沈維祥，陳春峰，張小燕，郜恒駿

基于突變阻滯擴(kuò)增系統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢測幽門螺桿菌23S rRNA基因突變及其評價(jià)

沈維祥，陳春峰，張小燕，郜恒駿

目的探索突變阻滯擴(kuò)增系統(tǒng)（ARMS）聯(lián)合實(shí)時(shí)熒光 PCR技術(shù)用于檢測幽門螺桿菌 23S rRNA 基因突變的可行性。

突變阻滯擴(kuò)增系統(tǒng)； 實(shí)時(shí)熒光 PCR； 基因突變

基因突變是人類各種遺傳疾病和惡性腫瘤發(fā)生的根本原因，檢測與遺傳病及腫瘤發(fā)生有關(guān)的突變基因一直是醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)，它對闡明遺傳病和腫瘤發(fā)生的分子生物學(xué)基礎(chǔ)及早期診斷具有重要意義。目前傳統(tǒng)的基因檢測方法有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP）及熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)[1-4]。近年來興起的基因芯片、二代測序、變性高效液相色譜、生物質(zhì)譜等基因分型技術(shù)，以其通量大和自動化程度高等特點(diǎn)，逐漸被廣泛應(yīng)用到疾病基因組學(xué)、藥物基因組學(xué)等研究領(lǐng)域[5-7]。但上述這些檢測技術(shù)操作繁瑣且依賴昂貴的儀器設(shè)備，限制了其在臨床檢測方面的應(yīng)用。本研究采用突變阻滯擴(kuò)增系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）聯(lián)合實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)，以幽門螺桿菌 23S rRNA 基因 2143位點(diǎn)的兩種基因型（野生型為 AAA，突變型為AGA）為研究靶點(diǎn)，主要從 ARMS 引物的設(shè)計(jì)，引物濃度的選擇，PCR 反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化等方面進(jìn)行基因分型特異性研究，希望在此基礎(chǔ)上發(fā)展成為一種適合臨床應(yīng)用的基因突變檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 DNA 模板 幽門螺桿菌 23S rRNA 基因野生型質(zhì)粒 DNA 模板（2143 位點(diǎn)為 AAA，簡稱AAA 模板）直接以正常人基因組 DNA 為模板構(gòu)建，突變型質(zhì)粒（簡稱 AGA 模板）采用點(diǎn)突變方法構(gòu)建。野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒委托上海生工生物工程有限公司制備，所有構(gòu)建的質(zhì)粒 DNA 模板序列均經(jīng)測序確認(rèn)。

1.1.2 主要儀器和試劑 LightCycler 480 實(shí)時(shí)熒光 PCR 儀購自美國 Roche 公司；NanoDrop 2000超微量生物檢測儀購自美國 ThermoFisher 公司；Taq 酶、dNTPs 等購自大連寶生物工程有限公司。

1.1.3 引物探針 根據(jù)已公布的 23S rRNA 基因的 2143 位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)特異的 ARMS 上游引物以及一條公共的下游引物和探針（序列如表 1 所示），所有的引物和探針均由大連寶生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 ARMS-實(shí)時(shí)熒光 PCR 擴(kuò)增曲線分析 PCR 體系含 10×PCR buffer，5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，2 U Taq 酶，0.3 μmol/L 下游引物和 0.1 μmol/L 探針（表 1 中 R 和 P）。將上述組分混勻后，每管體積 100 μl 分裝，分別加入表 1中的上游引物 F1 和 F2 各 0.3 μmol/L。然后每管再分裝 4 小管，每小管最終體積 25 μl，使每條引物分別對兩種質(zhì)粒 DNA 模板（約 0.1 ng）和水（作為陰性對照）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增與結(jié)果分析。反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性 5 min；94 ℃ 變性 15 s，55 ℃ 退火 20 s，72 ℃ 延伸 30 s，擴(kuò)增 45 個(gè)循環(huán)；在每一循環(huán)的退火溫度收集熒光信號。

1.2.2 ARMS-實(shí)時(shí)熒光 PCR 反應(yīng)體系及條件優(yōu)化 ARMS-PCR 反應(yīng)步驟改良：PCR 體系組成同1.2.1。反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性 5 min；94 ℃ 變性15 s，62 ℃ 延伸 30 s，擴(kuò)增 45 個(gè)循環(huán)；在每一循環(huán)的延伸溫度 62 ℃ 時(shí)收集熒光信號。

ARMS 引物濃度的優(yōu)化：將 ARMS 引物（濃度 0.3 μmol/L）分別稀釋 5、10 和 20 倍后，再進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光 PCR 檢測。反應(yīng)體系其他成分及反應(yīng)條件不變。

表1 ARMS 引物設(shè)計(jì)列表Table 1 Sequence information of ARMS primers

鎂離子濃度的優(yōu)化：將鎂離子（原濃度4 mmol/L）調(diào)整為 2.5 mmol/L 后，再進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光 PCR 檢測。反應(yīng)體系其他成分及反應(yīng)條件不變。

1.2.3 ARMS-實(shí)時(shí)熒光 PCR 突變檢測 PCR體系含 10×PCR buffer，2 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，2 U Taq 酶，0.3μmol/L 下游引物和 0.1 μmol/L 探針（表 1 中 AAA-R-primer 和AAA-probe）。將上述組分混勻后，每管體積 120 μl分裝，分別加入表 1 中的上游引物各 0.03 μmol/L。然后每管再分裝 5 小管，每小管最終體積 25 μl，使每條引物分別對 4 種質(zhì)粒 DNA 模板（約0.1 ng）和水（作為陰性對照）進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增與結(jié)果分析。反應(yīng)條件：94 ℃ 預(yù)變性 5 min；94 ℃ 變性 15 s，62 ℃ 延伸 30 s，擴(kuò)增 45 個(gè)循環(huán)；在每一循環(huán)的延伸溫度 62 ℃ 時(shí)收集熒光信號。

2 結(jié)果

2.1 ARMS-實(shí)時(shí)熒光 PCR 擴(kuò)增曲線分析

圖1 ARMS-PCR 擴(kuò)增曲線分析（A、B 圖分別采用 F1、F2 引物和傳統(tǒng)三步法 PCR 進(jìn)行 ARMS-PCR 基因分型）Figure 1 Results of ARMS-PCR genotyping based on the basic three-step PCR protocol (A:Primer F1 with AAA and AGA templates; B:Primer F2 with AAA and AGA templates)

如圖 1 所示，使用傳統(tǒng)三步法 PCR 程序用于分別擴(kuò)增 AAA 模板和 AGA 模板的兩條引物 F1和 F2，其中 F1 是和模板序列完全互補(bǔ)的引物，而 F2 是在距離 3' 端的第（n-3）位點(diǎn)引入故意的錯(cuò)配，以 T 取代 G 的引物。使用 F1 引物體系分別擴(kuò)增 AAA 模板和 AGA 模板，兩條擴(kuò)增曲線無明顯差別（Ct 值分別為 26.56 和 26.61），表明 F1引物并不能區(qū)分 AAA 模板和 AGA 模板，見圖1A。再使用 F2 引物體系分別擴(kuò)增 AAA 模板和AGA 模板，結(jié)果見圖 1B。F2 引物表現(xiàn)出一定的分辨能力，擴(kuò)增 AGA 模板的曲線 Ct 值滯后（Ct值為 30.67），表明引入故意的錯(cuò)配能夠發(fā)揮作用。同時(shí)，F(xiàn)2 引物體系也能夠較好地?cái)U(kuò)增 AAA 模板（Ct 值為 26.58），表明引入故意的錯(cuò)配對 AAA模板的擴(kuò)增影響較小。值得注意的是，F(xiàn)2 引物擴(kuò)增 AGA 模板雖然出現(xiàn)了 Ct 值滯后，但并不能夠完全消除這種非特異性擴(kuò)增的現(xiàn)象。根據(jù) F2 和F3 自身 Tm值的差別，對傳統(tǒng)三步法 PCR 程序進(jìn)行改良，即將傳統(tǒng)退火和延伸步驟改為一步恒溫62 ℃ 采集熒光信號，期望提高特異性引物與模板的匹配度，增加 ARMS 引物基因分型的特異性。

2.2 ARMS-實(shí)時(shí)熒光 PCR 反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 反應(yīng)程序優(yōu)化結(jié)果 對 PCR 循環(huán)進(jìn)行改良，即將傳統(tǒng)退火和延伸步驟改為一步恒溫 62 ℃采集熒光信號，結(jié)果如圖 2 所示。使用 F1 引物體系分別擴(kuò)增 AAA 模板和 AGA 模板，兩條擴(kuò)增曲線也出現(xiàn)了 Ct 值的差異，兩者的 Ct 值與傳統(tǒng)三步法 PCR 程序產(chǎn)生的 Ct 值相比明顯提前（Ct值分別為 16.58 和 22.19），表明改良的 PCR 程序有助于提高特異性引物與模板的匹配度，見圖 2A。再使用 F2 引物體系分別擴(kuò)增 AAA 模板和 AGA模板，結(jié)果見圖 2B，產(chǎn)生的 Ct 值之差（△Ct 值）進(jìn)一步增大，表明改良 PCR 程序有助于增加基因分型的特異性。圖 2C 為使用 F3 引物體系分別擴(kuò)增 AAA 模板和 AGA 模板，結(jié)果也顯示出類似的趨勢。尤其是采用 ARMS 引物與兩步法 PCR 程序結(jié)合后，AAA 模板和 AGA 模板的熒光信號可以很清晰地區(qū)分，基因分型特異性大大增加。因此，研究人員進(jìn)一步對 PCR 反應(yīng)體系中的關(guān)鍵成分ARMS 引物和鎂離子作優(yōu)化，以期消除非特異性擴(kuò)增的現(xiàn)象。

2.2.2 ARMS 引物濃度優(yōu)化結(jié)果 將 F3 引物濃度稀釋 5、10 和 20 倍后的結(jié)果表明，若稀釋倍數(shù)太低，如圖 3A 所示，對基因分型的結(jié)果改善不明顯；若稀釋倍數(shù)太高，如圖 3C 所示，則造成目的產(chǎn)物擴(kuò)增效率太低，不利于基因分型?？偟膩碚f本研究中所采用的 F2 ARMS 引物稀釋 10 倍時(shí)可得到特異性較好的分型結(jié)果，見圖 3B。

圖2 ARMS-實(shí)時(shí) PCR 基因分型 PCR 程序改良（A、B、C 圖分別采用 F1、F2 和 F3 引物和改良兩步法 PCR 進(jìn)行ARMS-實(shí)時(shí) PCR 基因分型）Figure 2 Results of ARMS-PCR genotyping based on the improved two-step PCR protocol (A:Primer F1 with AAA and AGA templates; B:Primer F2 with AAA and AGA templates; C:Primer F3 with AAA and AGA templates)

圖3 ARMS-實(shí)時(shí) PCR 基因分型引物濃度優(yōu)化（A、B、C 圖分別采用 0.05、0.03、0.015 μmol/L 的 F3 引物進(jìn)行 ARMS-實(shí)時(shí) PCR 基因分型）Figure 3 Results of ARMS-PCR genotyping based on the improved two-step PCR protocol with different concentrations of ARMS primer (A:0.05 μmol/L primer F3; B:0.03 μmol/L primer F3; C:0.015 μmol/L primer F3)

圖4 ARMS-實(shí)時(shí) PCR 基因分型鎂離子濃度優(yōu)化（A、B 圖分別為 F2 和 F3 引物采用 2 mmol/L 鎂離子濃度進(jìn)行ARMS-實(shí)時(shí) PCR 基因分型）Figure 4 Results of ARMS-PCR genotyping based on the improved two-step PCR protocol with 2 mmol/L concentration of Mg2+(A:Primer F2 with AAA and AGA templates; B:Primer F3 with AAA and AGA templates)

圖5 ARMS-實(shí)時(shí) PCR 基因分型（A、B 圖分別為 F2 和 F3 引物采用優(yōu)化后的體系以及 PCR 程序進(jìn)行 ARMS-實(shí)時(shí)PCR 基因分型）Figure 5 Results of ARMS-PCR genotyping based on the final PCR protocol (A:Primer F2 with AAA and AGA templates; B:Primer F3 with AAA and AGA templates)

2.2.3 鎂離子濃度優(yōu)化 將 PCR 體系中的鎂離子濃度降低，F(xiàn)2 引物和 F3 引物分別擴(kuò)增完全匹配的模板（AAA 模板和 AGA 模板），Ct 值均表現(xiàn)出一定程度的滯后（Ct 值分別為 20.85 和21.03），但對于非特異性模板的擴(kuò)增表現(xiàn)出明顯的抑制現(xiàn)象，結(jié)果如圖 4 所示。表明降低鎂離子濃度能夠抑制非特異性擴(kuò)增，分型特異性大大增強(qiáng)。

2.3 ARMS-實(shí)時(shí)熒光 PCR 突變檢測結(jié)果

經(jīng)過上述對 ARMS-PCR 基因分型特異性的探討后，采用在距離引物 3' 端的第（n-3）位點(diǎn)引入故意錯(cuò)配堿基的 ARMS 引物，并將該引物濃度稀釋 10 倍（0.03 μmol/L），鎂離子濃度調(diào)整為2 mmol/L，結(jié)合改良的兩步法 PCR 程序進(jìn)行基因分型研究。結(jié)果如圖 5 所示，兩種基因型均可以得到很好的區(qū)分，錯(cuò)配模板的影響能夠降到最低，基本不影響基因分型結(jié)果的判定。

3 討論

突變阻滯擴(kuò)增系統(tǒng)（ARMS）也被稱為等位基因特異性擴(kuò)增法（allele-specific amplification，ASA），其通常與 PCR 技術(shù)相結(jié)合。在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)若 3' 端堿基對形成錯(cuò)配，根據(jù) 3' 端錯(cuò)配原則，鏈延伸反應(yīng)就會因 3',5'-磷酸二酯鍵形成的障礙而受阻[8]。而只有特定等位基因的模板鏈存在條件下，鏈延伸才會正常進(jìn)行。ARMS 引物設(shè)計(jì)是決定突變阻滯擴(kuò)增系統(tǒng)檢測特異性的關(guān)鍵。引物 3'末端堿基必須落在突變的位置上，該堿基可以是與野生型基因序列完全互補(bǔ)，而與突變型不匹配；也可以與突變型互補(bǔ)而與野生型不匹配。但 3' 端最后堿基必須在突變位置上，否則將不能很好地判斷該位點(diǎn)的突變是否發(fā)生。本研究針對幽門螺桿菌在臨床上出現(xiàn)耐藥突變，在 23S rRNA 基因 2143 點(diǎn)存在兩種基因型（野生型為 AAA，突變型為AGA），設(shè)計(jì) ARMS 引物，以期通過熒光 PCR 技術(shù)區(qū)分這兩種基因型，達(dá)到檢測基因突變的目的。

值得注意的是，ARMS-PCR 對 SNP 的檢出還依賴于防止引物與靶 DNA 錯(cuò)配時(shí)可能發(fā)生的延伸，在 ARMS 引物設(shè)計(jì)時(shí)，為了增加引物對 SNP檢測的特異性和靈敏度，可人為地在引物 3' 末端引入第二個(gè)錯(cuò)配堿基，以阻止非完全匹配的延伸。本次研究即采用此種方法，在距離引物 3' 端的第（n-3）位點(diǎn)引入故意的錯(cuò)配。有國外研究表明，在所有的堿基對中 G∶T 錯(cuò)配相對容易[9]。據(jù)此，本研究的幾條 ARMS 引物均引入該種類型的錯(cuò)配形式。圖 1B 所示，引入第二個(gè)錯(cuò)配堿基，匹配型擴(kuò)增和錯(cuò)配型擴(kuò)增的 △Ct 值為 3～4。

此外，熒光 PCR 的反應(yīng)體系與 ARMS 引物的特異性密切相關(guān)。因此對反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化是十分必要的。一方面，可以添加 DMSO、甲酰胺或者甜菜堿等化學(xué)添加劑；另一方面，調(diào)整鎂離子濃度、靶 DNA 濃度、Taq 酶的用量和退火溫度等來提高特異性[10]。在本研究中，反應(yīng)程序的改變和鎂離子濃度的調(diào)整對于非特異性模板的擴(kuò)增都有明顯的抑制，匹配型擴(kuò)增和錯(cuò)配型擴(kuò)增的 △Ct 值均在10 以上，如圖 2B、2C 和圖 4 顯示。雖然不能完全消除非特異性擴(kuò)增，但在一定程度上增加了ARMS 引物的特異性，增強(qiáng)了其分型能力。

除了常規(guī)的退火溫度和鎂離子濃度的優(yōu)化外，本研究對 ARMS 引物濃度對分型特異性的影響進(jìn)行考察，結(jié)果表明：較低的 ARMS 引物濃度可以增加 PCR 反應(yīng)的特異性，但與此同時(shí)會出現(xiàn)擴(kuò)增效率的降低。如圖 3C 所示，將引物稀釋 20 倍后，正常的匹配型擴(kuò)增 Ct 值為 32.26；而錯(cuò)配型擴(kuò)增的 Ct 值雖然滯后明顯，但兩者 △Ct 值并未變化。所以必須找到一個(gè)平衡點(diǎn)，選擇最佳的反應(yīng)條件可以取得令人滿意的分型效果。圖 3B 表明，將引物稀釋 10 倍后的 PCR 反應(yīng)條件下，23S rRNA 基因的兩種基因型得到了最大程度的區(qū)分。

本研究對基于突變阻滯擴(kuò)增系統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光PCR 基因分型方法的特異性進(jìn)行了深入探討，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)優(yōu)化后的兩步法 ARMS-PCR 分型方法，是一種簡便、準(zhǔn)確、快速的基因分型方法，并有望在此基礎(chǔ)上發(fā)展成為適合臨床應(yīng)用的突變檢測方法。

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Detection of Helicobacter Pylori 23S rRNA gene mutation by using the quantitative real-time PCR technology based on the amplification refractory mutation system

SHEN Wei-xiang,CHEN Chun-feng,ZHANG Xiao-yan,GAO Heng-jun

ObjectiveTo evaluate the feasibility of detection of the 23S rRNA gene mutation of Helicobacter pylori in gastric mucosa by using the amplification refractory mutation system (ARMS) combined with real-time PCR.MethodA kind of plasmids containing two different genotypes in 2143 site of 23S rRNA gene (which wild type is AAA and mutants are AGA) was used as model to study the specificity of ARMS primers-based real-time PCR genotyping.Based on designing different primers and optimizing the real-time fluorescent PCR system,the ARMS combined with quantitative real-time PCR method could be used to detection of the 23S rRNA gene mutation of Helicobacter pylori.ResultThe concentrations of ARMS primers and magnesium ion were reduced by harboring additional mismatch at the vicinity of the 3' end of the ARMS primers,and the specificity of the ARMS primer was enhanced by using a 2-step PCR protocol,and then a clear genotype results were achieved.ConclusionThe amplification refractory mutation system combined with quantitative real-time PCR is proved to be a rapid,simple,cost effective,and reliable genotyping method.It can be applicable to genotyping of a variety of genes and has the potential to apply in clinical diagnosis.

Amplification refractory mutation system; Real-time PCR; Gene mutation

GAO Heng-jun,Email:xiaoyan_zhang@shbiochip.com

上海市浦東新區(qū)科技發(fā)展基金（PKJ2015-S）

201203 上海，生物芯片上海國家工程研究中心

郜恒駿，Email：xiaoyan_zhang@shbiochip.com

2016-12-30

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.02.004

方法以幽門螺桿菌 23S rRNA 基因 2143 位點(diǎn)的兩種基因型（野生型為 AAA，突變型為 AGA）質(zhì)粒 DNA 為研究模型，設(shè)計(jì) ARMS 引物同時(shí)對實(shí)時(shí)熒光 PCR 體系進(jìn)行優(yōu)化，對突變阻滯擴(kuò)增系統(tǒng)聯(lián)合實(shí)時(shí)熒光 PCR 技術(shù)的基因分型特異性進(jìn)行評價(jià)。

結(jié)果在與模板匹配的 ARMS 引物 3' 端附近故意引入錯(cuò)配堿基，降低該 ARMS 引物濃度和鎂離子濃度，并采用兩步 PCR循環(huán)的反應(yīng)程序，使 ARMS 引物的特異性增強(qiáng)，能夠得到清晰的基因分型結(jié)果。

結(jié)論這種基于突變阻滯擴(kuò)增系統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光 PCR 技術(shù)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡便，特異性較好，并有望在此基礎(chǔ)上發(fā)展成為適合臨床應(yīng)用的突變檢測方法。

Author Affiliations：National Engineering Center for Biochip,Shanghai 201203,China