吳云華, 肖 虔

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 生物技術(shù)國家民委重點實驗室，武漢 430074)

重組擬南芥細胞色素P450 707A3在大腸桿菌中的原核表達

吳云華, 肖 虔

(中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 生物技術(shù)國家民委重點實驗室，武漢 430074)

擬南芥細胞色素P450 707a基因是編輯脫落酸8-羥化酶的基因, 克隆其中的cyp707a3基因并構(gòu)建表達載體pCWori(+)-cyp707a3, 在E.coliRosseta菌株中原核表達并得到了具有活性的酶蛋白.結(jié)果顯示:大部分酶蛋白定位于大腸桿菌細胞膜.

擬南芥細胞色素P450 707A3;原核表達;重組大腸桿菌;膜蛋白

植物激素的檢測是目前植物激素作用機理研究中的瓶頸問題之一[1].已經(jīng)有文獻報道了利用生物傳感器來檢測植物激素的方法[2,3]，同時文獻報道了利用細胞色素P450酶蛋白作為材料制作生物傳感器以檢測其底物的技術(shù)[4].細胞色素P450(cytochrome P450, CYP)是植物中最大的酶蛋白家族, 在植物體內(nèi)擔(dān)當(dāng)著重要的功能[5].擬南芥cyp707a是編輯脫落酸代謝過程關(guān)鍵酶8′-羥化酶(ABA 8′-hydroxylase)的基因.該基因一共有4個家族成員[6-8], 對于種子的萌發(fā)起到了重要作用.Cyp707a3是該家族中的重要一員, 其研究還較少.

本研究探索擬南芥細胞色素CYP707A3酶在大腸桿菌中的表達并優(yōu)化表達條件[9], 為后續(xù)研究酶蛋白對脫落酸等植物激素的催化檢測提供可能的實驗基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

表達載體pCWori(+)由美國Vanderbilt大學(xué)醫(yī)學(xué)中心提供， 擬南芥(ArabidopsisThaliana)的種子、大腸桿菌E.coliDH5α和E.coliRosseta均由中南民族大學(xué)武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護與利用湖北省重點實驗室提供.

T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶NdeI、Hind Ⅲ (Takara)，Trizol Reagent (Ambion)，Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo scientific)，KOD-plus(Toyobo)，DNA凝膠回收試劑盒、DNA清潔回收試劑盒(Axygen公司)，氨芐青霉素(Amp)和氯霉素(上海生工公司)，異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、δ-氨基-γ-酮戊酸(ALA)及二硫蘇糖醇(DTT)(Alfa Aesar)，苯甲基硫酰氟(PMSF)(Beyotime Biotechnology)，引物合成與基因測序(武漢擎科生物有限公司)，其他試劑均為天津市廣成化學(xué)試劑有限公司和國藥集團化學(xué)分析級試劑.

2×TSE Buffer(200 mL)：稱取34.22 g蔗糖和0.0372 g EDTA·2Na于1 L燒杯中, 加入20 mL 1 mol/L的Tris Buffer (pH 7.6), 用ddH2O定容至200 mL, 過濾除菌.

Spheroplast buffer(100 mL)：稱取0.1286 g乙酸鎂于燒杯中加少許水溶解;加20 mL甘油;再加1 mol/L的K2HPO4和1 mol/L的KH2PO4共10 mL, 調(diào)pH為7.6, 定容至100 mL.使用前加入DTT至1 mmol/L.

1.2 CYP450 707A3原核表達載體的構(gòu)建

對CYP707A3進行生物信息學(xué)分析, 發(fā)現(xiàn)其為N端疏水的可溶性蛋白, 推測其為N端單次跨膜的膜蛋白.

擬南芥于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 取新鮮葉片用Trizol法提取總RNA.用寡核苷酸引物進行逆轉(zhuǎn)錄, 所得到的擬南芥cDNA文庫用GAPDH檢測.設(shè)計引物F(5′- GGAATTCCATATGGCTTTCTCCGGTTTGTTTCTC-3′)和引物R (5′-CCCAAGCTTTTAGTGATGGTGATGGTGATGGTTTTCGTTCCAAGGCAAT-3′), 從擬南芥cDNA文庫中擴增出cyp707a3目的基因片段.用NdeⅠ和Hind Ⅲ 分別酶切目的片段和pCWori(+)載體, 然后連接載體和片段, 轉(zhuǎn)化DH5α菌株.

1.3 CYP450 707A3蛋白誘導(dǎo)表達

將pCWori(+)空載體質(zhì)粒和重組表達質(zhì)粒pCW-cyp707a3轉(zhuǎn)化到表達菌株E.coliRosseta中.于平板上挑取長勢良好的單菌落接種到2 mL LB液體培養(yǎng)基, 37 ℃培養(yǎng)過夜.然后取1 mL菌液加入至50 mL的新鮮且含50 ng/L Amp、20 ng/L氯霉素、1 mmol/L VB1和12.5 μL微量元素改良的TB培養(yǎng)基中, 37 ℃培養(yǎng)約3 h, 使其OD600值達到0.7～1.0范圍.加入IPTG, 同時加入終濃度為1 mmol/L 的ALA, 誘導(dǎo)表達.

IPTG終濃度選擇了0.7,1,1.5 mmol/L 3個梯度;表達溫度選擇了23, 26, 29 ℃ 3個梯度;表達時間選擇了20, 24, 28 h 3個梯度[9].最終發(fā)現(xiàn), 1 mmol/L IPTG、26 ℃、24 h為最佳表達條件.

1.4 CYP450 707A3膜蛋白的提取

將50 mL培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)至100 mL的離心管, 冰上放置30 min以停止表達.2800 r/min于4 ℃離心15 min, 棄上清, 沉淀的菌體可-70 ℃凍存數(shù)小時;沉淀用3 mL 2×TSE Buffer加等體積無菌水打散重懸, 加入約3 mg的溶菌酶, 冰上輕搖40～90 min至懸濁液變得較為粘稠, 2800 r/min于4 ℃離心25 min;棄粘稠的上清, 菌體沉淀加入4 mL冰冷的spheroplast buffer重懸(已加入DTT至1 mmol/L), 置-70 ℃凍存數(shù)小時;凍存樣品經(jīng)流動水融化后加入PMSF，于冰浴中超聲破碎, 每破碎約0.5 s間隔1.5 s.總破碎時間視前一步溶菌酶溶菌程度而定, 一般不應(yīng)少于90 s.破碎后的混合液于4 ℃、1.2×104r/min的轉(zhuǎn)速離心12 min, 結(jié)果分為上清層、中間渾濁層、沉淀;沉淀用2 mL spheroplast buffer重懸.

用SDS-PAGE檢測上清層、中間層的蛋白;用CO差示光譜法測量上清層、中間渾濁層、沉淀中CYP的含量.然后將上清層和中間層一起在4 ℃下1.0×105r/min的轉(zhuǎn)速超速離心90 min, 使得溶液中的膜組分沉淀下來;膜沉淀用3 mL spheroplast buffer重懸并用Triton X-100溶解處理[10].

1.5 CYP450 707A3的CO差示光譜測定

CYP6A1含量按Omura和Sato分光光度法測定[11].在石英比色皿中加入1.5 mL P450測定液和50 μL連二亞硫酸鈉, 混勻, 1 min后紫外分光光度儀上掃描基線.加入待測樣品60～300 μL后混勻, 通入CO約2 min, 穩(wěn)定1 min后于400～500 nm內(nèi)掃描, 得還原型細胞色素P450-CO復(fù)合物的吸收光譜圖.記錄450 nm和490 nm處吸收值, 按以下公式計算P450含量.

2 結(jié)果及分析

2.1 cDNA文庫的構(gòu)建

Trizol法提取得到2管總RNA樣品, 利用微量分光光度計測定其濃度和純度, 結(jié)果如表1.提取的樣品A260/A280在1.7～2.0范圍內(nèi), 說明其純度較高, 230 nm、260 nm和280 nm吸光值的比值接近1∶2∶1.RNA反轉(zhuǎn)錄擴增得到cDNA作為模板, 用內(nèi)參3-磷酸甘油醛脫氫酶GAPDH引物擴增檢測(圖1), 500 bp處的條帶即為GAPDH, 表明所得cDNA可用于后續(xù)實驗.

表1 RNA濃度的測定Tab.1 The concentration of RNA

M) DL2000 marker;1，2) 內(nèi)參GAPDH PCR擴增檢測結(jié)果

2.2 pCW-cyp707a3載體構(gòu)建

構(gòu)建的pCW-cyp707a3載體用引物F和R做PCR鑒定, 然后用NdeⅠ內(nèi)切酶和Hind Ⅲ內(nèi)切酶做雙酶切鑒定(圖2), 其中Hind Ⅲ為部分酶切.cyp707a3基因為1392 bp.測序結(jié)果經(jīng)比對顯示正確無突變.

M)DL5000;1～3) 為PCW空載體雙酶切;4～5) pCW-cyp707a3重組質(zhì)粒雙酶切鑒定圖

2.3 原核蛋白誘導(dǎo)表達

在1 mmol/L IPTG、26 ℃、24 h條件下誘導(dǎo)蛋白CYP707A3的表達，通過SDS-PAGE電泳檢測,轉(zhuǎn)基因大腸桿菌表達的蛋白與對照組 (空載體) 蛋白相比, 可明顯看到目的蛋白CYP707A3的表達.與目的蛋白理論預(yù)測52 kDa大小相符(圖3).

M) 蛋白質(zhì)marker;1) 重組菌沉淀;2) 重組菌中間渾濁層;3) 空載體菌體破碎上清;4) 重組菌上清層

用CO差異光譜法測定CYP707A3蛋白含量(圖4).在400～500 nm掃描其最大吸收波長.空載體的差示光譜存在OD416的吸收峰, 這是大腸桿菌內(nèi)源蛋白cytochrome-O蛋白;變性后的CYP吸收峰會移至OD420, 且完全遮蔽OD416峰[12].由圖4可見, 目的蛋白多數(shù)定位于中間渾濁層, 即大腸桿菌膜結(jié)構(gòu)區(qū).通過計算可知, 每1 L培養(yǎng)基可以得到0.427 nmol的CYP707A3, 且其中82.3%即0.352 nmol的蛋白位于膜結(jié)構(gòu)區(qū)(表2).

表2 每升培養(yǎng)基中CYP707A3的產(chǎn)量Tab.2 The yield of CYP707A3 harvested from medium

3 結(jié)語

本實驗成功將擬南芥葉片提取得到的cyp707a3基因轉(zhuǎn)入到大腸桿菌Rosseta菌株并大量表達CYP707A3蛋白.實驗結(jié)果表明, 目的蛋白成功地進行了原核表達并得到了有活性的酶蛋白.本實驗發(fā)現(xiàn)CYP707A3蛋白非常容易變性或降解, 因而其表達對于溫度的要求非常高.CYP707A3蛋白變性在CO差示光譜上顯示為峰從OD446移至OD420, 使用DTT/β-ME/半胱氨酸等進行復(fù)性確實會使OD420有所下降[12], 但OD446幾乎沒有上升.生物信息學(xué)分析表明此蛋白本身定位于擬南芥膜結(jié)構(gòu)上;去除N端25個氨基酸會導(dǎo)致蛋白破碎上清和沉淀中均無法檢測到細胞色素P450成分, 因而可以判斷N端信號肽序列和膜結(jié)構(gòu)對于該蛋白的表達是必須的, 其具體機制還有待探索.

本實驗所得到的CYP707A3蛋白將來可以用于制作生物傳感器以用于檢測脫落酸.

A) 重組菌上清;B) 重組菌中間渾濁層;C) 重組菌沉淀;D)空載上清

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Studies on the Expression ofArabidopsisThalianaCytochrome P450 707A3 inEscherichiacoli

WuYunhua,XiaoQian

(Key Laboratory for Biotechnology of National Commission for Nationalities, College of Life Science, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)

ABA 8-hydroxylase，the metabolic enzyme of abscisic acid, are encoded by cytochromeP450 707a3 (cyp707a3) inArabidopsisThaliana.Cyp707a3 gene was cloned from the cDNA library, and then the expression vector of pCWori-Cyp707a3 was constructed.The prokaryotic expression of CYP707A3 protein was successfully achieved inE.coliRosseta, and active enzyme protein CYP707A3 was obtained.The experimental results showed that most of the enzyme protein was located on the membrane ofE.coli.

ArabidopsisThalianacytochrome P450 707A3;abscisic acid;prokaryotic expression;membrane protein

2017-02-02

吳云華(1971-),女,教授,博士,研究方向：生化分析與生物傳感, Email: wuyunhua@mail.scuec.edu.cn

國家自然科學(xué)基金資助項目(31670372)

Q943.2

A

1672-4321(2017)01-0028-04