譚翰清，程潔萍，譚海芳，朱穎梅，林 鳳，梁曉晴，陳 捷，麥 煒

2014—2016年廣東省肇慶市人感染H7N9禽流感病毒基因組特征分析

譚翰清1，程潔萍1，譚海芳1，朱穎梅1，林 鳳1，梁曉晴2，陳 捷2，麥 煒1

目的 了解廣東省肇慶市2014-2016年人感染H7N9禽流感病毒基因進(jìn)化特征。方法 對肇慶市17例H7N9患者咽拭核酸直接進(jìn)行8節(jié)段基因序列擴(kuò)增與測定，用BioEdit5.0、MEGA6.0進(jìn)行同源性和重要氨基酸位點(diǎn)分析，采用Neighbor-Joining法構(gòu)建進(jìn)化樹，參比序列從GenBank下載。結(jié)果 7份H7N9病例標(biāo)本獲得8節(jié)段全基因序列，HA與A/chicken/Dongguan/695/2014(H7N9)相似度最高，NA與A/chicken/Dongguan/1075/2014(H7N9)相似度最高；內(nèi)部基因與2013—2014年廣東東莞、深圳禽源H7N9及H9N2相似度較高。HA和NA基因與廣東省東莞、廣州、深圳等地市的H7N9序列同處于珠三角進(jìn)化分支，與安徽、浙江、江蘇等長三角分支的序列相似性低。HA蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生G186V、Q226L 變異，裂解位點(diǎn)序列均為PEIPKGR↓GLF，含有2個(gè)堿性氨基酸；M2蛋白上發(fā)現(xiàn)耐藥位點(diǎn)S31N，PB2蛋白上發(fā)現(xiàn) E627K突變，NA蛋白上未發(fā)現(xiàn)耐神經(jīng)氨酸酶的位點(diǎn)變異。結(jié)論 肇慶市人感染H7N9病毒株可能來源于2013—2014年廣東省珠三角地區(qū)禽源H7N9和H9N2，G186V、Q226L和E627K位點(diǎn)變異增強(qiáng)了對人的易感性。

人感染H7N9禽流感病毒；血凝素基因；神經(jīng)氨酸酶基因；序列分析

甲型流感病毒屬于正黏病毒科，可感染人和禽鳥類、豬、馬等多種動(dòng)物；其基因組為單負(fù)鏈分節(jié)段的RNA，不同宿主來源的病毒的基因組易重組產(chǎn)生新的亞型[1]；根據(jù)血凝素(Hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨基酸酶(Neuraminidase，NA)抗原分為不同的亞型，目前已發(fā)現(xiàn)18種HA、11種NA[2-4]。當(dāng)流感病毒基因變異突破了物種的適應(yīng)性，并對人具有明顯選擇優(yōu)勢時(shí)，可對人類產(chǎn)生嚴(yán)重性疾病或?qū)е氯祟惲鞲写罅餍衃5]。自1997年首次發(fā)現(xiàn)可感染人的H5N1禽流感以來，還發(fā)現(xiàn)H7N7、H9N2等亞型[6-7]。2013年2月上海報(bào)告了全球首個(gè)H7N9禽流感新亞型感染病例，緊接著在蘇、浙、徽等地相繼報(bào)告類似病例，并迅速在我國大部分省份蔓延，其導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床癥狀和高病死率，引起了全球公共衛(wèi)生的關(guān)注[8]。截至2016 年12月31日，我國內(nèi)地累計(jì)報(bào)告H7N9 確診病例889例(死亡321例)，廣東省累計(jì)報(bào)告211例(死亡82例)，肇慶市(2014年1月報(bào)告首例)累計(jì)報(bào)告17例(死亡5例)。本研究對2014-2016年從廣東省肇慶市人感染H7N9禽流感病例標(biāo)本中提取到的毒株進(jìn)行序列分析，掌握其基因進(jìn)化和關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)變異特征，為科學(xué)防控人感染H7N9禽流感疫情提供病原學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 基于肇慶市國家級流感監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，收集2014-2016年流感樣病例和不明原因肺炎病例咽拭標(biāo)本，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑(上海之江生物科技有限公司)進(jìn)行H7N9檢測，共發(fā)現(xiàn)17例人感染H7N9病例，樣本經(jīng)國家疾病預(yù)防控制中心和廣東省流感參比實(shí)驗(yàn)室復(fù)核確認(rèn)，置-75 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑與儀器 MagMAXTM-96 Viral RNA Isolation Kit(Life Technologies，貨號(hào)：AM1836)；PathAmpTMFluA Reagents(Life Technologies ，貨號(hào)：4401512)；ExoSAP-IT試劑盒(USB，貨號(hào)：78201)；Takara PCR Kit(Takara，貨號(hào)：DR011)；8個(gè)節(jié)段基因擴(kuò)增所用的22對引物參考文獻(xiàn)[9]合成。

1.3 基因擴(kuò)增與序列測定 1)取400 μL咽拭標(biāo)本，應(yīng)用MagMAXTM-96 Viral RNA Isolation Kit進(jìn)行病毒RNA提取，最后用20 μL去離子水洗脫；2)應(yīng)用PathAmpTMFluA Reagents進(jìn)行甲型流感8個(gè)節(jié)段序列擴(kuò)增，使用ExoSAP-IT對產(chǎn)物進(jìn)行快速純化與回收；3)分別應(yīng)用22對引物進(jìn)行H7N9病毒8個(gè)節(jié)段PCR擴(kuò)增；4)PCR產(chǎn)物電泳、純化后在ABI3700測序儀上進(jìn)行雙向序列測定。具體操作參照試劑盒說明書和參考文獻(xiàn)[9-10]。

1.4 同源性與進(jìn)化樹分析 利用DNAStar5.0的SeqMan程序進(jìn)行序列拼接，采用BioEdit5.0、NCBI的BLAST進(jìn)行核苷酸同源性比對，應(yīng)用MEGA6.0構(gòu)建HA、NA基因進(jìn)化發(fā)生樹(Neighbor Joining法，bootstrap = 1 000)和關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析[11]。參比序列從GenBank下載，HA和NA序列主要包括了上海、浙江、安徽、江蘇、廣東等地的病人、環(huán)境和禽源H7N9序列44條，其中2016年2條、2015年5條、2014年12條、2013年25條序列；此外，還包括了2005-2011年江西、浙江等地的4條H7N3序列，2005-2012年韓國、江西等地的6條H7N7序列，2008-2011年韓國、西班牙的H7N9序列3條，2005-2006年廣東、江西等地的5條H11N9序列。

2 結(jié) 果

2.1 疫情概括 2014-2016年肇慶市共發(fā)現(xiàn)17例H7N9病例，重癥11例(死亡5例)、輕癥6例(無死亡)；發(fā)病年齡4-78歲，男女比11∶6；分布在懷集縣、四會(huì)市、鼎湖區(qū)；首例于2014年1月30日報(bào)告，末例于2016年12月28日報(bào)告，其中2014年10例、2015年4例、2016年3例，集中分布在每年12月至次年2月發(fā)?。徊±?和3為家庭聚集病例，病例16有病死禽類接觸史；對病例樣本核酸直接進(jìn)行擴(kuò)增和測序，7例樣本獲得8個(gè)節(jié)段全序列，分別編號(hào)為ZQ01～07(表1)。

2.2 同源性分析結(jié)果 7份毒株的HA核苷酸同源性98.3%～100.0%，與A/chicken/Dongguan/695/2014(H7N9)相似度較高(98.3%～99.8%)；7份毒株的NA核苷酸同源性99.0%～99.9%，與A/chicken/Dongguan/1075/2014(H7N9)相似度較高(99.1%～99.9%)。7份毒株的PB2、PB1、PA、NP、MP、NS核苷酸同源性分別為94.1%～100.0%、95.5%～99.8%、95.7%～100.0%、94.1%～100.0%、96.4%～99.9%、95.4%～100.0%，PB2、NP、M與2013-2014年廣東東莞的禽源H7N9相應(yīng)基因相似度較高(95.1%～100.0%)，PB1、PA、NS與2013-2014年廣東東莞、深圳禽源H9N2相應(yīng)基因相似度較高(96.2%～99.8%)(表2)。

表1 2014-2016年肇慶市人感染H7N9病例信息概況

Tab.1 Information profile for cases of human infection with avian influenza A (H7N9) virus in Zhaoqing, China, 2014-2016

病例性別年齡地區(qū)發(fā)病日期診斷日期病例分類愈后發(fā)病前10d內(nèi)是否與疑似或確診病例接觸過是否接觸過病、死禽類呼吸道樣本實(shí)時(shí)熒光PCR檢測的Ct值直接測序結(jié)果1男28懷集縣2014/1/192014/1/30重癥治愈否否33/2男5懷集縣2014/1/282014/2/1輕癥治愈否否21ZQ013女4懷集縣2014/1/262014/2/4輕癥治愈是否22ZQ024女5懷集縣2014/1/312014/2/5輕癥治愈否否32/5男42懷集縣2014/1/262014/2/5重癥治愈否否34/6男62懷集縣2014/2/12014/2/7重癥治愈否否33/7男49懷集縣2014/1/272014/2/7重癥治愈否否33/8男11懷集縣2014/2/42014/2/9輕癥治愈否否21ZQ039男8懷集縣2014/2/62014/2/12輕癥治愈否否23ZQ0410女45四會(huì)市2014/2/132014/2/21重癥死亡否否34/11男54四會(huì)市2014/12/252015/1/7重癥死亡否否20ZQ0512男5四會(huì)市2015/1/192015/1/23輕癥治愈否否22ZQ0613男59四會(huì)市2015/2/52015/2/23重癥死亡否否35/14男78四會(huì)市2015/2/182015/2/26重癥治愈否否34/15女76四會(huì)市2016/2/92016/2/16重癥治愈否否23ZQ0716女45懷集縣2016/12/172016/12/23重癥死亡否是33/17女50鼎湖區(qū)2016/12/212016/12/28重癥死亡否否32/

注：“/”表示未成功獲得序列信息

表2 2014-2016年肇慶市人感染H7N9各基因片段相似度分析結(jié)果

Tab.2 Nucleotide identity and similarity analysis of avian influenza A(H7N9) virus in Zhaoqing, China, 2014-2016

基因節(jié)段Genefragment參考毒株Referencestrain序列相似度(%)SimilatiryZQ01ZQ02ZQ03ZQ04ZQ05ZQ06ZQ07HAA/chicken/Dongguan/695/2014(H7N9)99.799.899.899.898.998.998.3NAA/chicken/Dongguan/1075/2014(H7N9)99.999.999.799.699.299.199.1PB2A/chicken/Dongguan/3418/2013(H7N9)99.999.999.399.195.496.695.5PB1A/chicken/Shenzhen/515/2013(H9N2)99.799.899.796.396.299.297.2PAA/chicken/Shenzhen/1047/2013(H9N2)98.298.398.398.499.696.497.0NPA/silkiechicken/Dongguan/3049/2013(H7N9)99.899.899.899.995.595.895.1MPA/chicken/Dongguan/169/2014(H7N9)99.699.510099.897.599.596.6NSA/chicken/Guangdong/SIC28/2014(H9N2)96.496.496.296.499.599.098.6

2.3 HA與NA基因進(jìn)化特征分析 目前分析我國發(fā)現(xiàn)的H7N9病毒的HA和NA基因序列，在進(jìn)化樹上明顯的分為兩大分支，一支是以廣東珠三角地區(qū)為代表的珠三角分支，一支是以上海、浙江為代表的長三角分支[11-12]。本文中研究的這7例從肇慶人感染H7N9病例分離的病毒HA和NA基因進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，ZQ01-07病毒的HA和NA基因在進(jìn)化樹上與廣東省其他地市，如東莞、廣州、深圳等地的禽、市場環(huán)境及人中分離的H7N9病毒序列相似性高，位于同一分支——珠三角分支；而與在進(jìn)化樹上位于長三角分支的序列，如安徽、浙江、江蘇等地分離的H7N9病毒基因序列相似性低。其中ZQ01-07序列在進(jìn)化樹中又集中在一簇，與廣東東莞雞中分離的H7N9病毒相似性最高(圖1，2)。

圖1 2014-2016年肇慶市人感染H7N9病毒株HA基因進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of the HA gene of human infection with avian influenza A (H7N9) virus in Zhaoqing, China, 2014-2016

圖2 2014-2016年肇慶市人感染H7N9病毒株NA基因進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the NA gene of human infection with avian influenza A (H7N9) virus in Zhaoqing, China, 2014-2016

2.4 重要氨基酸位點(diǎn)分子特征 以H3N2(A/Aichi/2/1968)氨基酸序列為基準(zhǔn)對H7N9的HA基因編碼的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行分析[13]，并以A/Guangdong/6/2013(H7N9)HA氨基酸序列為參照，ZQ01-07HA蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生G186V、Q226L變異；HA蛋白裂解位點(diǎn)序列均為PEIPKGR↓GLF，含有2個(gè)堿性氨基酸(表3)。HA蛋白上第30、46、249、421、493位氨基酸上的糖基化位點(diǎn)分別為NGT、NAT、NDT、NWT、NNT，未發(fā)生糖基化位點(diǎn)缺失。NA蛋白柄部發(fā)生了69-73位的“QISNT”氨基酸刪除；NA蛋白上分別在42、52、63、66、87、147、202上有7個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)，分別表現(xiàn)為NCS、NTS、NET、NIT、NLT、NGT、NAS；未發(fā)現(xiàn)NA蛋白對達(dá)菲耐藥的H274Y、R292K、N294S、E119V/G位點(diǎn)變異，未發(fā)現(xiàn)對扎那米韋耐藥的E119A/D/G、Q136K/ L、I222R/K、D151A /E /G /V位點(diǎn)突變，也未發(fā)現(xiàn)對帕拉米韋耐藥的R292K突變。M蛋白出現(xiàn)了對烷胺類耐藥的S31N的突變；PB2蛋白均發(fā)生了E627K突變，提示對哺乳動(dòng)物細(xì)胞親和力增強(qiáng)。

表3 HA蛋白裂解位點(diǎn)和受體結(jié)合關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)

Tab.3 Amino acid sequence at the cleavage site and receptor-binding region of the HA protein

序列Sequence裂解位點(diǎn)Cleavagesite受體結(jié)合位點(diǎn)Receptor-bindingsite110158160186196224226228ZQ01_HAPEIPKGR↓GLFRTNVGNLGZQ02_HAPEIPKGR↓GLFRTNVGNLGZQ03_HAPEIPKGR↓GLFRTNVGNLGZQ04_HAPEIPKGR↓GLFRTNVGNLGZQ05_HAPEIPKGR↓GLFRTNVGNLGZQ06_HAPEIPKGR↓GLFRTNVGNLGZQ07_HAPEIPKGR↓GLFRTNVGNLGA/Guangdong/6/2013H7N9PEIPKGR↓GLFRTNVGNLG

3 討 論

獲取流感病毒基因組序列的傳統(tǒng)方法常用Sanger法[14]，近年來，高通量測序技術(shù)迅速發(fā)展和應(yīng)用，可對核酸濃度較低的H7N9樣本檢測，并在短時(shí)間內(nèi)快速獲得大量有效數(shù)據(jù)[15]。本研究應(yīng)用PathAmpTMFluA Reagents Kit對咽拭樣本核酸直接擴(kuò)增和Sanger法測序，核酸濃度較高的7份樣本成功獲得8個(gè)節(jié)段基因全序列。研究表明新型H7N9禽流感病毒為三源重組病毒，HA和NA最初來自于2011年浙江鴨中流行的H7N3和韓國野鳥中流行的H7N9，內(nèi)部基因來自于兩個(gè)不同源的H9N2[8,16]。在H7N9傳播與進(jìn)化過程中，H9N2為內(nèi)部基因的重排提供了基本的骨架[17]，并與鄰近區(qū)域或本地的禽源H7N9病毒發(fā)生持續(xù)性重排，進(jìn)化呈現(xiàn)區(qū)域差異[4]。本研究中的外部基因進(jìn)化樹結(jié)果顯示，ZQ01-07病毒的HA和NA基因均在珠三角分支上進(jìn)化，與廣東東莞雞中分離的H7N9病毒相似性最高，與長三角分支上安徽、浙江、江蘇等地分離的H7N9病毒基因序列相似性低。推測肇慶的該7例病例被同樣的傳染源傳染，可能是通過禽類貿(mào)易被廣東東莞的雞感染，也可能是和廣東東莞雞被同樣的傳染源傳染。

肇慶市是廣東省禽類養(yǎng)殖和消費(fèi)大戶，首例H7N9病例于2014年1月在懷集縣發(fā)現(xiàn)時(shí)，當(dāng)?shù)鼗钋菔袌霏h(huán)境標(biāo)本H7陽性率高達(dá)65. 0%，是人感染H7N9的高危場所。在之后2周的強(qiáng)化和應(yīng)急監(jiān)測中，該縣區(qū)域共發(fā)現(xiàn)9例H7N9病例。其中病例3為病例2的密接者，兩者共同生活并接觸家中飼養(yǎng)的雞，而其家庭環(huán)境及雞樣本檢測出H7病毒，流行病學(xué)調(diào)查判斷為家庭聚集疫情[18]。HA蛋白關(guān)鍵位點(diǎn)的變異與流感致病性、傳播能力密切相關(guān)[19-21]。研究表明，當(dāng)HA受體結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生Q226L和G186V突變時(shí)，H7N9病毒對SAα-2，6Gal 的結(jié)合力增強(qiáng)，導(dǎo)致人感染概率大大增加[8,22]；當(dāng)HA蛋白裂解位點(diǎn)處有4個(gè)以上連續(xù)的堿性氨基酸時(shí)，病毒株具有高致病性[23]；當(dāng)HA蛋白出現(xiàn)158D/224K/226L、110Y/160A/226L/228S、196R/226L/228S三種突變組合中的一種，就能使H5N1禽流感病毒在上呼吸道有效增殖并通過飛沫在雪貂間傳播[24]。ZQ01-07的HA受體結(jié)合位點(diǎn)均發(fā)生Q226L和G186V突變，HA蛋白裂解位點(diǎn)處氨基酸序列與廣東、浙江、安徽等[9,25-26]地序列一樣，均為PEIPKGR↓GLF，含有2個(gè)堿性氨基酸，對禽類是低致病性的，也未發(fā)現(xiàn)能使禽流感病毒在上呼吸道有效增殖并通過飛沫傳播突變組合，提示該病毒尚未獲得飛沫傳播的充分條件，人傳人可能性較小。ZQ01-02分別為病例2和3的毒株序列，HA序列分析結(jié)果進(jìn)一步證明了病例2和3為共同暴露的家庭聚集疫情，而非人傳人導(dǎo)致的。

2016年12月以來江、浙、粵等地人感染H7N9病例數(shù)迅猛增加，報(bào)告的病例數(shù)和疫情波及范圍高于前幾年同期水平，疫情形勢嚴(yán)峻[27]。2017年1月，廣東省疾控中心對2例人感染H7N9病例分離到的病毒株中發(fā)現(xiàn)血凝素鏈接肽位置發(fā)生了基因插入性突變，提示該病毒突變?yōu)閷η莞咧虏⌒缘牟《荆瑱z測結(jié)果已經(jīng)國家流感中心復(fù)核確認(rèn)[28]。值得注意的是，當(dāng)中1例為本研究病例16的妹妹，43歲，曾照顧病例16，屬于密切接觸者，在其醫(yī)學(xué)觀察期間的2016年12月30日出現(xiàn)發(fā)熱癥狀，即到廣州市第八人民醫(yī)院就診，經(jīng)廣東省疾控中心確診并發(fā)現(xiàn)其血凝素鏈接肽位置發(fā)生了基因插入性突變。而病例16曾接觸病死禽類，遺憾的是病例16及其家禽環(huán)境樣本的H7核酸濃度較弱，其血凝素鏈接肽位置是否發(fā)生了基因插入性突變，有待進(jìn)一步研究。

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收稿日期：2017-01-25 編輯：林丹

Genomic characterization of avian influenza A(H7N9) virus in Zhaoqing, China, 2014-2016

TAN Han-qing1, CHENG Jie-ping1, TAN Hai-fang1, ZHU Ying-mei1, LIN Feng1, LIANG Xiao-qing2, CHEN Jie2, MAI Wei1

(1.ZhaoqingPrefectureCenterforDiseaseControlandPrevention,Zhaoqing526060,China;2.TheFirstPeople’sHospitalofZhaoqing,Zhaoqing526000,China)

We analyzed genetic evolution characteristics of avian influenza A (H7N9) virus isolated in Zhaoqing, China, 2014-2016. Nucleic acid were extracted and sequenced from 17 samples of H7N9 positive cases in Zhaoqing. Genetic characteristics of homology and important amino acid sites were analyzed by using BioEdit5.0 and MEGA6.0. The evolutionary trees were constructed by Neighbor-Joining and the referenced sequences were downloaded from GenBank. Eight nucleic acid fragments from 7 strains of H7N9 viruses were successfully generated. The highest homology was found in HA gene with A/chicken/Dongguan/695/2014(H7N9), and NA gene with A/chicken/Dongguan/1075/2014(H7N9). The internal genes were high homology with avian H7N9 and H9N2 virus from Dongguan and Shenzhen in Guangdong, China. The HA and NA genes were directly evolved in the Pearl River Delta evolution branch with the H7N9 sequences from the cities of Dongguan, Guangzhou and Shenzhen, while the sequences from the provinces of Anhui, Zhejiang, and Jiangsu were in the Yangtze River Delta evolution branch. There were 2 alkaline amino acids in cleavage site of HA, 2 mutations (G186V and Q226L) in the crucial sites related with the receptor of HA protein, 1 mutation (E627K) in PB2 protein, and 1 drug resistance mutation (S31N) in M2 protein. And no evidence of neuraminidase resistance in NA protein was found. In conclusion, the H7N9 virus for human infection in Zhaoqing may originate from avian H7N9 and H9N2 viruses, which circulated in the Pearl River Delta region of Guangdong from 2013 to 2014. The mutations of G186V, Q226L and E627K might be related with high susceptibility to human beings.

human infection with avian influenza A(H7N9) virus; hemagglutinin gene; neuraminidase gene; sequence analysis Funded by the Medical Science and Technology Research Foundation of Guangdong Province (No. A2015573) and the Zhaoqing Science and Technology Innovation Project (No. 2015E1810)

2017-03-20 編輯：林丹

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.03.003

1．廣東省肇慶市疾病預(yù)防控制中心，肇慶 526060； 2．廣東省肇慶市第一人民醫(yī)院，肇慶 526000

Email:tanhaqing2000@163.com

R373.1

A

1002-2694(2017)03-0202-06

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金(No.A2015573)和肇慶市科技創(chuàng)新項(xiàng)目(No.2015E1810)聯(lián)合資助