張媛華

摘要：酪氨酸蛋白激酶（protein tyrosine kinase，PTK）參與多種植物生理過程，但在氣孔運(yùn)動中的研究相對較少，且與過氧化氫（H2O2）在脫落酸（abscisic acid，ABA）誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉中的關(guān)系尚不清楚。通過PTK激酶的抑制劑和H2O2的清除劑及合成抑制劑的使用，初步研究了PTK在ABA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉中的作用及與H2O2的相互關(guān)系。酪氨酸蛋白激酶抑制劑木黃酮（genistein）和tyrphostin A23抑制ABA和外源H2O2誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉，且能夠促進(jìn)ABA誘導(dǎo)關(guān)閉的氣孔重新開放。PTK參與ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉，且通過調(diào)控保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)H2O2水平進(jìn)而調(diào)控氣孔運(yùn)動。

關(guān)鍵詞：PTK激酶；ABA；H2O2；氣孔；蠶豆

中圖分類號： Q945.19文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）05-0077-02

酪氨酸蛋白激酶（protein tyrosine kinase，PTK）是一種能有選擇性地使不同底物的酪氨酸殘基磷酸化的一種酶。正常情況下，細(xì)胞的酪氨酸激酶磷酸化作用是由酪氨酸激酶和酪氨酸磷酸酶拮抗調(diào)節(jié)維持平衡的。相對于動物細(xì)胞中的研究而言，植物中的蛋白酪氨酸激酶起步較晚，僅有少量報道[1-2]。[JP2]Zi等證實(shí)酪氨酸蛋白磷酸酶抑制劑PAO和酪氨酸蛋白激酶抑制劑木黃酮能夠抑制花粉萌發(fā)和花粉管的生長，并且導(dǎo)致花粉管不同程度的畸變[1]。隨后Yemets等證明，PTKs抑制劑（除莠霉素A、木黃酮及tyrphostin AG18）均可能通過影響根毛中的皮質(zhì)微管結(jié)構(gòu)進(jìn)而改變根毛的生長和發(fā)育[2]。然而Ghelis等的結(jié)果提示了PTKs抑制ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉，但是關(guān)于其機(jī)制卻不清楚[3]。因此，本試驗(yàn)就PTK在脫落酸（ABA）誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉中與H2O2的相互關(guān)系進(jìn)行初步研究。[JP]

1材料與方法

木黃酮、tyrphostin A23、過氧化氫酶（catalase，CAT）、DPI（二苯基氯化碘鹽，diphenyleneiodonium chloride）、MES[2-（N-嗎啉）乙磺酸，2-（N-morpholino）ethanesulfonic acid]均購自 Sigma 公司，H2DCF-DA（2′，7′-二氯熒光素-3′，6′-二乙酸酯，2，7-dichlorofluorescein diacetate）購自Biotium公司，DMSO（二甲基亞砜，dimethyl sulfoxide）購自 Amresco 公司，其他均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1材料培養(yǎng)

蠶豆（Vicia faba L.）種子經(jīng)消毒、催芽后培養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)箱光—暗周期設(shè)定為14 h—10 h，光照度為 300 μmol/（m2·s），溫度為25 ℃/18 ℃，相對濕度75%。幼苗生長期間澆水1次/d。取4周齡植株莖頂端完全展開的第1對葉片用于試驗(yàn)分析。

1.2氣孔分析

氣孔分析參照McAinsh等的方法[4]進(jìn)行。測量時隨機(jī)選取5個視野，每個視野隨機(jī)選取6個氣孔。每個處理重復(fù)3次，所得數(shù)據(jù)計(jì)算平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)誤差。

2結(jié)果與分析

2.1ABA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉

由圖1可見，ABA能明顯促進(jìn)光下的氣孔關(guān)閉。隨ABA濃度的增加，抑制程度增大。與對照相比，1、5、10、15 μmol/L 分別抑制了23.5%、35.5%、47.9%、51.5%?？紤]到 10 μmol/L 已對氣孔產(chǎn)生很好的抑制效果，隨后的試驗(yàn)中均采用此濃度。

2.2木黃酮和tyrphostin A23抑制ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉

木黃酮和tyrphostin A23是PTK激酶的專一性抑制劑。圖2結(jié)果表明，不同濃度的木黃酮（圖2-a）和tyrphostin A23（圖2-b）均可明顯抑制ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉。與對照相比，最低濃度10 μmol/L的木黃酮和tyrphostin A23促進(jìn)氣孔開放分別達(dá)24.1%和26.6%。且隨濃度升高，抑制ABA的程度呈劑量依賴型增大。至150 血酸ASA和過氧化氫酶CAT能明顯抑制該過程，而過氧化氫產(chǎn)生酶NADPH氧化酶的抑制劑DPI卻不能抑制該過程。該結(jié)果表明，清除保衛(wèi)細(xì)胞中的H2O2能夠促進(jìn)氣孔開放。而H2O2誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉同樣被木黃酮和tyrphostin A23所抑制，表明木黃酮和tyrphostin A23可能通過類似清除的方式促進(jìn)氣孔開放。

[HTK]2.4木黃酮和tyrphostin A23促進(jìn)ABA誘導(dǎo)關(guān)閉的氣孔重新開放[HT]

研究表明，ABA能夠促進(jìn)保衛(wèi)細(xì)胞的產(chǎn)生和H2O2的積累進(jìn)而誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉[5]。而圖4顯示，100 μmol/L 木黃酮和tyrphostin A23不僅抑制ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉，且能夠促進(jìn)ABA已經(jīng)誘導(dǎo)關(guān)閉的氣孔重新開放。同樣，H2O2的清除劑抗壞血酸ASA和過氧化氫酶CAT也能逆轉(zhuǎn)ABA關(guān)閉的氣孔重新開放，而H2O2產(chǎn)生酶-NADPH氧化酶的抑制劑DPI卻不能逆轉(zhuǎn)該過程（圖4）。結(jié)果表明，木黃酮、tyrphostin A23與H2O2的清除劑ASA和CAT二者作用結(jié)果相似，推測木黃酮、

tyrphostin A23可能通過清除保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)部H2O2的方式逆轉(zhuǎn)ABA誘導(dǎo)關(guān)閉的氣孔重新開放。

木黃酮和tyrphostin A23作為2種特異的PTK激酶抑制劑，能夠有選擇地抑制PTK激酶的活性[6-7]。本研究結(jié)果顯示，ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉可被PTK激酶的抑制劑木黃酮和tyrphostin A23抑制，表明PTK激酶參與ABA誘導(dǎo)的蠶豆氣孔關(guān)閉。該結(jié)果與Ghelis等在擬南芥中的研究結(jié)果[3]一致。

H2O2作為一種重要的信號分子參與多種環(huán)境因子和植物激素誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉[8-9]。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，木黃酮和tyrphostin A23是通過類似于H2O2清除劑ASA和CAT清除保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)H2O2的方式抑制外源過氧化氫誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉，而不是通過抑制H2O2生成的方式參與氣孔運(yùn)動（圖3、圖4）。該結(jié)果表明，PTK激酶的活性可能通過促進(jìn)H2O2的積累進(jìn)而參與ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉。此外，木黃酮和tyrphostin A23能夠逆轉(zhuǎn)ABA誘導(dǎo)已關(guān)閉的氣孔重新開放，效應(yīng)也同ASA和CAT相似，異于DPI。該結(jié)果不僅進(jìn)一步證實(shí)了上述推測，還表明木黃酮和tyrphostin A23可能具有清除細(xì)胞內(nèi)H2O2的功能，與PTK通過磷酸化肌動蛋白參與花粉的萌發(fā)和花粉管的伸長機(jī)制不同[1]。

3結(jié)論

PTK激酶可能通過調(diào)節(jié)H2O2水平參與ABA誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉。木黃酮和tyrphostin A23通過清除細(xì)胞內(nèi)H2O2的方式不僅能抑制外源H2O2誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉，還能逆轉(zhuǎn)ABA誘導(dǎo)關(guān)閉的氣孔重新開放。

參考文獻(xiàn)：

[1]Zi H J， Xiang Y， Li M， et al. Reversible protein tyrosine phosphorylation affects pollen germination and pollen tube growth via the actin cytoskeleton[J]. Protoplasma，2007，230（3-4）：183-191.

[2]Yemets A， Sheremet Y， Vissenberg K， et al. Effects of tyrosine kinase and phosphatase inhibitors on microtubules in Arabidopsis root cells[J]. Cell Biology International，2008，32（6）：630-637.

[3]Ghelis T， Bolbach G， Clodic G， et al. Protein tyrosine kinases and protein tyrosine phosphatases are involved in abscisic acid-dependent processes in Arabidopsis seeds and suspension cells[J]. Plant Physiology，2008，148（3）：1668-1680.

[4]McAinsh M R， Clayton H， Mansfield T A， et al. Changes in stomatal behavior and guard cell cytosolic free calcium in response to oxidative stress[J]. Plant Physiology，1996，111（4）：1031-1042.