代燦燦 孫香豐

（青島市動(dòng)物園 山東 青島 266000）

ALV-J p19蛋白細(xì)胞毒性的研究

代燦燦 孫香豐

（青島市動(dòng)物園 山東 青島 266000）

禽白血病(Avian Ieukosis)是一類由禽白血病病毒引起禽類以多腫瘤性疾病為主要特征的統(tǒng)稱[1]。禽白血病(J亞群)對(duì)我國(guó)肉雞養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重危害，但目前對(duì)該病毒致病的分子作用機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)AH109釀酒酵母表達(dá)融合蛋白來(lái)觀察酵母細(xì)胞生長(zhǎng)情況，進(jìn)而分析ALV-J的p19蛋白是否具有細(xì)胞毒性。結(jié)果表明，重組酵母在生長(zhǎng)曲線和斑點(diǎn)試驗(yàn)中表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)抑制，p19蛋白具有細(xì)胞毒性。

20世紀(jì)90年以后，禽白血病J亞群病毒(ALV-J)在在我國(guó)肉雞養(yǎng)殖業(yè)泛濫開來(lái)，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。因該病毒突變率高，防治困難。目前尚無(wú)有效疫苗，嚴(yán)重制約了禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[2，3]。

1 ALV的分子生物學(xué)特征

ALV屬于反轉(zhuǎn)錄科反轉(zhuǎn)錄屬的單股正鏈線性RNA病毒，基因組全長(zhǎng)7.2kb～7.8kb間。病毒粒子近似球形，呈正20面體對(duì)稱。病毒囊膜是脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，鑲嵌著env基因編碼的gp37跨膜蛋白和gp85表面蛋白[3,4]。本文研究的P19蛋白為ALV gag基因編碼的基質(zhì)蛋白，位于病毒表面且序列高度保守，與病毒囊膜蛋白相連，具有親脂作用，是具有病毒亞群特異性位點(diǎn)的多肽[5]。

2 P19-pGBKT7重組質(zhì)粒的構(gòu)建和表達(dá)

將p19蛋白的編碼基因克隆，5’端引物CCCGGGGAT CCTCTAGAATGGAAGCCGTCA，3’端引物為CTGCA GTTAATAGCAGGATGTGCCAAC。構(gòu)建于pGBKT7真核表達(dá)載體上。經(jīng)測(cè)序和雙酶切鑒定后構(gòu)建正確。

雙酶切 Marker pGBKT7 p19-pGBKT7

圖1 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定圖

圖2 Western Blot鑒定重組質(zhì)粒表達(dá)

利用LiAc/PEG法將重組質(zhì)粒做小規(guī)模轉(zhuǎn)化入AH109釀酒酵母感受態(tài)細(xì)胞中。利用SD/-Trp平板上篩選單菌落出現(xiàn)。挑取單克隆置于SD/-Trp液體培養(yǎng)基中，30℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.4～0.6。4℃離心后洗滌重懸后，加入Cracking buffer裂解，提取表達(dá)蛋白。經(jīng)Western Blot檢測(cè)，myc標(biāo)簽融合蛋白得到正確表達(dá)。

3 重組菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

從已檢測(cè)表達(dá)的重組菌SD/-Trp平板和空載體平板上分別挑取單菌落，對(duì)應(yīng)置于30℃條件下置于SD/-Trp液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。調(diào)整起始OD600值相同。然后分時(shí)進(jìn)行OD600的測(cè)量，與此同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，繪制重組菌生長(zhǎng)曲線。

圖3 OD600吸光度曲線

圖4 酵母細(xì)胞計(jì)數(shù)生長(zhǎng)曲線

4 重組菌的斑點(diǎn)試驗(yàn)

將轉(zhuǎn)化有空載體和重組質(zhì)粒的酵母菌株進(jìn)行斑點(diǎn)試驗(yàn)，將細(xì)胞計(jì)數(shù)后的稀釋液依次接種在SD/-Trp固體瓊脂平板上，30℃培養(yǎng)1～2d進(jìn)行觀察。

圖5 酵母細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)

5 討論

（1）禽白血病是由禽白血病病毒引起的禽類(主要是雞)良性和惡性腫瘤的一類疾病，它包括淋巴細(xì)胞性白血病、成紅細(xì)胞性白血病、成髓細(xì)胞性白血病、骨髓細(xì)胞瘤、血管瘤、內(nèi)皮瘤、腎真性瘤、纖維肉瘤和骨化石癥等。在臨床上感染率很高且危害嚴(yán)重，到目前為止，還沒(méi)有合適的疫苗和有效的藥物加以對(duì)抗，雛雞又易出現(xiàn)免疫耐受，對(duì)疫苗不產(chǎn)生免疫應(yīng)答，故只能被動(dòng)地進(jìn)行預(yù)防[6]。（2）P19是ALV的基質(zhì)蛋白，目前針對(duì)p19的作用機(jī)制、p19與宿主間相互作用的研究鮮見報(bào)道[6]。本實(shí)驗(yàn)中圍繞p19蛋白是否具有細(xì)胞毒性進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)證明。在真核細(xì)胞的選擇上，釀酒酵母AH109細(xì)胞是一種遺傳背景清晰的真核表達(dá)宿主菌，轉(zhuǎn)化效率高。本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷體系來(lái)篩選成功轉(zhuǎn)入攜帶trp1營(yíng)養(yǎng)篩選標(biāo)記的酵母細(xì)胞。轉(zhuǎn)化有pGBKT7重組質(zhì)粒的菌株能在此營(yíng)養(yǎng)缺陷體系中良好生長(zhǎng)。（3）在轉(zhuǎn)化方法上，本實(shí)驗(yàn)采用了LiAc法(完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化法)，經(jīng)LiAc處理的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的酵母細(xì)胞處于感受態(tài)，通過(guò)熱休克處理，在PEG協(xié)助下，將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞，操作較為簡(jiǎn)單且效率高。（4）酵母細(xì)胞生長(zhǎng)周期共分為4個(gè)階段，即遲緩期、對(duì)數(shù)期、平穩(wěn)期和衰亡期，繪制生長(zhǎng)曲線和吸光度曲線呈“S”型。在0～4h內(nèi)，酵母細(xì)胞多處于遲緩期，在4～14h內(nèi)，酵母細(xì)胞多處于平穩(wěn)期；在14h以后酵母細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平穩(wěn)期。（5）構(gòu)建了p19-pGBKT7融合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞后成功誘導(dǎo)表達(dá)。通過(guò)真核細(xì)胞常用的吸光度值、細(xì)胞計(jì)數(shù)和斑點(diǎn)試驗(yàn)，檢測(cè)p19蛋白有無(wú)細(xì)胞毒性。經(jīng)檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入p19-pGBKT7重組質(zhì)粒的酵母細(xì)胞與對(duì)照組有明顯差異，能夠明顯抑制酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)，具有細(xì)胞毒性。斑點(diǎn)試驗(yàn)作為一種簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)便捷的觀察細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，在固體培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)p19-pGBKT7重組質(zhì)粒同樣抑制生長(zhǎng)，表現(xiàn)出較明顯的細(xì)胞毒性。

綜上，通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，p19蛋白具有較顯著的細(xì)胞毒性。這一發(fā)現(xiàn)為今后探究在ALV感染中p19的作用機(jī)理和p19與宿主蛋白相互作用奠定了相應(yīng)基礎(chǔ)。

[1] 于琳琳, 姜艷萍, 王明等.禽白血病病毒J亞群自然感染商品蛋雞致瘤性新特征[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2012, 43(4)∶602-608.

[2] 殷震, 劉景華. 動(dòng)物病毒學(xué)(第2版)[M]. 北京∶ 科學(xué)出版社, 1997∶384-397.

[3] 趙振華, 楊鈺瑩, 成子強(qiáng). 禽白血病[M]. 北京∶ 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2006∶ 16-18.

[4] 郝春麗, 胡梅, 柴建亭. 禽白血病病毒特性的研究進(jìn)展[J]. 上海畜牧獸醫(yī)通訊, 2010,1∶20-21.

[5] 杭柏林, 胡建和, 李杰. 關(guān)于禽白血病防控的幾點(diǎn)建議[J], 現(xiàn)代畜牧獸醫(yī), 2015,3∶22-25.

[6] 陳瑞愛(ài), 何芳, 覃健萍等. 禽白血病流行情況及生物防控措施[A].雞淋巴白血病防控技術(shù)研討會(huì)論文集[C]. 2010∶ 261-262.

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