℃3個(gè)常規(guī)溫度分別保存24、48和72 h，EMA-qPCR測(cè)定番茄潰瘍病菌的存活情況并與平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法進(jìn)行比較。結(jié)果表明，當(dāng)1．0×107CFU的活菌經(jīng)－20℃冷凍處理72 h后，通過EMA-qPCR檢測(cè)活菌數(shù)為4．1×105CFU，平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法檢測(cè)活菌數(shù)為4．5×103CFU，2種結(jié)果顯著差異(P＜0．05)，顯示番茄潰瘍病菌低溫處理會(huì)部分死亡。4℃冷藏和20℃常溫放置72 h后，2種方法的活菌測(cè)定結(jié)果無顯著差異(P＞0．05)，且接近對(duì)照活菌數(shù)，表明待檢樣品可在4和20℃短時(shí)間保存(表1)。

圖3 EMA-qPCR擴(kuò)增死活細(xì)胞混合體系Fig．3The amplication of mixed bacteria by EMA-qPCR

表1 EMA-qPCR法和平板計(jì)數(shù)法比較不同溫度處理后番茄潰瘍病菌的存活Table 1Use of EMA-qPCR method to determine CtCMM compared with the method of plate counting

2．5 EMA-qPCR檢測(cè)方法的假陽性驗(yàn)證

從表2可知，除了常規(guī)qPCR法測(cè)定到存在番茄潰瘍病菌外，平板計(jì)數(shù)法和EMA-qPCR法的測(cè)定結(jié)果皆為陰性。表明番茄潰瘍病死菌DNA在短時(shí)間內(nèi)也可作為PCR擴(kuò)增的模板，常規(guī)qPCR法不能有效區(qū)分番茄潰瘍病死活菌。而EMA-qPCR法只以活菌DNA為測(cè)定靶標(biāo)，不會(huì)擴(kuò)增死菌DNA，沒有出現(xiàn)假陽性結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)利用平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法進(jìn)一步證明了EMA-qPCR法的可靠性。

2．6 EMA-qPCR檢測(cè)疑似番茄潰瘍病種子樣品

對(duì)重慶、四川等地采集的11份疑似番茄潰瘍病種子樣品(浸泡液未經(jīng)富集培養(yǎng))進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照EMA-qPCR測(cè)定結(jié)果均為陰性，說明種子樣品中番茄潰瘍病死菌DNA的擴(kuò)增被完全抑制。3份來自重慶(03)、福建(06)和江西(08)的樣品EMA-qPCR測(cè)定結(jié)果為陰性，與平板培養(yǎng)結(jié)果一致，富集后的3份樣品EMA-qPCR檢測(cè)結(jié)果還是陰性(未列出數(shù)據(jù))，而qPCR檢測(cè)結(jié)果為陽性。表明EMA-qPCR法可以代替平板培養(yǎng)法快速檢驗(yàn)番茄潰瘍病種子。

表2 常規(guī)qPCR方法、EMA-qPCR方法和平板計(jì)數(shù)法測(cè)定滅活番茄潰瘍病菌數(shù)Table 2Comparison of bacterial counts determined by EMA-qPCR and plate counting methods

表3 番茄實(shí)際樣品的檢測(cè)Table 3Detection of tomato samples

3 討論

普通PCR技術(shù)可以快速鑒定細(xì)菌，但不能區(qū)分細(xì)菌的死活。由于EMA作用具有選擇性［8－9］，它只能進(jìn)入細(xì)胞壁(膜)不完整的死細(xì)胞內(nèi)，不能進(jìn)入細(xì)胞壁(膜)完整的活細(xì)胞。因此，將EMA與qPCR方法相結(jié)合，能快速、準(zhǔn)確地區(qū)分實(shí)際樣品中的死活菌，有效降低傳統(tǒng)PCR檢測(cè)的假陽性，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食源致病微生物和臨床醫(yī)學(xué)的檢測(cè)中［10－13］，但在植物病原菌的檢測(cè)上報(bào)道極少［5，14］。

當(dāng)EMA終濃度≥2．0 μg/mL時(shí)，1．0×107CFU/mL濃度死菌的DNA擴(kuò)增被完全抑制。死活菌混合實(shí)驗(yàn)表明，檢測(cè)最低限度達(dá)到1．0×101個(gè)活菌，在活菌數(shù)為1．0×101～1．0×105CFU內(nèi)，其CFU數(shù)與Ct值呈線性相關(guān)。此時(shí)，以Ct值對(duì)qPCR中活菌CFU數(shù)可進(jìn)行快速定量測(cè)定。

活菌經(jīng)過－20℃保存72 h后，EMA-qPCR法檢出的活菌數(shù)高于比平板計(jì)數(shù)法，原因可能是低溫短期處理后的死亡菌體仍能保持細(xì)胞壁(膜)完整，使EMA染料無法滲透進(jìn)入［15－16］。4和20℃保存72 h，2種方法的活菌檢測(cè)結(jié)果一致，且接近對(duì)照活菌數(shù)，但EMA-qPCR法耗時(shí)更短，大大節(jié)約了測(cè)定時(shí)間。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，番茄潰瘍病待檢樣品可在4℃冷藏和20℃常溫短期保存，不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果，但不能在－20℃冷凍短期保存。

目前，EMA結(jié)合PCR技術(shù)檢測(cè)實(shí)際樣品中的病原菌報(bào)道極少［14］。EMA-qPCR檢測(cè)疑似番茄潰瘍病種子樣品時(shí)，因?yàn)榉逊N子中未經(jīng)富集培養(yǎng)的浸泡液細(xì)菌總濃度不會(huì)超過1．0×107CFU/mL，同時(shí)番茄種子中的非靶標(biāo)死菌可能會(huì)消耗一部分EMA，因此選擇EMA濃度為4．0 μg/mL。結(jié)果表明，11份種子對(duì)照樣品的EMA-qPCR檢測(cè)結(jié)果都是陰性，說明EMA在番茄種子檢測(cè)中抑制潰瘍病菌的效果比較理想。其中3份樣品的EMA-qPCR測(cè)定結(jié)果與qPCR測(cè)定結(jié)果不同，與平板培養(yǎng)結(jié)果相同，表明EMA-qPCR方法比qPCR法更能克服假陽性的出現(xiàn)，準(zhǔn)確反映實(shí)際樣品的帶菌情況，并且比平板培養(yǎng)法檢測(cè)時(shí)間更短。

有時(shí)，種子中存在的活菌數(shù)可能非常少，低于qPCR的最低檢測(cè)下限，這樣將會(huì)出現(xiàn)EMA-qPCR檢測(cè)假陰性結(jié)果。因此當(dāng)未經(jīng)富集培養(yǎng)的浸泡液檢測(cè)結(jié)果為陰性時(shí)，必須通過富集培養(yǎng)后再進(jìn)行EMA-qPCR檢測(cè)，才能確定實(shí)際樣品中是否有活菌存在。

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(責(zé)任編輯 李潔)

Study on Rapid Detecting of Live Clavibacter michiganensis subsp．michiganensis by EMA-qPCR

ZHOU Da-xiang1，2，XIONG Shu3*
(1．College of Life Science and Engineering，Chongqing Three Gorges University，Chonqqing 404100，China;2．College of Life Science，Chongqing University，Chongqing Key Lab of Genetic Function and Regulation，Chongqing 400030，China;3．Department of Basic Medicine，Chongqing Three Gorges Medical College，Chongqing 404120，China)

A novel method to rapidly detect only viable cells of Clavibacter michiganensis subsp．michiganensis(CMM)was established by using the EMA-qPCR．The Pat-1 was used as the target gene for qPCR detection of CMM．Samples were treated with EMA prior to DNA extraction．DNA was then amplified by qPCR to detect only viable CMM cells．The sensitivity of qPCR detection was 1．0×101CFU/mL．2．0 μg/mL EMA could completely inhibit the PCR amplification of DNA derived from dead cells with the concentration of 1．0×107CFU/mL，but without inhibition to viable cells．A standard curve was generated relating the number of genomic targets per PCR to the Ctvalues of the EMA-qPCR．A linear range of DNA amplification was observed from 1．0×101-1．0×105genomic targets per PCR．EMA-qPCR method was used to evaluate the survival rate of CMM treated with different temperatures for a short time，compared with the method of plate count．The results indicate that samples can be stored for a short time under 4 and 20℃The data of EMA-qPCR detection on tomato seed samples indicated that 4．0μg/mL EMA could successfully inhibit PCR amplification of DNA from dead bacteria in the samples．The EMA-qPCR method established in this work can effectively avoid false positive results of CMM detection．

Clavibacter michiganensis subsp．michiganensis;Ethidium monoazide bromide;Real-time PCR

Q93-33

A

1001－4829(2017)1－0099－06

10．16213/j．cnki．scjas．2017．1．018

2016－02－16

重慶市自然科學(xué)基金(cstc2016jcyjA2132);重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(KJ1502601);重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校科研苗圃工程項(xiàng)目(2014mpxz4)

周大祥(1979－)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸餀z測(cè)新技術(shù);*為通訊作者:熊書(1987－)，女，講師，碩士，研究方向?yàn)槲⑸餀z測(cè)新技術(shù)，Tel:13594772168，E-mail: dqzhou79@163．com。