李 璐，梁 倩，安 茜，周雅莉，王計平

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

紫蘇β-酮脂酰ACP合成酶基因家族生物信息學(xué)分析

李 璐，梁 倩，安 茜，周雅莉，王計平

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

紫蘇作為一種新型油料作物，富含多種不飽和脂肪酸，其中，α-亞麻酸含量高達(dá)61.2%。β-酮脂酰ACP合成酶在植物脂肪酸合成中起著關(guān)鍵性作用。對紫蘇β-酮脂酰ACP合成酶（KAS）基因家族及其編碼蛋白進(jìn)行了詳細(xì)的生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，紫蘇KAS家族蛋白中，KASⅡ基因編碼的氨基酸數(shù)最多，KASⅢB最少，均為疏水性脂溶蛋白，無信號肽，推測該家族蛋白為非分泌型蛋白；家族蛋白都含有KAS保守結(jié)構(gòu)域，屬于cond-enzymes超蛋白家族，二級結(jié)構(gòu)組成基本相同。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，紫蘇KASⅠ與擬南芥KASⅠ、紫蘇KASⅡ與油茶KASⅡ、紫蘇KASⅢ與油茶KASⅢ親緣關(guān)系最近，紫蘇與油棕、油棕櫚KAS酶家族親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。研究結(jié)果可為深入探究紫蘇脂肪酸合成機制奠定理論基礎(chǔ)。

紫蘇；β-酮脂酰ACP合成酶（KAS）；生物信息學(xué)分析

植物脂肪酸的合成是在一系列可溶性脂肪酸合成酶的作用下將C2結(jié)構(gòu)反復(fù)添加到脂肪酸鏈中，經(jīng)過8～9次循環(huán)，形成C16和C18脂肪酸[1]。在植物脂肪酸合成中，β-酮脂酰 ACP合成酶（KAS）作為脂酰基載體，作用于脂肪酸合成的縮合反應(yīng)中[2]。β-酮脂酰ACP合成酶共分為4類：KASⅠ，KASⅡ，KASⅢ，KASⅣ，其中，KASⅠ和KASⅡ以?；?-ACP為底物，KASⅠ主要在 C4-ACP～C16-ACP循環(huán)縮合反應(yīng)中起作用；而KASⅡ?qū)16-ACP具有較高的選擇特異性，催化棕櫚?；鵄CP與丙二酰ACP發(fā)生聚合反應(yīng)生成硬脂酸，是C16-ACP～C18-ACP過程中的關(guān)鍵酶，決定著C16/C18脂肪酸的值，與植物抗低溫脅迫和生長發(fā)育緊密相關(guān)[3]。KASⅢ是啟動脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，作用于第1次循環(huán)中的縮合反應(yīng)，催化乙酰CoA和丙二酰CoA生成乙酰乙酰-ACP。目前，對KASⅣ的研究較少，對萼距花種子研究結(jié)果表明，KASⅣ主要作用于C6-ACP～C14-ACP過程中的縮合反應(yīng)[4-5]。

紫蘇（Perilla frutescens）系唇形科紫蘇屬1年生草本植物，種子含油量高達(dá)35%～64%，含有豐富的不飽和脂肪酸，占總脂肪酸含量的90%以上，具有廣闊的開發(fā)前景[6]。植物KASⅢ主要以乙酰ACP為底物，但也可以作用于其他?；鵄CP，因此，可以合成多種碳鏈結(jié)構(gòu)的脂肪酸，說明KASⅢ對植物脂肪酸碳鏈結(jié)構(gòu)的形成具有一定的作用[7-8]。對披針葉萼距花種子研究發(fā)現(xiàn)，KASⅢ影響脂肪酸的碳鏈長度[9]；另外，有研究表明，植物中KASⅢ活性影響脂肪酸合成的速率，推測KASⅢ可能以限速酶作用于脂肪酸的合成途徑[10]。不同物種的KAS基因可利用的?；鵄CP也不同。

為了探索KAS基因家族在紫蘇脂肪酸合成過程中發(fā)揮的作用，本研究對紫蘇KAS家族進(jìn)行了詳細(xì)的生物信息學(xué)分析，對其編碼蛋白進(jìn)行初步預(yù)測，旨在為進(jìn)一步深入研究KAS家族在紫蘇等油料作物中的功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

紫蘇KAS家族蛋白序列來源于NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），分別為：KASⅠ（序列號：AF026148.1），KASⅡ（序列號：AF026149.1），KASⅢA（序列號：AF026150.1），KASⅢB（序列號：AF026151.1）。

1.2 方法

借助在線分析軟件 ProtParam（http://web.ex pasy.org/protparam/）對紫蘇KAS基因家族編碼蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析；采用SignalP 4.1 Server（http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和TargetP 1.1Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）進(jìn)行信號肽預(yù)測和亞細(xì)胞定位分析；利用TMPred（http://www. ch.embnet.org/soft-ware/TMPRED_form.html）對跨膜區(qū)域進(jìn)行分析；通過NCBI的CDD（Conserved Domain Database）數(shù)據(jù)庫對其功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析鑒定；登陸在線軟件SOPMA對紫蘇KAS家族蛋白二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。采用在線分析軟件Swiss-model（http://www.swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)分析并建模。運用MEGA 6.0多序列比對軟件對紫蘇等11個物種進(jìn)行比對，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析物種間的同源性，獲得相關(guān)的進(jìn)化信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白一級結(jié)構(gòu)分析

利用ProtParam預(yù)測紫蘇KAS家族蛋白理化性質(zhì)，結(jié)果如表1所示。由表1可知，KASⅡ基因編碼氨基酸數(shù)最多（530aa），KASⅢB最少（400aa），KASⅠ和KASⅡ，KASⅢA和KASⅢB的理論等電點較接近，脂溶系數(shù)都小于100，推測KAS家族蛋白為疏水性脂溶蛋白，除KASⅢB蛋白以外都為穩(wěn)定蛋白。SignalP 4.1預(yù)測紫蘇KAS家族蛋白都沒有信號肽，因此，推測該家族蛋白為非分泌型蛋白。通過TargetP 1.1定位分析顯示，KASⅠ，KASⅢA，KASⅢB蛋白亞細(xì)胞主要位于葉綠體上，KASⅡ蛋白則位于線粒體上。

表1 KAS蛋白家族理化性質(zhì)分析

2.2 蛋白二級結(jié)構(gòu)分析

利用TMHMM 2.0預(yù)測跨膜區(qū)域顯示，紫蘇KAS家族蛋白無跨膜區(qū)。使用SOPMA軟件預(yù)測KAS家族蛋白二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果如表2所示。由表2可知，KAS家族蛋白都由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊和無規(guī)則卷曲組成，其中，KASⅠ，KASⅡ和KASⅢA各組分含量大小均為：無規(guī)則卷曲＞α-螺旋＞β-折疊＞β-轉(zhuǎn)角，而KASⅢB含量大小則為：α-螺旋＞無規(guī)則卷曲＞β-折疊＞β-轉(zhuǎn)角，結(jié)果表明，該家族蛋白二級結(jié)構(gòu)組成基本相同，但KASⅢB略有不同，仍存在一定差異。

表2 KAS蛋白家族二級結(jié)構(gòu)組成比例預(yù)測 %

2.3 蛋白結(jié)構(gòu)域與三級結(jié)構(gòu)分析

通過NCBI-CDD對紫蘇KAS家族蛋白進(jìn)行功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，KAS家族蛋白都含有KAS保守結(jié)構(gòu)域，屬于condenzymes超蛋白家族。使用Swiss-model對紫蘇KAS家族蛋白進(jìn)行同源建模，結(jié)果表明，KASⅠ和KASⅡ三級結(jié)構(gòu)預(yù)測基本相似，而KASⅢA和KASⅢB則差異較大（圖2），推測可能與KAS家族蛋白在紫蘇脂肪酸合成過程中發(fā)揮的不同作用有關(guān)。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

對紫蘇（Perilla frutescens）、蓖麻（Ricinus communis）、大豆（Clycine max）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、花生（Arachis hypogaea）、陸地棉（Gossypium hirsutum）、麻風(fēng)樹（Jatropha curcas）、向日葵（Helianthus annuus）、煙草（Nicotiana tabacum）、山茶 花 （Camellia chekiangoleosa）、 油 棕（Elaeis guineensis）、油橄欖（Elaeis oleifera）共12個物種的KAS酶家族使用MEGA 6.0進(jìn)行序列同源性分析，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖3可知，該系統(tǒng)進(jìn)化樹明顯分為KASⅠ，KASⅡ，KASⅢ共三大類，其中，紫蘇KASⅠ與擬南芥KASⅠ、紫蘇KASⅡ與油茶KASⅡ、紫蘇KASⅢ與油茶KASⅢ親緣關(guān)系最近，紫蘇與油棕、油棕櫚KAS酶家族親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，該結(jié)果為后續(xù)進(jìn)一步通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)鑒定紫蘇KAS基因家族功能奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

3 討論與結(jié)論

LIU等[11]對棉花的研究表明，通過RNAi沉默降低KASⅡ活性，使棕櫚酸含量顯著提高，達(dá)到總脂肪酸的65%。迄今為止，麻風(fēng)樹[12]、豌豆[13]、向日葵[14]等的KASⅢ基因都已被克隆。VERWOERT等[15]對油菜中超表達(dá)大腸桿菌KASⅢ基因研究發(fā)現(xiàn)，油菜中C18∶2和C18∶3脂肪酸含量增加，C18∶1脂肪酸含量則減少。紫蘇籽油中含有多種不飽和脂肪酸，如棕櫚酸（16∶0）、硬脂酸（18∶0）、油酸（18∶1）、亞油酸（18∶2）和α-亞麻酸（18∶3）[16-17]，其中，α-亞麻酸為人體所必需的脂肪酸，具有降低膽固醇、提高智力、延緩衰老等重要作用。

本研究對紫蘇KAS酶家族蛋白進(jìn)行了詳細(xì)的生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明，紫蘇KAS家族蛋白都屬于疏水性脂溶蛋白，除KASⅢB蛋白外都為穩(wěn)定蛋白，不含信號肽，因此，推測該家族蛋白為非分泌型蛋白。紫蘇KAS家族蛋白二級結(jié)構(gòu)組成相似，各組分含量稍有差異，功能結(jié)構(gòu)域分析表明，KAS家族蛋白都含有KAS保守結(jié)構(gòu)域，屬于cond-enzymes超蛋白家族。對紫蘇等11個物種的33條KAS蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果表明，紫蘇KASⅠ與擬南芥KASⅠ、紫蘇KASⅡ與油茶KASⅡ、紫蘇KASⅢ與油茶KASⅢ親緣關(guān)系最近，紫蘇與油棕、油棕櫚KAS酶家族親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，進(jìn)一步揭示了KAS家族酶在油料作物脂肪酸合成中功能的相似性，為更深入探究KAS家族酶在紫蘇脂肪酸合成過程中的作用奠定了理論基礎(chǔ)。

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聲明

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《山西農(nóng)業(yè)科學(xué)》編輯部

Bioinformatics Analysis of β-ketoacyl-acyl Carrier Protein Synthase Gene Family in Perilla frutescens

LI Lu，LIANGQian，ANXi，ZHOUYali，WANGJiping

（College ofAgronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

Perilla frutescens is a new oil crop containing all kinds ofunsaturated fatty acids in its seeds oil.The oil contains higher level of α-linolenic acid,up to 61.2%.β-ketoacyl-acyl carrier protein synthase gene family plays an important role in fatty acid synthesis in plant.In this study,the KAS family proteins were analyzed with bioinformatics tools.The results showed that KASⅡgene encoded the maximum number of amino acids,but KASⅢB was the least in perilla KAS family proteins.All of them were hydrophobic lipid soluble proteins without signal peptide.Thus,the protein family was predicted as non-secretory proteins.KAS protein family contained KAS conserved domain,belonging to the cond-enzymes super protein family,the secondary structure elements were similar. Phylogenetic tree analysis showed that PfKA SⅠhad close relationship with AtKASⅠ,PfKAS II and PfKAS III had the close genetic relationship comparing with CoKASⅡand CoKASⅢ,respectively.They had the farther genetic relationship with other species.These results provided a foundation for further illustration ofthe fatty acid synthesis mechanism in Perilla frutescens.

Perilla frutescens;β-ketoacyl-acyl carrier protein synthase;bioinformatics analysis

S565.9

A

1002-2481（2017）03-0321-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.03.01

2016-12-12

國家自然科學(xué)基金項目（31201266）

李 璐（1992-），女，山西靈石人，在讀碩士，研究方向：紫蘇油脂代謝機理。王計平為通信作者。