張?zhí)蚁?吳藝妍 田梓瑩+楊文浩

摘要：豬糞和雞糞是沙門氏菌的主要傳播載體。主要探討了豬糞和雞糞對(duì)土壤中沙門氏菌存活行為的影響，為防控土壤沙門氏菌污染和人畜共患疾病的暴發(fā)提供參考。研究采集了5種南方典型農(nóng)業(yè)土壤，通過(guò)添加豬糞和雞糞2種糞肥，利用室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)，開展了沙門氏菌在土壤中的存活試驗(yàn)，探討其存活影響因素。結(jié)果表明：（1）添加豬糞和雞糞的供試土壤中沙門氏菌濃度隨著時(shí)間變化的趨勢(shì)在培養(yǎng)初期有1個(gè)先升高后逐漸衰亡的過(guò)程。（2）添加豬糞土壤（21.11～45.26 d）中沙門氏菌的存活時(shí)間明顯長(zhǎng)于添加雞糞的土壤（14.33～34.94 d），說(shuō)明豬糞比雞糞更能促進(jìn)沙門氏菌在土壤中的存活。（3） 土壤pH值（r=0.829）、有機(jī)碳含量（r=0.567）、總氮（r=0.466）和鉀含量（r=0429）是影響糞肥添加土壤中沙門氏菌存活的最重要因素。

關(guān)鍵詞：豬糞；雞糞；土壤；沙門氏菌；存活動(dòng)態(tài)

中圖分類號(hào)： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）05-0297-04

近幾十年來(lái)，我國(guó)畜禽集約化養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展，畜禽數(shù)量飛速遞增，在有效解決了人類飲食需求的同時(shí)，糞便的排放量也在增加，帶來(lái)嚴(yán)重的環(huán)境污染[1]。資料顯示，每年全國(guó)畜禽糞便年排放量達(dá)到40 億t，已成為與工業(yè)廢水、生活污水相并列的三大污染源之一[2-3]。目前，大量畜禽糞便沒有得到充分有效的利用，還有很多被隨意排放到自然環(huán)境中，使土壤、水體及大氣等自然環(huán)境受到了嚴(yán)重的污染[2-4]。

畜禽糞便含有大量的病原微生物和寄生蟲卵，畜禽糞便未經(jīng)無(wú)害化處理施入農(nóng)田后，病原微生物可以通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，引發(fā)食源性疾病[5-7]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在世界各國(guó)的細(xì)菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒排列榜首，我國(guó)內(nèi)陸地區(qū)也以沙門氏菌為首位[8]，進(jìn)食被沙門氏菌污染的食品可引起傷寒、腹瀉及腸道炎癥反應(yīng)，甚至死亡[6，9]。牛、 羊、狗和雞等動(dòng)物是沙門氏菌的天然宿主，帶菌動(dòng)物糞便是沙門氏菌污染環(huán)境、食品的主要來(lái)源，人類通過(guò)接觸畜禽糞便和食用污染土壤中的蔬菜水果等間接受到感染[9-10]。據(jù)調(diào)查，沙門氏菌在畜禽糞便和土壤中的存活時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)幾個(gè)月，然后通過(guò)地下水、植物等進(jìn)入食物鏈[11-12]，因此，研究畜禽糞便中沙門氏菌在土壤中的存活對(duì)土壤生物污染能力的評(píng)估和管理對(duì)人類的健康極為重要。目前，對(duì)于沙門氏菌通過(guò)畜禽糞便進(jìn)入土壤后的環(huán)境行為等相關(guān)研究尚處于起步階段，且我國(guó)很少見沙門氏菌在農(nóng)業(yè)與環(huán)境中存活的研究報(bào)道。因此，研究沙門氏菌在糞肥添加土壤中的存活動(dòng)態(tài)對(duì)于沙門氏菌引起的土壤生物污染的評(píng)估、控制、預(yù)防和修復(fù)技術(shù)具有重要意義。

1材料與方法

1.1供試菌株

供試病原菌為革蘭氏陰性沙門氏菌，沙門氏菌抗利福平馴化濃度為120 μg/mL，其最適生長(zhǎng)溫度為 37.0 ℃。-80.0 ℃ 保存的沙門氏菌37.0 ℃培養(yǎng)活化后，與腦心萃取液培養(yǎng)基（添加100 μg/mL利福平）中恒溫振蕩培養(yǎng)（37.0 ℃，250 r/min）12 h 至沙門氏菌達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期初期，無(wú)菌磷酸緩沖液多次離心洗凈沙門氏菌表面的培養(yǎng)基，無(wú)菌水稀釋一定倍數(shù)后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，調(diào)節(jié)菌液濃度至沙門氏菌濃度為 1.0×107 CFU/mL。

1.2供試糞肥

供試糞肥分別為豬糞和雞糞。豬糞和雞糞采集自福建福州閩侯養(yǎng)殖場(chǎng)，豬糞和雞糞均為未經(jīng)堆肥的新鮮糞肥，風(fēng)干研磨過(guò)篩后備用。豬糞和雞糞基本理化性質(zhì)參照南京土壤研究所編的《土壤農(nóng)化分析》進(jìn)行分析，基本理化性質(zhì)見表1。

1.3供試土壤

供試土壤為福建省主要農(nóng)業(yè)土壤，包括水稻土、紅壤、黃壤、紫色土和風(fēng)沙土。每個(gè)土壤均采集了3個(gè)重復(fù)樣品，每個(gè)樣品均為S形多點(diǎn)采集土壤表層土層（0～20 cm）的混合樣，去除植物根系與碎石塊，新鮮樣品采集后用冰袋包裝帶回實(shí)驗(yàn)室馬上過(guò) 2 mm篩，一部分樣品 4 ℃冰箱中保存，加入適當(dāng)比例的豬糞和雞糞，用于接種沙門氏菌進(jìn)行存活試驗(yàn)，同時(shí)測(cè)定添加豬糞和雞糞后土壤的物理化學(xué)性質(zhì)，另一部分風(fēng)干后過(guò) 2 mm篩土樣，用于土壤物理化學(xué)性質(zhì)測(cè)定。土壤理化性質(zhì)參照南京土壤研究所編的《土壤農(nóng)化分析》進(jìn)行分析。豬糞和雞糞添加前后土壤物理化學(xué)性質(zhì)見

沙門氏菌至添加豬糞和雞糞的土壤中，接種土壤中沙門氏菌的最終濃度為106 CFU/g，25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中通過(guò)測(cè)定土壤的質(zhì)量來(lái)調(diào)節(jié)土壤含水量的恒定。試驗(yàn)同時(shí)進(jìn)行3個(gè)平行和空白處理。培養(yǎng) 0、 1、 2、 3、 5、 7、 10、 15、 20、 25、 30 、 35 、 40 、45、55、65 d后，采樣測(cè)定土壤中沙門氏菌活細(xì)胞的濃度：0.1%蛋白胨緩沖液混勻采樣土壤，土壤懸浮液逐級(jí)稀釋到適當(dāng)濃度，涂抹至大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（添加100 μg/mL利福平），37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜后計(jì)數(shù)，計(jì)算出培養(yǎng)不同時(shí)間后土壤中存活沙門氏菌的濃度，該方法的最低檢測(cè)限為100 CFU/g，連續(xù)2次未能在土壤中檢測(cè)出沙門氏菌菌落時(shí)，停止取樣。

1.5統(tǒng)計(jì)方法

不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)的土壤中沙門氏菌的存活濃度均轉(zhuǎn)化為lg（CFU/g），然后通過(guò)Weibull 單指數(shù)模型[13]模擬：

[JZ]lgNt= lgN0-（ t/ δ）p；

式中：Nt為取樣時(shí)土壤中沙門氏菌的濃度，N0為土壤中沙門氏菌接種濃度，t為取樣時(shí)間，δ為尺度參數(shù)，p為弧度參數(shù)（p>1，擬合曲線為凸?fàn)?；p<1，擬合曲線為凹狀）。

采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行相關(guān)分析。圖件制作采用 Origin 8.1軟件。

2結(jié)果與分析

2.1沙門氏菌在土壤中的存活動(dòng)態(tài)

圖1顯示了沙門氏菌在添加豬糞和雞糞土壤中的存活動(dòng)態(tài)隨時(shí)間的變化情況。水稻土、紅壤、黃壤、紫色土和濱海風(fēng)沙土中沙門氏菌隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)存活濃度逐漸降低，但是所有供試土壤中沙門氏菌濃度隨著時(shí)間變化的趨勢(shì)在接種培養(yǎng)初期有1個(gè)先升高后降低的過(guò)程。接種 1 d 后添加豬糞的土壤中沙門氏菌濃度都有小幅度的上升，達(dá)到約3×106 CFU/g，培養(yǎng)2 d后水稻土中的沙門氏菌濃度升高幅度最大，上升至1.5×107 CFU/g，風(fēng)沙土中沙門氏菌的濃度上升至4×106 CFU/g，而紅壤、黃壤和紫色土中的沙門氏菌濃度開始下降，土壤中的沙門氏菌逐步進(jìn)入衰亡期。

水稻土和風(fēng)沙土中的沙門氏菌濃度在培養(yǎng)第3天沒有繼續(xù)上升，而是保持高濃度，接種第5天后土壤中病原菌的濃度分別下降至3.0×106 CFU/g和1.0×106 CFU/g，[JP2]水稻土和風(fēng)沙土中的沙門氏菌開始進(jìn)入緩慢衰亡期。接種后45 d水稻土中沙門氏菌逐步接近最低檢測(cè)限（102 CFU/g），風(fēng)沙土中的沙門氏菌在培養(yǎng)30 d后達(dá)到最低檢測(cè)限。紅壤、黃壤和紫色土中沙門氏菌衰亡較快，均在接種20～25 d后迅速下降至最低檢測(cè)限。與豬糞添加土壤中沙門氏菌的存活行為相比，添加雞糞后所有土壤中沙門氏菌的存活時(shí)間明顯減短（圖2）。[JP]

[JP2]在接種培養(yǎng)初期，土壤中沙門氏菌的濃度也會(huì)經(jīng)歷小幅度上升然后降低的過(guò)程。[JP2]水稻土和風(fēng)沙土中沙門氏菌的存活濃度在培養(yǎng)前2 d分別保持在6×106 CFU/g和4×106 CFU/g，水稻土中沙門氏菌存活時(shí)間最長(zhǎng)，其次是風(fēng)沙土。接種1 d后，黃壤、 紅壤和紫色土中沙門氏菌的濃度上升至2×106 CFU/g，[JP]

[JP2]然后進(jìn)入快速衰亡期，培養(yǎng)15 d后黃壤和紅壤中基本檢測(cè)不到沙門氏菌，培養(yǎng)20 d后紫色土中沙門氏菌達(dá)到最低檢測(cè)限。[JP]

2.2沙門氏菌在土壤中的存活模型

[JP2]將添加豬糞和雞糞土壤中不同培養(yǎng)時(shí)間沙門氏菌的存活濃度均轉(zhuǎn)化為lg （CFU/g），然后通過(guò)Weibull 單指數(shù)模型模擬，方程模擬顯示沙門氏菌在水稻土，紅壤、黃壤、紫色土和濱海風(fēng)沙土中的存活方程決定系數(shù)（r2）范圍為 0.92～0.97，Weibull 單指數(shù)模型能較好地模擬沙門氏菌在施用豬糞和雞糞土壤中的存活動(dòng)態(tài)。由圖3可知，不同土壤δ （尺度參數(shù)）不同，豬糞添加土壤中的δ的范圍為 5.13～11.29，而雞糞添加土壤中δ值均減小，范圍為2.88～9.72，[JP3]簡(jiǎn)單相關(guān)分析結(jié)果表明沙門氏菌存活時(shí)間（td）與δ呈正相關(guān)關(guān)系（r=0742，P<0.01）。[JP]

p為弧度參數(shù)，p>1，擬合曲線為凸?fàn)?，p<1，擬合曲線為凹狀，在添加豬糞和雞糞的土壤中，水稻土、紅壤和風(fēng)沙土中沙門氏菌的擬合曲線為凸?fàn)睿S壤和紫色土的擬合曲線為凹狀（圖4）。

通過(guò)Weibull單指數(shù)模型計(jì)算得出所有添加豬糞土壤中沙門氏菌的存活時(shí)間長(zhǎng)于添加雞糞的土壤（圖5），說(shuō)明豬糞比雞糞更能促進(jìn)沙門氏菌在土壤中的存活，所有土壤中存活時(shí)間最長(zhǎng)的為添加了豬糞的水稻土（45.26 d）；存活時(shí)間最短的土壤為添加雞糞的黃壤，存活時(shí)間僅為14.33 d。沙門氏菌在添加豬糞土壤中的存活時(shí)間順序?yàn)椋核就粒?5.26 d）>風(fēng)

沙土（30.88 d）>紫色土（26.23 d）>紅壤（21.52 d）>黃壤（21.11 d）。沙門氏菌在添加雞糞土壤中的存活時(shí)間順序?yàn)椋核就粒?4.97 d）>風(fēng)沙土（29.31 d）>紫色土（1994 d）>紅壤（15.98 d）>黃壤（14.33 d）（圖5-B）。

2.3沙門氏菌存活與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系

本試驗(yàn)通過(guò)相關(guān)分析對(duì)沙門氏菌存活與土壤性質(zhì)間的關(guān)系進(jìn)行了綜合探討。簡(jiǎn)單相關(guān)分析結(jié)果表明，沙門氏菌的存活時(shí)間與土壤的pH值（r=0.829）、有機(jī)碳（r=0567）和土壤總氮（r=0.466）呈極顯著正相關(guān)，與土壤鉀（r=0.429）含量呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明土壤pH值、有機(jī)碳含量、總氮和鉀含量是影響糞肥添加土壤中沙門氏菌存活的最重要因素。

3結(jié)論與討論

門氏菌存活的影響，同樣的培養(yǎng)溫度和水分條件下，由于施用不同種類有機(jī)肥（豬糞和雞糞），土壤中的沙門氏菌表現(xiàn)出不同的存活動(dòng)態(tài)。試驗(yàn)結(jié)果表明，接種至添加了豬糞和雞糞土壤中的沙門氏菌的濃度在培養(yǎng)初期先升高，然后隨著培養(yǎng)時(shí)間逐漸降低至最低檢測(cè)線，不同的土壤中沙門氏菌濃度升高和衰亡的趨勢(shì)有明顯不同。沙門氏菌存活動(dòng)態(tài)可通過(guò) Weibull 單指數(shù)模型得到較好的模擬，通過(guò)模型計(jì)算得出沙門氏菌在添加豬糞和糞土壤中的存活時(shí)間順序均為：水稻土>風(fēng)沙土>紫色土>紅壤>黃壤，且添加豬糞土壤中沙門氏菌的存活時(shí)間（21.11～4526 d）顯著長(zhǎng)于添加雞糞的土壤（1433～34.94 d），說(shuō)明豬糞比雞糞更能促進(jìn)沙門氏菌在土壤中的存活。研究結(jié)果表明，土壤pH值、有機(jī)碳含量、總氮和鉀含量是影響糞肥添加土壤中沙門氏菌存活的主控因子。大量研究表明，土壤pH值是影響土壤中外源病原菌存活的重要因素，本試驗(yàn)結(jié)果表明施用豬糞和雞糞到土壤中后，大多數(shù)土壤轉(zhuǎn)變?yōu)橹行曰蛘邏A性，且土壤中的有機(jī)質(zhì)和其他養(yǎng)分含量也得到了一定的提升，促進(jìn)了土壤中沙門氏菌的存活。

牛、羊、豬和雞等動(dòng)物是沙門氏菌的天然宿主[8]，我國(guó)是養(yǎng)殖大國(guó)，生豬存欄頭數(shù)占世界總量的 50%，大型養(yǎng)豬場(chǎng)已突破 50萬(wàn)頭，養(yǎng)雞場(chǎng)100萬(wàn)羽，全國(guó)大中型養(yǎng)殖場(chǎng)已高達(dá)4萬(wàn)多家[1]，由于各方面的原因，大部分豬場(chǎng)的豬糞都是未經(jīng)任何處理而在自然環(huán)境中堆積或者直接排放，這給環(huán)境帶來(lái)巨大的影響[3-4，14]，特別是一些人畜共患疾病給人畜健康構(gòu)成巨大的威脅。豬糞和雞糞是沙門氏菌的主要載體[15-16]，大量調(diào)查表明在我國(guó)很多省份的豬糞和雞糞中已經(jīng)檢測(cè)到沙門氏菌[17-18]，如果被沙門氏菌污染的豬糞和雞糞施入土壤，沙門氏菌會(huì)隨著豬糞通過(guò)降雨、灌溉等途徑進(jìn)入土表和地下徑流[16，19]。本試驗(yàn)供試土壤為福建省主要農(nóng)業(yè)土壤，豬糞等有機(jī)肥施用是有機(jī)廢棄物農(nóng)業(yè)資源化利用的主要途徑，沙門氏菌在供試土壤中的存活時(shí)間在20 d以上，特別是沙門氏菌在施用了豬糞的水稻土中的存活時(shí)間長(zhǎng)達(dá)44 d，通過(guò)施肥進(jìn)入水稻土的沙門氏菌在土壤中的蓄積時(shí)間較長(zhǎng)，且本試驗(yàn)中檢測(cè)的水稻土、紅壤、黃壤、紫色土、潮土和濱海風(fēng)沙土中沙門氏菌的存活時(shí)間均在15 d以上，說(shuō)明本試驗(yàn)中所用到的主要土壤在施用豬糞和雞糞后對(duì)地表水和地下水有較大的污染風(fēng)險(xiǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1]郭冬生，彭小蘭，龔群輝，等. 畜禽糞便污染與治理利用方法研究進(jìn)展[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，24（6）：1164-1170.

[2]張?zhí)?，卜美東，耿維. 中國(guó)畜禽糞便污染現(xiàn)狀及產(chǎn)沼氣潛力[J]. 生態(tài)學(xué)雜志，2012，31（5）：1241-1249.

[3]劉輝，王凌云，劉忠珍，等. 我國(guó)畜禽糞便污染現(xiàn)狀與治理對(duì)策[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，37（6）：213-216.

[4]高定，陳同斌，劉斌，等. 我國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)糞便污染風(fēng)險(xiǎn)與控制策略[J]. 地理研究，2006，25（2）：311-319.

[5]Saturveithan C，Arieff A，Premganesh G，et al. Salmonella osteomyelitis in a one year old child without sickle cell disease：a case report[J]. Malaysian Orthopaedic Journal，2014，8（2）：52.

[6]Angelo K M，Chu A，Anand M，et al. Outbreak of Salmonella newport infections linked to cucumbers-United States，2014[J]. Morbidity and Mortality Weekly Report，2015，64（6）：144-147.

[7]Cevallos-Cevallos J M，Gu G，Richardson S M，et al. urvival of Salmonella enteric typhimurium in water amended with manure[J]. Journal of Food Protection，2014，77（12）：2035-2042.

[8]Wang Y，Yang B W，Wu Y，et al. Molecular characterization of Salmonella enterica serovar enteritidisonretail raw poultry in six provinces and two national cities in China[J]. Food Microbiology，2015，46：74-80.

[9]Carrasco E，Morales-Rueda A，M Garcia-Gimeno R M. Cross-contamination and recontamination by Salmonella in foods：a review[J]. Food Research International，2012，45（2）：545-556.[ZK）]

[10]Hanning I B，Nutt J D，Ricke S C. Salmonellosis outbreaks in the United States due to fresh produce：sources and potential intervention measures[J]. Foodborne Pathogens and Disease，2009，6（6）：635-648.[HJ1.7mm]

[11]Bech T B，Johnsen K，Dalsgaard A，et al. Transport and distribution of Salmonella enterica serovar typhimurium in loamy and sandy soil monoliths with applied liquid manure[J]. Applied and Environmental Microbiology，2010，76（3）：710-714.

[12]Ailes E，Budge P，Shankar M，et al. Economic and health impacts associated with a Salmonella typhimurium drinking water Outbreak-Alamosa，CO，2008[J]. PLOS One，2013，8（3）：e57439.

[13]Zhang T X，Wang H Z，Wu L S，et al. Survival of Escherichia coli O157：H7 in soils from Jiangsu province，China[J]. PLoS One，2013，8（12）：e81178.

[14]葉小梅，常志州，陳 欣，等. 畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)排放物病原微生物危險(xiǎn)性調(diào)查[J]. 生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報(bào)，2007，23（2）：66-70.

[15]Levantesi C，Bonadonna L，Briancesco R A，et al. Salmonella in surface and drinking water：occurrence and water-mediated transmission[J]. Food Research International，2012，45（2，SI）：587-602.

[16]Huong L Q，F(xiàn)orslund A，Madsen H，et al. Survival of Salmonella spp. and fecal indicator bacteria in vietnamese biogas digesters receiving pig slurry[J]. International Journal of Hygiene and Environmental Health，2014，217（7）：785-795.

[17]王曉泉，焦新安，劉曉文，等. 江蘇部分地區(qū)食源性和人源沙門氏菌的多重耐藥性研究[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2007，47（2）：221-227.

[18]陳偉偉，林升清，馬群飛，等. 福建省2000—2002年食品中沙門氏菌的監(jiān)測(cè)與分析[J]. 中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2003，15（5）：406-410.