劉柏岑 +潘衛(wèi)東 +婁華勇 晏文濤++吳翱蘭+劉杰麟

摘要：研究戴氏蟲草菌絲體抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性有效部位的化學(xué)成分及其抑制腫瘤細(xì)胞活性。采用液體深層發(fā)酵制備戴氏蟲草菌絲體，MTT法篩選其抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性的有效部位，反復(fù)正相柱層析，Sephadex LH-20等方法分離純化其有效部位中的化學(xué)成分，利用EI、ESI及1D-NMR等技術(shù)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定；并研究他們對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制活性。結(jié)果顯示，戴氏蟲草菌絲體石油醚、乙酸乙酯萃取部位為抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性部位，并從中分離得到6個(gè)化合物，分別為反式-16-十八碳烯酸（化合物1）、壬二酸（化合物2）、5α，8α-麥角甾-6，22-二烯-3β-醇（化合物3）、亞油酸甲酯（化合物4）、亞油酸（化合物5）和十七-烷醇（化合物6）。活性檢測(cè)表明，化合物2對(duì)舌癌Tca-8113細(xì)胞增殖具有較高的抑制活性，IC50值為31.90 μmol/L，化合物3對(duì)乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞和BT474細(xì)胞具有較高的細(xì)胞增殖抑制活性，IC50值分別為25.57、26.31 μmol/L。從戴氏蟲草菌絲體抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性部位中分離到6個(gè)化合物，化合物1～2、4～6為首次從該菌絲體中分離得到?；衔?、3分別選擇性地對(duì) Tca-8113 細(xì)胞和MDA-MB-435細(xì)胞、BT474細(xì)胞有較強(qiáng)的細(xì)胞增殖抑制活性，可能為戴氏蟲草菌絲體抑制腫瘤細(xì)胞增殖的有效成分。

關(guān)鍵詞：戴氏蟲草；菌絲體；單體化合物；MTT法；抑制腫瘤細(xì)胞增殖

中圖分類號(hào)： S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）05-0174-04

戴氏蟲草（Cordyceps taii）及其無性型戴氏綠僵菌（Metahizium taii）是從貴州省都勻市茶場(chǎng)分離到的一種蟲草菌屬真菌[1]，屬于子囊菌綱肉座菌目麥角菌科蟲草菌屬，與中國傳統(tǒng)名貴中藥冬蟲夏草、蟬花、蛹蟲草等是同屬真菌，當(dāng)?shù)孛耖g常將其作藥用和保健食品。戴氏蟲草多糖（CDP）可誘導(dǎo)紅白血病K562細(xì)胞與早幼粒白血病HL60細(xì)胞分別向紅細(xì)胞系和粒細(xì)胞系方向分化[2]。戴氏蟲草菌絲體的有效部位能明顯影響小鼠免疫器官指數(shù)，抑制腫瘤組織血管形成，并抑制惡性黑色素瘤細(xì)胞B16向肺轉(zhuǎn)移[3]。這提示戴氏蟲草菌絲體有潛力作為腫瘤治療的生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑和癌化學(xué)預(yù)防藥物。迄今，對(duì)戴氏蟲草菌絲體在開發(fā)利用方面仍缺乏系統(tǒng)研究，有關(guān)其藥理活性物質(zhì)基礎(chǔ)的報(bào)道甚少。本試驗(yàn)通過對(duì)戴氏蟲草菌絲體95%乙醇提取物的石油醚和乙酸乙酯萃取部位進(jìn)行抑瘤活性導(dǎo)向分離、純化，共得到6個(gè)化合物。其中，5個(gè)化合物均為首次從該真菌菌絲體中分離得到，并通過MTT法對(duì)這些化合物進(jìn)行抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性研究，以期為戴氏蟲草菌絲體的深入研究與開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

[HTK]1.1主要試劑與儀器[HT]

Sephadex LH-20（Amersham Biosciences公司），柱層析用硅膠（300～400、200～300、40～80目）、GF254薄層層析板（青島海洋化工廠），10%磷鉬酸顯色劑，二甲基亞砜（DMSO，Solarbio公司），高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基（Hyclone公司），胎牛血清（杭州四季青公司），0.25%胰蛋白酶（Hyclone公司），青霉素鏈霉素混合液雙抗，臺(tái)盼藍(lán)（美國Sigma公司），順鉑凍干粉（齊魯制藥有限公司），甲基噻唑藍(lán)MTT（范博公司）。所用有機(jī)溶劑均為工業(yè)級(jí)試劑經(jīng)重蒸純化處理。RZJ-APJ100L機(jī)械攪拌不銹鋼發(fā)酵罐（南京潤澤生物工程），INOVA-400 MHz核磁共振儀、WNMR-I 500 MHz核磁共振波譜儀（中國科學(xué)院武漢物理與數(shù)學(xué)研究所），惠普HP-1200紫外分光光度測(cè)定儀，HP-5973型質(zhì)譜儀（HP，美國），通用酶標(biāo)儀（美國BIOTEK公司）。

1.2菌株培養(yǎng)

試驗(yàn)用戴氏蟲草的無性型——戴氏綠僵菌菌株（GZ201206）保存于貴州醫(yī)科大學(xué)組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心。種子/發(fā)酵培養(yǎng)基：麥芽糖5 g，蛋白胨10 g，葡萄糖25 g，酵母浸膏5 g，水1 L，pH自然。菌種培養(yǎng)條件：（28±0.5）℃，100 r/min，600 L/h溶氧量。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞（法國醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院陸核教授饋贈(zèng)），人乳腺癌BT474細(xì)胞和人舌癌Tca-8113細(xì)胞保存于貴州醫(yī)科大學(xué)組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心細(xì)胞庫。復(fù)蘇細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)孵箱中培養(yǎng)，2～3 d換液傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

[HTK]1.4提取[HT]

戴氏蟲草發(fā)酵菌絲體3.4 kg，95%食用乙醇回流提取3次，每次1.5 h，合并過濾提取液，減壓濃縮得到食用乙醇提取浸膏。加適量水進(jìn)行溶解浸膏，利用液液兩相萃取方法用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，減壓回收得各萃取層浸膏，并用MTT法對(duì)3個(gè)萃取部位的抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性進(jìn)行研究。

[HTK]1.5戴氏蟲草菌絲體萃取部位抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性的篩選方法[HT]

MDA-MB-435細(xì)胞以每孔10 000個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板中，24 h后，于96孔板中加入已配制好的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇浸膏溶液各100 μL，其中每個(gè)浸膏的濃度依次為0.01、0.10、1.00 g/L，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，待加藥完畢后，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)；48 h后，每孔加入5 mg/mL MTT液20 μL，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)2～4 h；棄掉96孔板中的液體，每孔加入150～200 μL DMSO，室溫充分振蕩，使紫色結(jié)晶充分溶解，選擇490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔D值，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。

[JZ]腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=（1-D加藥組/D對(duì)照組）×100%。

式中：D對(duì)照組為不加藥品只加細(xì)胞液培養(yǎng)后的吸光度，D加藥組為細(xì)胞液和藥品共同培養(yǎng)后的吸光度。

[HTK]1.6戴氏蟲草菌絲體抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性部位分離與純化[HT]

根據(jù)腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性結(jié)果，對(duì)石油醚和乙酸乙酯浸膏（184.85 g）進(jìn)行硅膠柱層析，其洗脫劑比例為石油醚 ∶[KG-*3]乙酸乙酯（100 ∶[KG-*3]1，50 ∶[KG-*3]1，10 ∶[KG-*3]1，5 ∶[KG-*3]1，4 ∶[KG-*3]1，2 ∶[KG-*3]1，1 ∶[KG-*3]1，0 ∶[KG-*3]1），乙酸乙酯 ∶[KG-*3]甲醇（10 ∶[KG-*3]1，5 ∶[KG-*3]1，1 ∶[KG-*3]1，0 ∶[KG-*3]1）梯度洗脫，得到混合組分13個(gè)，分別對(duì)組分Fr.4，F(xiàn)r.5，F(xiàn)r.10，F(xiàn)r.15進(jìn)行反復(fù)正相硅膠柱層析，凝膠純化，重結(jié)晶等方法，借助TLC檢識(shí)，質(zhì)譜、1H-NMR、13C-NMR數(shù)據(jù)與現(xiàn)有文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比，分離得到化合物1（反式-16-十八碳烯酸[4]，30 mg）、化合物2（壬二酸[5-6]，25 mg）、化合物3（5α，8α-麥角甾-6，22-二烯-3β-醇[7-8]，15 mg）、化合物4（亞油酸甲酯[9-10]，5 mg），化合物5（亞油酸[11]，20 mg）、化合物6（十七-烷醇[12-13]，8 mg）。

[HTK]1.7單體化合物的抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性的測(cè)定方法[HT]

MDA-MB-435細(xì)胞，BT474細(xì)胞，Tca-8113細(xì)胞，分別以每孔調(diào)整細(xì)胞8 000、7 000、10 000個(gè)接種于96孔培養(yǎng)板中，24 h后，于96孔板中加入已配制好的化合物2和化合物3各100 μL，其中每個(gè)藥物的濃度依次為3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 μmol/L，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)，后續(xù)操作參照“1.5”節(jié)，其中IC50用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

[HTK]2.1戴氏蟲草菌絲體不同萃取部位抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性[HT]

通過MTT法測(cè)定了戴氏蟲草菌絲體的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位不同濃度對(duì)乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞增殖的抑制活性，表1抑瘤活性評(píng)價(jià)結(jié)果提示，與未加藥組比較，石油醚、乙酸乙酯萃取部位均對(duì)MDA-MB-435細(xì)胞有較明顯增殖抑制活性，且在濃度1 g/L時(shí)，抑制作用最為明顯，其抑制率分別為（83.79±0.42）%、（76.84±1.55）%。正丁醇萃取部位對(duì)MDA-MB-435細(xì)胞抑制作用不明顯。隨著戴氏蟲草菌絲體的石油醚、乙酸乙酯萃取物濃度升高，抑制作用成劑量相關(guān)性。因此對(duì)該有效部位所含化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)分離純化。

2.3戴氏蟲草菌絲體單體化合物的抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性[HT]

通過MTT法檢測(cè)從戴氏蟲草菌絲體的腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性部位中分離得到的小分子化合物：壬二酸（化合物2）和5α，8α-麥角甾-6，22-二烯-3β-醇（化合物3）對(duì)乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞、乳腺癌BT474細(xì)胞、舌癌Tca-8113細(xì)胞的增殖抑制活性（表2和表3）。結(jié)果所示，溶劑對(duì)照組DMSO在0.3%、0.2%、0.1%體積分?jǐn)?shù)時(shí)，對(duì)腫瘤細(xì)胞無[CM（25]明顯增殖抑制活性。化合物2和化合物3對(duì)MDA-MB-[CM）]

[FK（W22][TPLBC1.tif][FK）]

435細(xì)胞、BT474細(xì)胞、Tca-8113細(xì)胞有不同程度的抑制活性。與未加藥組相比，具有顯著性差異（P<0.05）。其中，化合物2對(duì)舌癌Tca-8113細(xì)胞增殖具有較高的抑制活性，在濃度3.125～50 μmol/L時(shí)，呈較好劑量依賴關(guān)系，抑制率為（2.43±2.09）%、（14.81±0.20）%、（30.81±6.36）%、（38.56±0.84）%、（62.678±0.84）%，IC50值為 31.90 μmol/L；5α，8α-麥角甾-6，22-二烯-3β-醇對(duì)乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞和BT474細(xì)胞具有較高的抑制細(xì)胞增殖活性，在濃度3.125～50 μmol/L時(shí)，呈較好劑量依賴關(guān)[CM（25]系，抑制率分別

3討論

戴氏蟲草是1991年由我國學(xué)者梁宗琦教授等在貴州省首次發(fā)現(xiàn)、鑒定并命名的蟲草真菌。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Liu等對(duì)戴氏蟲草菌絲體的氯仿萃取部位進(jìn)行了體外抑瘤活性檢測(cè)，該萃取部位對(duì)人肺癌A549細(xì)胞和胃癌SGC-7901細(xì)胞有較顯著的抑制活性[14]。也有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，與戴氏蟲草有種屬親緣關(guān)系的蛹蟲草的菌絲體乙醇提取物可阻滯人類大腸癌RKO細(xì)胞的G2/M細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。多數(shù)蟲草的抗腫瘤部位集中在氯仿、醇提取物中，而本研究通過MTT法對(duì)戴氏蟲草菌絲體的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位進(jìn)行初步抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性研究，篩選出石油醚、乙酸乙酯萃取部位具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性；并通過反復(fù)硅膠柱層析對(duì)抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性部位進(jìn)行提取、分離和凝膠純化，共分離得到6個(gè)單體化合物。分別為反式-16-十八碳烯酸（化合物1）、壬二酸（化合物2）、5α，8α-麥角甾-6，22-二烯-3β-醇（化合物3）、亞油酸甲酯（化合物4）、亞油酸（化合物5）和十七-烷醇（化合物6）。李小剛等在戴氏蟲草[16]、王剛等在蛹蟲草[17]中也檢測(cè)到化合物3的存在；在東北天南星[18]和三葉青[19]中也檢測(cè)到化合物2的存在；在商陸[20]和甘蔗葉[21]中也檢測(cè)到化合物4的存在；在北蟲草中[22]也檢測(cè)到化合物5的存在；在粉條兒菜[12]和天山雪蓮[13]中也檢測(cè)到化合物6的存在，查閱中外文獻(xiàn)，未發(fā)現(xiàn)化合物1、2、4、5、6在戴氏蟲草菌絲體中分離得到。因此，除5α，8α-麥角甾-6，22-二烯-3β-醇外，其余5種單體化合物是首次在戴氏蟲草菌絲體中發(fā)現(xiàn)和鑒定。

從海洋鏈格孢屬真菌[WTBX][STBX]Alternaria[WTBZ][STBZ] sp.MNP801菌體中曾分離到化合物3，并表明該化合物對(duì)肺癌H460細(xì)胞、大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞、淋巴癌U973細(xì)胞具有強(qiáng)的抑制活性，其IC50值分別為119.77、20.33、34.11 μmol/L[23]；在鮑姆氏層孔菌Phellinus baumii子實(shí)體中也分離到該化合物，對(duì)慢性骨髓性白血病K562細(xì)胞具有抑制活性，其IC50值為 164.9 μmol/L[24]。本研究通過MTT方法測(cè)定5α，8α-麥角甾-6，22-二烯-3β-醇對(duì)乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞、乳腺癌BT474細(xì)胞、舌癌Tca-8113細(xì)胞的增殖抑制活性，結(jié)果表明該化合物對(duì)3株癌細(xì)胞具有一定的增殖抑制活性，其中，該化合物對(duì)MDA-MB-435細(xì)胞和BT474細(xì)胞抑制作用較為明顯，IC50分別為（25.57±0.20）、（26.31±0.71）μmol/L。

另有相關(guān)報(bào)道顯示，化合物2在一定濃度范圍內(nèi)對(duì)小鼠和人黑色素瘤細(xì)胞的增殖和細(xì)胞活力的抑制作用呈劑量和時(shí)間依賴性，其機(jī)制是抑制腫瘤的DNA合成和纖維蛋白溶酶原激活物活性，引起線粒體腫脹和空泡[25]。從壬二酸（AA）結(jié)構(gòu)修飾得到二乙基壬二酸酯（DA）和壬二酸-β-環(huán)糊精復(fù)合物（AACD），以長(zhǎng)春新堿作為陽性對(duì)照，采用MTT法比較AA、DA、AACD對(duì)宮頸癌細(xì)胞（HeLa），口腔表皮樣癌KB細(xì)胞和鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞的抗增殖活性，結(jié)果表明AA抗癌效率低于長(zhǎng)春新堿，并且DA和AACD比AA抑制癌細(xì)胞更有效[26]。本研究通過MTT方法測(cè)定壬二酸對(duì)乳腺癌 MDA-MB-435細(xì)胞、乳腺癌BT474細(xì)胞、舌癌Tca-8113細(xì)胞的增殖抑制活性，結(jié)果表明壬二酸對(duì)3株癌細(xì)胞具有一定的增殖抑制活性，其中，該化合物對(duì)Tca-8113細(xì)胞抑制作用較為明顯，其IC50為（31.90±1.15）μmol/L。

在抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性試驗(yàn)中，戴氏蟲草菌絲體來源的單體化合物2和化合物3對(duì)乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞、乳腺癌BT474細(xì)胞、舌癌Tca-8113細(xì)胞有一定的抑制細(xì)胞增殖活性，說明化合物2和化合物3有可能是戴氏蟲草菌絲體抗腫瘤的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，可能具有潛在的抗癌藥物開發(fā)價(jià)值，其抑瘤機(jī)制和其余幾種單體化合物的作用還有待進(jìn)一步研究。

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