章毅，陳亮，李萍，許惠利，王哲，伍婷，張澄宇

人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞微環(huán)境對心肌細(xì)胞增殖的影響

章毅，陳亮，李萍，許惠利，王哲，伍婷，張澄宇

目的觀察胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞微環(huán)境對心肌細(xì)胞增殖的影響。

肌細(xì)胞，心臟； 細(xì)胞微環(huán)境； 胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞

隨著人類對間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及研究進(jìn)一步加深，已從骨髓、外周血、脂肪等組織中成功分離鑒定出間充質(zhì)干細(xì)胞。胎盤作為胚胎發(fā)育期間維系母體和胎兒營養(yǎng)物質(zhì)交換和氧氣運(yùn)輸?shù)闹匾R時(shí)性器官，富含大量的間充質(zhì)干細(xì)胞，其在胎兒娩出時(shí)即完成最后使命，成為“醫(yī)療廢棄物”，對其研究和臨床應(yīng)用不涉及任何倫理道德問題，目前已經(jīng)成為尋找人間充質(zhì)干細(xì)胞的新來源，并成為臨床應(yīng)用效果研究的新熱點(diǎn)。利用人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞（placenta derived mesenchymal stem cell，pMSC）增殖分化這一潛能，進(jìn)行心肌細(xì)胞再生修復(fù)，心肌細(xì)胞損傷修復(fù)并進(jìn)一步修復(fù)心臟功能，也已成為心臟病等心血管疾病治療的一種新醫(yī)療手段。人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞為再生受損組織器官提供了巨大的希望，但受其有效性、尚不清楚的機(jī)制、缺血環(huán)境中移植細(xì)胞的生存問題等諸多因素的阻礙。因此，開發(fā)無細(xì)胞組分如人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞微環(huán)境制劑部分替代干細(xì)胞治療顯得尤為重要。本文從胎盤組織絨毛膜中分離鑒定獲得間充質(zhì)干細(xì)胞，采用人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基上清模擬胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞微環(huán)境，觀察人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞微環(huán)境對心肌細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

胎盤采集于足月健康新生兒，符合國家相關(guān)法律和倫理委員會(huì)規(guī)定，經(jīng)產(chǎn)婦或家屬簽署知情同意書后獲得。成脂、成軟骨、成骨誘導(dǎo)套裝購自美國Gibco 公司；CCK8 試劑盒購自碧云天公司；PI、RNase A 購自美國 Sigma 公司；MSC Phenotyping kit（CD105-PE、CD90-FITC、CD73-APC、CD14-/CD19-/CD34-/CD45-PerCP） 購 自 德 國Miltenyi Biotec 公司；油紅 O 染液、Masson 染液、茜素紅 S 染液購自南京建成公司；H9C2 細(xì)胞購自中科院細(xì)胞庫；transwell 小室購自美國Thermofisher 公司。

1.2 方法

1.2.1 pMSC 的分離培養(yǎng) 無菌條件下剪取胎盤絨毛膜組織，剪成約 5 mm3的碎塊，加入 II 型膠原酶恒溫消化 1.5 h，室溫 2000 r/min 離心 10 min，加入含 10% FBS 的培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，置于 37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長情況，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90% 時(shí)，胰酶消化傳代，每 2～3 天傳代1 次，倒置顯微鏡下觀察 pMSC 形態(tài)并拍照記錄。

1.2.2 pMSC 表面抗原檢測 取 pMSC，用1 ml PBS 調(diào)整細(xì)胞總數(shù)為 5×106，分別加入標(biāo)記抗體 CD90-FITC、CD105-PE、CD73-APC、CD14-/CD19-/CD34-/CD45-PerCP，以鼠抗人的IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-APC、IgG1-PerCP、IgG2a-PerCP 作為同型對照，室溫避光孵育 30 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.3 pMSC 三向分化檢測 取對數(shù)生長期的pMSC，以 1×105/ml 密度接種于 6 孔板中，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為 5% 的 CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞融合度達(dá)到 60%～70% 時(shí)，分別更換為成脂、成軟骨及成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，每 3 天換液。誘導(dǎo) 14 d 后，成脂誘導(dǎo)、成軟骨誘導(dǎo)、成骨誘導(dǎo)分別用油紅 O 染液、Masson 染液、茜素紅S 染液染色，倒置相差顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 pMSC 培養(yǎng)基上清收集及與心肌細(xì)胞共培養(yǎng) 選擇對數(shù)期生長的 pMSC 進(jìn)行消化傳代，于10 mm×10 mm 的細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，每 2 天換液，觀察細(xì)胞生長形態(tài)，待細(xì)胞生長密度達(dá)到 80%～ 90% 收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清待用。

1.2.5 Transwell 共培養(yǎng)及 H9C2 生長狀態(tài)觀察 將對數(shù)生長期 H9C2 細(xì)胞以 5×104/ml 密度接種于 6 孔 transwell 板下室中，上室處理共分6 組，分別加入 2 ml 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基、2 ml pMSC-CM、2 ml 5×104/ml 的 pMSC；4 ml 10% FBS 的 DMEM 培養(yǎng)基、4 ml pMSC-CM、4 ml 1×105/ml 的 pMSC。每個(gè)處理設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)。共培養(yǎng) 72 h，倒置顯微鏡下觀察 transwell 下室心肌細(xì)胞生長狀態(tài)并拍照記錄。

1.2.6 細(xì)胞增殖檢測 將上述 6 組共培養(yǎng)處理72 h 后的心肌細(xì)胞分別計(jì)數(shù)處理，以 5×104/ml密度種于 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（100 μl/孔）中，每個(gè)處理設(shè)置 6 個(gè)復(fù)孔，在 37 ℃，5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng) 24、48 h，每孔加入 10 μl CCK8工作液，置于 37 ℃，5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱反應(yīng) 2 h，在酶聯(lián)免疫檢測儀檢測 450 nm 處各孔吸光值（A）。心肌細(xì)胞增殖率=（A實(shí)驗(yàn)組/A對照組– 1）×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

流式檢測結(jié)果采用 FlowJo 7.6.1 軟件分析結(jié)果。采用 GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行作圖、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用±s表示，組間比較采用one-way ANOVA 分析。以 P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pMSC 形態(tài)及表面抗原鑒定

倒置相差顯微鏡下觀察，原代培養(yǎng)的 pMSC接種 48 h 后，大部分細(xì)胞貼壁，形態(tài)為典型成纖維細(xì)胞樣，3～5 d 可發(fā)現(xiàn)貼壁細(xì)胞增殖形成細(xì)胞島，6～9 d 后所有細(xì)胞島匯合成單細(xì)胞層鋪滿全皿，均為長梭形，細(xì)胞排列緊密，成旋渦狀或放射狀生長，中間散在些透亮圓形雜細(xì)胞（圖 1）。

間充質(zhì)干細(xì)胞表型抗原標(biāo)志物流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)原代分離獲得的 pMSC 表面標(biāo)記物 CD14+/CD19+/CD34+/CD45+細(xì)胞數(shù)百分比含量為 0.13%；同時(shí)間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)抗原CD73、CD90、CD105 陽性細(xì)胞數(shù)百分比表達(dá)率分別為 99.86%、99.87%、99.71%。提示本實(shí)驗(yàn)分離獲得了高純度的人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖 2）。

2.2 pMSC 三向分化鑒定

pMSC 成脂誘導(dǎo) 14 d，油紅 O 染色結(jié)果顯示，細(xì)胞胞漿周圍均含有大小不等的脂滴，脂滴被染成紅色。隨著誘導(dǎo)天數(shù)的增加，細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生改變，仍為梭形，誘導(dǎo)成脂肪細(xì)胞的數(shù)目增多；pMSC 成骨誘導(dǎo) 14 d 結(jié)果顯示，茜素紅 S 染色結(jié)果顯示，細(xì)胞出現(xiàn)大量橘紅色沉淀，呈圓形或類圓形或堆積成片狀，有明顯的“礦化”結(jié)節(jié)形成且數(shù)量上呈遞減趨勢。pMSC 成軟骨誘導(dǎo) 14 d，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁良好，細(xì)胞扁平伸展，由長梭形變成多邊多角形態(tài)，具有軟骨細(xì)胞樣的形態(tài)，Masson 染色結(jié)果顯示細(xì)胞膠原纖維呈現(xiàn)藍(lán)紫色（圖 3）。

圖2 人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞流式鑒定（A：總顆粒散點(diǎn)分布圖；B：活細(xì)胞；C：陰性對照染色；D～F：CD105+、CD90+、CD73+細(xì)胞比例；G：細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)）Figure 2 Characterization of pMSC phenotype through flow cytometry (A:Total particles scatter diagram; B:Alive cells; C:Negative staining; D-F:CD105+,CD90+,CD73+cells ratio; G:Cell ratio analysis)

圖3 人胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞成脂（油紅 O 染色）、成骨（茜素紅 S 染色）、成軟骨（Masson 染色）分化鑒定Figure 3 Adipogenic,osteogenic and chondrogenic differentiation of pMSC characterized by oil red O staining,alizarin red S and Masson staining,respectively

圖4 pMSC 微環(huán)境及 pMSC 對 H9C2 心肌細(xì)胞生長狀態(tài)的影響（A：上室/下室 pMSC 細(xì)胞數(shù)量或培養(yǎng)基體積比為 1∶1；B：上室/下室 pMSC 細(xì)胞數(shù)量或培養(yǎng)基體積比為 2∶1）Figure 4 Effects of pMSC conditioned medium on the growth of H9C2 (A：Ratio of pMSC quantity/medium created by pMSC ∶ up chamber vs down chamber=1∶1; B:Ratio of pMSC quantity/medium created by pMSC ∶ up chamber vs down chamber=2∶1)

上下室培養(yǎng)基體積 1∶1 和 2∶1 中對照組H9C2 細(xì)胞生長速度均相對緩慢，培養(yǎng) 24 h 后匯合率為 50% 左右，上下室培養(yǎng)基體積 1∶1 和 2∶1胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞微環(huán)境處理組，H9C2 心肌細(xì)胞與對照組相比，細(xì)胞匯合率顯著增加，匯合率達(dá)80%～90%，與胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)處理組無顯著差異。結(jié)果顯示，胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞微環(huán)境與胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞一樣，顯著促進(jìn)了 H9C2 心肌細(xì)胞的增殖，同時(shí)，微環(huán)境添加比例 1∶1 效果最佳（圖 4）。

2.4 CCK8 法檢測心肌細(xì)胞增殖

進(jìn)一步 CCK8 細(xì)胞增殖檢測結(jié)果顯示（圖 5和表 1），微環(huán)境干預(yù)組，當(dāng)上室培養(yǎng)基體積與下室培養(yǎng)基體積比例為 1∶1 時(shí)，與對照組相比，胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞微環(huán)境顯著促進(jìn)了 H9C2 細(xì)胞增殖（圖 5），干預(yù)后培養(yǎng) 24 和 48 h 后增殖率分別增加 17.99%（P ＜ 0.001）和 15.37%（P ＜ 0.001）；當(dāng)上室培養(yǎng)基體積與下室培養(yǎng)基體積比例為 2∶1時(shí)，24 和 48 h 增殖率相比對照組僅分別增加10.87%（P ＜ 0.05）和 10.28%（P ＜ 0.001）；胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞干預(yù)組，上室胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞與下室 H9C2 心肌細(xì)胞按 1∶1 共培養(yǎng)時(shí)，與對照組相比，24 和 48 h 增殖率分別增加 26.23%（P ＜ 0.01）和 15.97%（P ＜ 0.01），上室胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞與下室 H9C2 心肌細(xì)胞按 2∶1 共培養(yǎng)時(shí)，24 和48 h 增殖率與對照組相比分別增加 20.13%（P ＜0.001）和 8.49%（P ＜ 0.001）。由結(jié)果可看出，胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞微環(huán)境能顯著促進(jìn) H9C2 心肌細(xì)胞的增殖，與胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞作用相當(dāng)，且胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞微環(huán)境干預(yù)處理有最優(yōu)劑量選擇。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞微環(huán)境干預(yù)處理體積與 H9C2 培養(yǎng)體積為 1∶1 對心肌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用顯著優(yōu)于體積比為 2∶1 的干預(yù)體系；胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞和胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞微環(huán)境對心肌細(xì)胞促增殖作用具有一定的時(shí)間效應(yīng)，處理 24 h時(shí)，胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的促心肌細(xì)胞增殖作用高于胎盤間充質(zhì)微環(huán)境，但在處理 48 h 時(shí)，兩者無顯著差異。提示，隨著干預(yù)時(shí)間的增加，胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞微環(huán)境的促心肌細(xì)胞增殖作用與胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞達(dá)到相同水平。

圖5 H9C2 心肌細(xì)胞 CCK8 增殖檢測結(jié)果（A：上室 pMSC∶下室 H9C2 細(xì)胞數(shù)量或培養(yǎng)基體積比為 1∶1，24 h；B：上室 pMSC∶下室 H9C2 細(xì)胞數(shù)量或培養(yǎng)基體積比為 1∶1，48 h；C：上室 pMSC∶下室 H9C2 細(xì)胞數(shù)量或培養(yǎng)基體積比為 2∶1，24 h；D：上室 pMSC∶下室 H9C2 細(xì)胞數(shù)量或培養(yǎng)基體積比為 2∶1，48 h；*P＜ 0.05，**P＜ 0.01，***P＜ 0.001，nsP＞ 0.05）Figure 5 H9C2 cell proliferation detection by CCK8 method (A:Ratio of pMSC quantity/medium created by pMSC ∶ up chamber vs down chamber=1∶1,24 h; B:Ratio of pMSC quantity/medium created by pMSC :up chamber vs down chamber=1∶1,48 h; C:Ratio of pMSC quantity/medium created by pMSC ∶ up chamber vs down chamber=2∶1,24 h; D:Ratio of pMSC quantity/medium created by pMSC ∶ up chamber vs down chamber=2∶1,48 h;*P＜ 0.05,**P＜ 0.0l ,***P＜ 0.001,nsP＞ 0.05)

表1 H9C2 心肌細(xì)胞增殖率結(jié)果分析（%）Table 1 H9C2 cell proliferation rate analysis (%)

3 討論

在心肌損傷修復(fù)的研究中，心肌細(xì)胞增殖及再生是心肌損傷修復(fù)的關(guān)鍵。間充質(zhì)干細(xì)胞是一種具有高度自我更新能力與多向分化潛能的多能干細(xì)胞，目前已應(yīng)用于臨床治療自身免疫性疾病、心肌損傷性疾病、神經(jīng)損傷性疾病等，然而其治療機(jī)制尚不明確。細(xì)胞移植是一種有希望的組織再生的治療手段。多種類型的細(xì)胞已經(jīng)用于動(dòng)物心肌損傷的修復(fù)中，包括胚胎干細(xì)胞、胚胎和新生動(dòng)物的心肌細(xì)胞、骨骼肌成肌細(xì)胞、骨髓干細(xì)胞、脂肪來源的干細(xì)胞、可誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞等。但是，這些用于移植的細(xì)胞對機(jī)體環(huán)境具有一定的限制性要求，當(dāng)在低氧低血環(huán)境中就存在成活率低、在心臟局部存留少、與宿主心肌細(xì)胞不能整合和免疫排斥等問題，這些問題限制了它們的應(yīng)用。

現(xiàn)已明確，間充質(zhì)干細(xì)胞對創(chuàng)傷皮膚、脊髓損傷、軟骨損傷、神經(jīng)元損傷、血管內(nèi)皮損傷等具有修復(fù)功能。Rasulov 等[1]2005 年首次采用異體骨髓MSC 移植治療 1 例大面積深度灼傷皮膚損傷，并于細(xì)胞移植后 4 d 實(shí)施自體皮膚移植術(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以促進(jìn)創(chuàng)面愈合過程中血管的生成，縮短患者的康復(fù)時(shí)間。MSC 不僅可通過促血管生成作用加速創(chuàng)傷皮膚的愈合，同時(shí)可以大大降低創(chuàng)傷面炎癥反應(yīng)，促進(jìn)新生皮膚細(xì)胞募集。2014 年，Liu 等[2]利用間充質(zhì)干細(xì)胞對皮膚灼傷小鼠進(jìn)行移植，移植后創(chuàng)傷皮膚中 IL-1、IL-6、TNF-α 等促炎因子顯著降低，同時(shí)抑炎因子 IL-10和 TSG-6 顯著升高，皮膚愈合速度大大提升。不僅如此，MSC 對慢性難愈性傷口或遷延不愈的傷口也有很好的療效[3-5]。除了直接將 MSC 以不同方式輸注進(jìn)行治療外，將 MSC 培養(yǎng)于一些支架材料上后移植到創(chuàng)傷部位，也具有較好的療效[6-7]。此外，根據(jù)現(xiàn)有研究報(bào)道，不僅骨髓來源的 MSC 具有促進(jìn)皮膚創(chuàng)傷愈合的作用，其他來源的 MSC，如臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞[2,8-10]、臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞[10-11]、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞[12-13]、胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞[14]、羊水間充質(zhì)干細(xì)胞[15-16]等也具有較好的治療作用，且在不同個(gè)體甚至不同物種間移植時(shí)沒有明顯的限制。另有研究人員通過鞘內(nèi)注射方法對脊髓損傷患者進(jìn)行了自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植，術(shù)后移植患者在術(shù)后神經(jīng)功能得到改善[17-19]。軟骨損傷修復(fù)研究表明，植入間充質(zhì)干細(xì)胞后兔子缺損處軟骨和軟骨下骨修復(fù)良好[20-22]。且間充質(zhì)干細(xì)胞對人骨、軟骨、肌腱等的損傷修復(fù)臨床應(yīng)用已經(jīng)廣泛開展，并取得不俗效果，被廣泛報(bào)道。體外培養(yǎng)的 MSC 能夠分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞這一特定功能已多次被科研工作者證實(shí)，并且發(fā)現(xiàn)移植的 MSC 能夠向血管損傷部位募集，并進(jìn)一步分化為內(nèi)皮細(xì)胞，修復(fù)損傷血管[23-25]。經(jīng)耳緣靜脈注射間充質(zhì)干細(xì)胞，能有效抑制椎動(dòng)脈血管炎癥反應(yīng)，修復(fù)受損椎動(dòng)脈血管[26-27]。

然而，以往認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞治療潛能是由于MSC 歸巢并分化、代替損傷組織。后來觀察到移植的 MSC 大部分都停留在肝、脾和肺，到達(dá)損傷部位的數(shù)量小于 1%。在到達(dá)靶組織的 MSC 中，大部分幾天后消失，只有少量的 MSC 長期停留在損傷部位。用基因命運(yùn)圖譜技術(shù)顯示再生的細(xì)胞來自于模型中存活的固有細(xì)胞。這些信息提示，MSC對組織的修復(fù)作用可能不是由于其分化能力。另有研究者發(fā)現(xiàn)，MSC 的條件培養(yǎng)基（CM）能模擬MSC 修復(fù)組織的功能。因此推測 MSC 可能是通過分泌營養(yǎng)因子以內(nèi)分泌和旁分泌的方式促進(jìn)組織修復(fù)。間充質(zhì)細(xì)胞可以自分泌和（或）旁分泌腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)生長因子、血管內(nèi)皮生長因子等多種神經(jīng)保護(hù)性營養(yǎng)因子，這些因子表達(dá)上調(diào)，可以促進(jìn)局部微血管再生、神經(jīng)再生和重構(gòu)，從而使損傷細(xì)胞得以修復(fù)。趙貴芳[28]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體可以促進(jìn) HaCaT 細(xì)胞的增殖及遷移，抑制 caspase 非依賴的線粒體凋亡信號通路，即 AIF-PARP 信號通路促進(jìn)皮膚創(chuàng)面的修復(fù)，在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)機(jī)制上形成了新的突破。

綜上，我們的研究提示，胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞微環(huán)境具有心肌損傷修復(fù)調(diào)節(jié)功能。這可能是由于其分泌的營養(yǎng)因子或外泌體所發(fā)揮作用，胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基上清對心肌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究，其后期開發(fā)較之 MSC 的直接輸注，去除活細(xì)胞的培養(yǎng)基上清的應(yīng)用更為安全，更為高效，可望成為未來細(xì)胞治療的新手段，更好發(fā)揮 MSC 的臨床治療價(jià)值。

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Effects of microenvironment produced by human pMSC on the proliferation of cardiomyocytes

ZHANG Yi,CHEN Liang,LI Ping,XU Hui-li,WANG Zhe,WU Ting,ZHANG Cheng-yu

ObjectiveTo investigate the effect of microenvironment created by human placental mesenchymal stem cells (pMSC) on the proliferation of cardiomyocytes.MethodsThe cultured medium of pMSC was used to simulate the microenvironment produced by pMSC and co-culture with cardiomyocytes (H9C2) through the method of transwell experiment (the microenvironment group).At the same time,the DMEM medium containing 10% FBS and pMSC/H9C2 transwell group were treated as blank and positive control,respectively.After 72 h,the cell proliferation and morphology were observed under microscope.Then H9C2 cells were digested by trypsin to plant 96-well plate with cell concentration of 5×106/ml.CCK8 test was carried out at 24 and 48 h after cell seeding,respectively.ResultsCompared with the control group,H9C2 cells grew more rapidly in the microenvironment group after 72 h of co-culture.The density of H9C2 reached 80%,significantly higher than that in the control group.There was no significant difference between the medium group and pMSC group.CCK8 cell proliferation assay at 24 and 48 h showed that the values of the microenvironment group and the pMSC group were significant higher than that in the control (P ＜ 0.01).Significant difference was observed betweenthe microenvironment group and pMSC group at 24 h (P ＜ 0.01),while no difference observed between the two groups at 48 h (P ＞0.05).ConclusionBoth microenvironment and pMSC can promote the cell proliferation of H9C2.The results imply that the microenvironment of pMSC is expected to partly take place of the repair function of pMSC in the myocardial injury field.

Myocytes,cardiac; Cellular microenvironment; Placental mesenchymal stem cells

WU Ting,Email:wuting@shanghaicordblood.org

上海市自然科學(xué)基金（16ZR1429200）；上海市科委研發(fā)平臺專項(xiàng)（16DZ2293000）；嘉定區(qū)工程技術(shù)研究中心項(xiàng)目；2016 年上海市專利試點(diǎn)企業(yè)項(xiàng)目

200051 上海市臍帶血造血干細(xì)胞庫/上海市干細(xì)胞技術(shù)有限公司/中國干細(xì)胞集團(tuán)有限公司

伍婷，Email：wuting@shanghaicordblood.org

2016-12-02

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.02.009

方法用胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基上清模擬胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞微環(huán)境，與 H9C2 心肌細(xì)胞 transwell 共培養(yǎng)（微環(huán)境組），觀察其對 H9C2 細(xì)胞的生長狀態(tài)、細(xì)胞增殖影響情況。同時(shí)設(shè)置 10% FBS 的 DMEM 為空白對照、pMSC/H9C2 transwell 共培養(yǎng)為陽性對照（pMSC 組），倒置顯微鏡觀察心肌細(xì)胞增殖狀態(tài)；共培養(yǎng) 72 h 后將 H9C2 胰酶消化按5×106/ml 每孔進(jìn)行 96 孔板鋪板，分別在 24 和 48 h 進(jìn)行 CCK8 細(xì)胞增殖檢測。

結(jié)果與對照組相比，胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基上清與心肌共培養(yǎng) 72 h 后心肌細(xì)胞密度達(dá)到 80% 以上，顯著高于對照組，與 pMSC 組無明顯差異。共培養(yǎng)處理后的心肌細(xì)胞培養(yǎng) 24 和 48 h 增殖結(jié)果均顯示，微環(huán)境組與 pMSC 組心肌細(xì)胞增殖高于對照組，差異極顯著（P ＜ 0.01），24 h 增殖結(jié)果顯示 pMSC 組與微環(huán)境組心肌細(xì)胞增殖差異極顯著（P ＜ 0.01），而 48 h 增殖結(jié)果顯示 pMSC 組與微環(huán)境組心肌細(xì)胞增殖差異不顯著（P ＞ 0.05）。

結(jié)論胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞微環(huán)境與胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞對心肌細(xì)胞的增殖均具有顯著的促進(jìn)作用，提示胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞微環(huán)境有望部分替代胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞的心肌損傷修復(fù)治療功能。

Author Affiliation:Shanghai Cord Blood Bank/Shanghai Stem Cell Technology Co.,Ltd./China Stem Cell Group Co.,Ltd.,Shanghai 200051,China