葛月賓，尚瑩瑩，黃 琳，王雙奇，雷叢林

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074)

燈盞花素提取純化工藝及其片劑的制備

葛月賓，尚瑩瑩，黃 琳，王雙奇，雷叢林

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢 430074)

為確定燈盞細(xì)辛中燈盞花素的提取純化工藝，以70%乙醇溶液超聲波提取燈盞細(xì)辛藥材，醇提浸膏進(jìn)行HP-20大孔吸附樹脂洗脫和酸沉工藝純化，在(335±1) nm波長(zhǎng)處采用紫外分光光度法測(cè)定了野黃芩苷的含量.以乳糖、蔗糖和微晶纖維素為填充劑，以交聯(lián)聚維酮為崩解劑，制備了燈盞花素片劑(野黃芩苷標(biāo)示量20 mg)并開展了質(zhì)量檢查.結(jié)果表明：大孔吸附樹脂20%，50%，80%乙醇洗脫部位經(jīng)酸沉后測(cè)定的含量分別為98%，79.8%，42.1%，而50%乙醇洗脫部位的得率最高達(dá)到12.14%.優(yōu)選燈盞花素片劑處方為主藥12%，MCC 40%，PVPP 30%，蔗糖13%，乳糖5%，硬脂酸鎂0.5%，50%乙醇適量.該提取純化方法能獲得較高野黃芩苷含量的燈盞花素，制備的片劑質(zhì)量檢查合格.制備工藝操作性強(qiáng)，重現(xiàn)性好，能適應(yīng)于工業(yè)大生產(chǎn)的需求.

燈盞細(xì)辛；燈盞花素；紫外分光光度法；提取純化；片劑

燈盞細(xì)辛為菊科植物短葶飛蓬Erigeronbreviscapus(Vant.)Hand.-Mazz.的干燥全草，其性味辛、微苦、溫[1]，主治小兒疳積、小兒麻痹及腦膜炎的后遺癥、牙痛、小兒頭瘡等[2].燈盞花素為該植物中提取分離所得的提取物,主要成分為燈盞花乙素又名野黃芩苷(結(jié)構(gòu)式如圖1)，它是燈盞細(xì)辛中發(fā)揮主要生物活性的黃酮類成分，具有擴(kuò)張腦血管、降低腦血管阻力、增加腦血流量、改善微循環(huán)、抗血小板聚集等多種藥理作用，目前已廣泛用于臨床治療各種心、腦血管疾病[3]，也是燈盞細(xì)辛和燈盞細(xì)辛制劑的主要質(zhì)量控制指標(biāo)成分，研究燈盞花素提取純化的工藝更有利于其藥材的開發(fā)和利用.

目前對(duì)燈盞花素的含量測(cè)定、藥理活性等已進(jìn)行了較為充分的研究，但目前常見劑型口服生物利用度、起效時(shí)間等方面存有缺陷，難以得到高純度的提取物，本文采用超聲波法提取藥材(燈盞細(xì)辛)后，HP-20大孔樹脂柱洗脫，酸沉法純化，得燈盞花素主要集中在20%和50%的乙醇洗脫部位段.2015版《中國(guó)藥典》中將燈盞細(xì)辛提取物通過大孔樹脂柱，僅用水洗脫，收集洗脫液濃縮、酸沉、結(jié)晶即得.燈盞花素的主要成分野黃芩苷溶于堿、吡啶、冰醋酸，但不溶于水，故燈盞花素在水部位含量極低.本文給出的燈盞花素提取純化方案較藥典更簡(jiǎn)單、可行、有效，將含量≥90%的燈盞花素經(jīng)處方篩選制得片劑，質(zhì)量檢查合格，可為其制劑處方、工藝設(shè)計(jì)及生物藥劑學(xué)研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

燈盞細(xì)辛全草(云南菊花村中藥材市場(chǎng))，HP-20型大孔樹脂柱(日本三菱化學(xué))，野黃芩苷對(duì)照品(110842，中國(guó)食品藥品檢定研究院)，市售燈盞花素片(國(guó)藥準(zhǔn)字Z44023596，廣東彼迪藥業(yè))，其他試劑均為分析純.

紫外分光光度計(jì)(UV-1800型，上海美譜達(dá))，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52AA型，上海亞榮生化)，低速離心機(jī)(TDZ-5型，長(zhǎng)沙平凡儀器儀表)，電子天平(FA1004N型，上海民橋精密科學(xué)儀器)，單沖壓片機(jī)(TDP-5型，中南制藥機(jī)械廠)，片劑四用測(cè)定儀(SY-2D型，上海黃海藥檢儀器).

1.2 燈盞花素的提取

稱取100 g燈盞細(xì)辛，用70%乙醇浸泡24 h，超聲波提取3次[4]，每次1 h，每次提取溶劑量為10倍藥材量(g·mL-1).70%乙醇提取液用濾紙過濾、合并，經(jīng)減壓濃縮得浸膏，重復(fù)3次，計(jì)算出膏率和野黃芩苷提取率[5,6]：出膏率(%)=干浸膏重量/提取用生藥重量×100% ，野黃芩苷提取率(%)=野黃芩苷重量/提取用生藥重量×100% .

1.3 燈盞花素的純化

1.3.1 大孔樹脂純化

稱取350 g HP-20型大孔樹脂，無(wú)水乙醇濕法裝柱，上述燈盞花素浸膏干法拌樣上柱，依次用水，20%、50%、80%乙醇洗脫得到5個(gè)部位.

1.3.2 堿溶酸沉精制

上述各個(gè)大孔樹脂洗脫部位以m(生藥量)∶V(水)=1∶0.4(g·mL-1)，加沸蒸餾水使溶解，加NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 8.0，趁熱過濾，濾液加熱，緩慢加入10% H2SO4溶液調(diào)節(jié)pH 3.0，在50～55℃保溫15 min，4000 r/min離心收集沉淀，母液靜置過夜再離心，合并沉淀，蒸餾水洗滌至中性pH 7.0，50℃真空干燥[6].燈盞花素的提取純化流程即為70%的乙醇超聲提取3次，得醇提物浸膏，浸膏過HP-20打孔樹脂柱，經(jīng)水，20%、50%、80%乙醇洗脫得到5個(gè)部位，各個(gè)部位分別通過堿溶酸沉工藝精制，最后測(cè)定其中燈盞花素的含量.

1.4 燈盞花素中野黃芩苷的含量測(cè)定

1.4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

精密稱量野黃芩苷對(duì)照品5.0 mg，用甲醇配制成8 mg·mL-1的溶液，以甲醇為空白溶劑，在200～700 nm處進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果表明：野黃芩苷在(335±1) nm處有最大吸收，故確定其為含量測(cè)定的檢測(cè)波長(zhǎng).

1.4.2 含量測(cè)定

根據(jù)燈盞花素中藥部頒標(biāo)準(zhǔn)[7]，取燈盞花素樣品約5 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加甲醇適量，于水浴約50℃振搖使溶解，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取2.0 mL，置25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，置1 cm吸收池中，以甲醇為空白，照分光光度法(附錄V A)，在(335±1) nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，按燈盞花乙素(C21H18O12)的吸收系數(shù)(E1% 1cm)為570計(jì)算，即得.吸光度與樣品濃度的計(jì)算公式：

(1)

根據(jù)公式(1)計(jì)算所含野黃芩苷的濃度C值，并按下式計(jì)算其含量:

野黃芩苷含量(%)=[(C×25×50)/2]/W×100% .

(2)

1.5 片劑處方的篩選

以含野黃芩苷(C21H18O12)不低于90%的燈盞花素為原料藥，采用濕法制粒壓片法制備片劑，根據(jù)片劑的質(zhì)量項(xiàng)目評(píng)價(jià)和篩選各組成輔料的種類和用量[8].

1.6 質(zhì)量檢查

根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版四部“制劑通則0101”開展燈盞花素的質(zhì)量評(píng)價(jià).片劑外觀應(yīng)完整、光潔、色澤均勻、無(wú)異物.取自制片20片，精密稱定總重量求得均重后，再分別精密稱定各片的重量.燈盞花素片平均重為0.155 g，重量差異限度為±7.5%.自制片劑能承受40～60 N的壓力，認(rèn)為合格.未檢出斷裂、龜裂及粉碎的片.參照《中國(guó)藥典》2015年版四部“通則0921”崩解時(shí)限檢查法進(jìn)行測(cè)定.自制片劑崩解時(shí)限在15 min之內(nèi).

1.7 溶出度測(cè)定

1.7.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定

精密稱取野黃芩苷對(duì)照品適量(約5 mg)，置于50 mL量瓶中，超聲30 min使溶解，定容，精密吸取2 mL，置于25 mL量瓶中，以pH 6.8磷酸鹽緩沖液為介質(zhì)，全波長(zhǎng)掃描測(cè)定紫外吸收.結(jié)果表明：該溶液在335 nm的波長(zhǎng)處有最大吸收，同法測(cè)得輔料及溶劑系統(tǒng)對(duì)野黃芩苷在335 nm波長(zhǎng)處的最大吸收無(wú)影響，與文獻(xiàn)[7]一致.

1.7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱定干燥的野黃芩苷對(duì)照品約5 mg，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解得0.1 mg·mL-1的對(duì)照品.分別精密吸取對(duì)照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL分別置于25 mL量瓶中，加甲醇定容、搖勻，得濃度為4，8，12，16，20 μg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液，在(335±1) nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.01043+0.074x，r=0.99989(pH= 6.8 PBS)，在3.684～18.42 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(見圖2).

圖2 PBS作溶劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of PBS as solvent

1.7.3 溶出度的測(cè)定

取燈盞花素片6片，依照溶出度測(cè)定法[9,10]，以pH=6.8 的PBS 900 mL為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速5 r·min-1，溫度為(37±1)℃，分別在5，10，15，30，45，60 min時(shí)，取溶出液10 mL，立即過濾并補(bǔ)液10 mL，樣品溶出液經(jīng)0.8 μm微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液4.0 mL，置10 mL量瓶中，加溶出介質(zhì)稀釋至刻度，于(335±1) nm處測(cè)其吸收度，代入以pH=6.8 的PBS為溶劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中，計(jì)算累積溶出百分率.

1.8 制劑含量測(cè)定

1.8.1 最大吸收波長(zhǎng)的確定

采用鋁鹽顯色法[11]測(cè)定，因鋁鹽法對(duì)極微量的黃酮類化合物顯色明顯，測(cè)定更準(zhǔn)確.精密稱取野黃芩苷對(duì)照品約5 mg置于50 mL量瓶中，超聲30 min使溶解，定容，精密吸取2 mL，置于25 mL量瓶中，加入10% AlCl3溶液3.0 mL，醋酸-醋酸鉀緩沖溶液3.0 mL，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，放置30 min，用紫外分光光度計(jì)全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果在(353±1) nm和(297±1) nm波長(zhǎng)處有吸收峰，為避免末端吸收的干擾，故選擇(353±1) nm為參考波長(zhǎng)，同法測(cè)得輔料及溶劑系統(tǒng)對(duì)野黃芩苷在353 nm波長(zhǎng)處的最大吸收無(wú)影響.

1.8.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取野黃芩苷對(duì)照品約5 mg置于50 mL量瓶中，加甲醇，超聲30 min使溶解，定容，精密量取對(duì)照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置于25 mL量瓶中，加入顯色劑，在(353±1) nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.00203+52.99504x，相關(guān)系數(shù)r=0.99965，線性范圍4.16～20.80 μg·mL-1(見圖3).

圖3 甲醇作溶劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of methanol as solvent

1.8.3 含量測(cè)定

取燈盞花素片10片粉碎、混勻，精密稱量0.155 g(每片含燈盞花素20 mg)置100 mL容量瓶中，加甲醇稀釋，精密量取2.0 mL溶液置25 mL容量瓶中，加入顯色劑，測(cè)定吸收度值，根據(jù)1.8.2項(xiàng)中標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算溶液的濃度和藥物百分含量.

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂精制結(jié)果

燈盞細(xì)辛精制和純化結(jié)果見表1，表1中50% 乙醇洗脫得到的純化物中野黃芩苷得率最高，達(dá)到12.14%；進(jìn)一步堿溶酸沉后，20%乙醇部位所得野黃芩苷含量最高，達(dá)到98%，表明該部分燈盞花素所含成分非常純，達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求的90% 以上，可作為原料藥進(jìn)行壓片.

表1 燈盞細(xì)辛精制和純化結(jié)果Tab.1 Fleabane refining and purification results of E.breviscapus

2.2 處方篩選

PVPP為30%時(shí)，在15 min內(nèi)完全崩解，符合規(guī)定；考察了常用的潤(rùn)滑劑滑石粉、硬脂酸鎂及其不同加入量的助流性能，比較其休止角、流速及片重差異，選定以0.5%硬脂酸鎂為潤(rùn)滑劑；得到優(yōu)選處方如下：燈盞花素1.87 g(質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%，下同)，蔗糖2.02 g(13%)，MCC 6.22 g(40%)，PVPP 4.67 g(30%)，硬脂酸鎂0.078 g(0.5%)，乳糖0.78 g(5%)，50%乙醇適量.制成100片，每片總重0.155 g.

取一定量的燈盞花素、蔗糖、乳糖、MCC、PVPP、硬脂酸鎂粉碎過篩，50%乙醇攪勻，備用;精密稱取處方量的燈盞花素、蔗糖、乳糖、MCC、PVPP按等量遞增法混合均勻，用50%乙醇作為潤(rùn)濕劑，20目篩濕法制粒，50℃鼓風(fēng)干燥 60 min，18 目篩整粒，加入硬脂酸鎂0.5%，混和均勻，壓片，控制片重 155 mg.

2.3 片劑的質(zhì)量檢查

片劑呈淡黃色、表面光滑、色澤均勻、無(wú)雜斑、無(wú)異物.脆碎度減失重量未超過1%，且未檢出斷裂、龜裂及粉碎的片.隨機(jī)取自制片和市售片各6片，檢測(cè)硬度和崩解時(shí)限，結(jié)果見表2.

表2 片劑的硬度和崩解時(shí)限的測(cè)定Tab.2 Determination of tablet hardness and disintegration

由表2可知：自制片和市售片的硬度符合標(biāo)準(zhǔn)；自制片的崩解時(shí)限符合普通片劑的要求，而市售片滿足分散片在3 min內(nèi)崩解完全的要求.

2.4 溶出度的測(cè)定

自制藥的溶出曲線圖見圖4.由圖4可知：自制藥的溶出度為92%～94%，符合藥典對(duì)于一般片劑的標(biāo)準(zhǔn)，故合格.；而市售藥在5 min之內(nèi)的溶出量已經(jīng)達(dá)到85%，再結(jié)合其崩解時(shí)限分析，該市售片可能為分散片.本品的溶出度檢測(cè)方法重復(fù)性好，準(zhǔn)確性高，簡(jiǎn)便可行，可用于燈盞花素片的質(zhì)量控制.

a)市售藥;b)自制藥

2.5 片劑的含量測(cè)定

自制藥的野黃芩苷含量測(cè)定結(jié)果平均標(biāo)示量為106%(見表3)，符合藥典規(guī)定，合格.

表3 自制藥的含量測(cè)定Tab.3 Determination of the content of self-made tablet

3 結(jié)論

(1)采用超聲波乙醇回流提取法提取燈盞花素，該提取法提取率高、操作簡(jiǎn)便、能耗和成本低.用野黃芩苷作對(duì)照品，鋁鹽法顯色后的掃描圖譜出現(xiàn)了兩個(gè)吸收峰，取(335±1) nm波長(zhǎng)處為最大吸收峰.

(2)溶出試驗(yàn)中燈盞花素屬黃酮類成分，主要含燈盞花乙素，在堿性或近中性介質(zhì)中易溶.燈盞花乙素在磷酸鹽緩沖液(pH 6.8)中溶解度為4.6 mg·mL-1，能夠滿足漏槽條件.

(3)采用超聲波法提取藥材(燈盞細(xì)辛)后，HP-20大孔樹脂柱洗脫，酸沉法純化，得到了較高含量的燈盞花素，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、可行、有效；含量≥90%的燈盞花素經(jīng)處方篩選制得片劑，質(zhì)量檢查合格.

(4) 本文采用了紫外分光光度法和鋁鹽顯色法測(cè)定了燈盞花素的含量.在國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)中,燈盞花素片和燈盞花注射液中燈盞花素的含量測(cè)定均采用紫外分光光度法,但該方法對(duì)燈盞乙素的選擇性差[12];而鋁鹽顯色法更加精確.所以,燈盞花素的提取純化和片劑的溶出度測(cè)定用紫外分光光度法;而片劑的含量測(cè)定用鋁鹽顯色法.

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Extraction, Purification and Tablets Preparation of Breviscapine fromErigeronbreviscapus

GeYuebin,ShangYingying,HuangLin,WangShuangqi,LeiConglin

(School of Pharmaceutical Sciences，South-Central University for Nationalities，Wuhan 430074，China)

To investigate the extracting and refining technique of breviscapine fromErigeronbreviscapus,E.breviscapuswas extracted with 70% ethanol solution by ultrasonic method.The alcohol extract was eluted using HP-20 macroporous resin and purified with an acid precipitation process.UV spectrophotometry was used to determine the yield of scutellarin at a wavelength of (335±1) nm.Breviscapine tablets (with the labelled content of scutellarin 20 mg) were then prepared using lactose, sucrose and microcrystalline cellulose as filler and crosslinked povidone as disintegrating agent, respectively.The qualities of the tablets were also evaluated.The results showed that the content of scutellarin was 98%, 79.8%, 42.1% in the eluent of 20%, 50%, 80% ethanol, respectively, after the acid precipitation.And the elution with 50% ethanol afforded the highest yield of 12.14%.The optimized formulation of breviscapine tablets consisted of 12% breviscapine, 40% MCC, 30% PPVP, 13% sucrose, 5% lactose, 0.5% magnesium stearate and an appropriate amount of 50% ethanol.This technique proved highly efficient for the extraction and purification of scutellarin.The formulation and the prepared breviscapine tablets were up to standard, and the process was workable and reproducible, which may be adapted for industrial scale production.

E.breviscapus;breviscapine;UV spectrophotometry;extraction and purification;tablets

2016-01-01

葛月賓(1979-)，女，教授，博士，研究方向：藥物制劑及中藥、民族藥開發(fā)，E-mail: geyuebin@mail.scuec.edu.cn

湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2013CFA013)

TQ460.6；R283.6

A

1672-4321(2017)01-0052-05