楊翠琪,趙力超,2,李 獻(xiàn),王 麗,2,*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642;2.暨南大學(xué)食品安全與營(yíng)養(yǎng)研究院,廣東廣州 510632)

構(gòu)建用于相關(guān)基因篩選的微小亞歷山大藻產(chǎn)毒株基因組文庫(kù)

楊翠琪1,趙力超1,2,李 獻(xiàn)1,王 麗1,2,*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院,廣東廣州 510642;2.暨南大學(xué)食品安全與營(yíng)養(yǎng)研究院,廣東廣州 510632)

麻痹性貝毒素(paralytic shellfish poisonings,PSP)嚴(yán)重威脅海產(chǎn)食品質(zhì)量安全,其主要是由水體中的甲藻代謝產(chǎn)生。利用分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)構(gòu)建微小亞歷山大藻ATMW02基因組文庫(kù),探求與PSP產(chǎn)生相關(guān)的基因群。經(jīng)過(guò)與無(wú)毒亞歷山大藻L35對(duì)比篩選,獲得ATMW02株系特異性的DNA片段,然后,利用反向PCR擴(kuò)展該片段的旁側(cè)序列,分析其序列特征和功能,探討有可能引起藻株致毒的關(guān)鍵酶。通過(guò)序列分析獲得一段去除了內(nèi)含子的240 bp大小的核苷酸序列,這條核苷酸序列在終止密碼子之外的非編碼區(qū)突變了三個(gè)堿基,并且存在三個(gè)非常保守的銅離子結(jié)合區(qū)。其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列翻譯的對(duì)象是甲硫氨酰氨肽酶(methionine amino peptidase,MAP),氨基酸比對(duì)分析,其與芬地亞歷山大藻MAP氨基酸序列相似性達(dá)到97%。研究結(jié)果為深入研究亞歷山大藻產(chǎn)毒機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ),同時(shí),為加強(qiáng)海產(chǎn)品監(jiān)控和質(zhì)量安全提供有力的技術(shù)支持。

亞歷山大藻,麻痹性貝毒素,基因組文庫(kù),分子生物學(xué)

海洋中的某些藻類(lèi),例如有毒亞歷山大藻(Alexandrium),其分泌的有毒物質(zhì)-麻痹性貝毒素(paralytic shellfish poisoning,PSP),是目前分布最廣、危害最大的一種藻毒素[1],在魚(yú)、蝦、貝類(lèi)等生物體內(nèi)蓄積,對(duì)海產(chǎn)品安全有嚴(yán)重影響[2]。PSP會(huì)麻痹人的神經(jīng),輕度中毒會(huì)出現(xiàn)口唇部位發(fā)麻,重則引發(fā)呼吸困難、心臟功能紊亂?，F(xiàn)已知海洋中有13種單細(xì)胞甲藻可產(chǎn)生麻痹貝毒素,我國(guó)沿海發(fā)現(xiàn)的有毒甲藻主要有三種[3]:貝瑪亞歷山大藻(Alexandriumtamarense)、微小亞歷山大藻(Alexandriumminudum)、鏈狀亞歷山大藻(Alexandriumacatenella)。隨著基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展,人們對(duì)生物體基因的結(jié)構(gòu)、功能表達(dá)及其調(diào)控機(jī)理的研究逐漸深入到分子水平,構(gòu)建基因組文庫(kù)己成為遺傳研究實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)策略。它對(duì)于分離特定的基因片段,研究基因的表達(dá)調(diào)控、基因組的結(jié)構(gòu)和功能,以及人類(lèi)和動(dòng)植物的基因組工程等都有極其重要的作用。

大量的生理生態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)研究結(jié)果認(rèn)為,毒素基因具有成塊性,一旦某個(gè)特定毒素合成的基因被定位,可以采用某些分子生物學(xué)手段,如基于PCR 的引物步移(Primer walking PCR)法分離出完整的毒素合成基因組?，F(xiàn)在已經(jīng)知道一個(gè)基因的表達(dá)在很大程度上是由它的旁側(cè)序列調(diào)控的,克隆基因的旁側(cè)序列已經(jīng)成為分子生物學(xué)研究中的常規(guī)工作之一。在測(cè)定已知基因片段的旁側(cè)基因序列方法上,常用的有染色體DNA步移、錨定引物PCR、加入銜接頭等方法[4-8]。其中應(yīng)用染色體DNA步移的方法以其準(zhǔn)確性高而常用。反向PCR技術(shù)是DNA步移方法的一種,它可以對(duì)一個(gè)已知序列DNA的兩側(cè)未知序列進(jìn)行擴(kuò)增和研究,在分子生物學(xué)研究中有廣泛應(yīng)用。

構(gòu)建亞歷山大藻產(chǎn)毒株基因組文庫(kù)并從中篩選與毒素產(chǎn)生相關(guān)的基因片段,可為采取對(duì)應(yīng)措施提供背景知識(shí)。一般認(rèn)為,麻痹性貝毒素的表達(dá)受中間合成酶的影響,有基因群參與其中[9-10]。通過(guò)研究產(chǎn)毒株與無(wú)毒株的基因差別來(lái)了解PSP相關(guān)基因群。目前已經(jīng)分離得到產(chǎn)毒株微小亞歷山大藻ATMW02和無(wú)毒株L35。本文通過(guò)構(gòu)建微小亞歷山大藻ATMW02的基因組文庫(kù),使其含有與PSP產(chǎn)生相關(guān)基因群,經(jīng)過(guò)與無(wú)毒株L35對(duì)比篩選,獲得ATMW02株系特異性的DNA片段,然后,利用反向PCR研究特異性片段的旁側(cè)序列,分析其序列特征和功能,探討有可能引起藻株致毒的關(guān)鍵酶,進(jìn)一步驗(yàn)證與PSP毒素產(chǎn)生的關(guān)系。研究結(jié)果將對(duì)有毒藻產(chǎn)毒機(jī)理或者產(chǎn)毒藻株的快速基因鑒定具有理論參考作用,同時(shí)對(duì)保障海產(chǎn)品消費(fèi)安全至關(guān)重要。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛋白酶K、Taq酶、T4連接酶、Ex Taq DNA聚合酶 大連寶生物公司;Xho I、Sau3AI、Hind III酶 Takara生物技術(shù)有限公司;DNA凝膠純化試劑盒 美國(guó)MBI公司;DGL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn) 北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司;X-Gal、IPTG、氨芐青霉素 北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司;PMD-18T質(zhì)粒、有毒微小亞歷山大藻ATMW02和無(wú)毒塔瑪亞歷山大藻L35 由暨南大學(xué)水生生物研究所提供;大腸桿菌DH5α鼎國(guó)生物工程有限公司,甘油凍存在-80 ℃;甘油 上海生工生物工程有限公司,分析純;f/2培養(yǎng)基 參考文獻(xiàn)[11]配制。

GeneAmp PCR system 9700PCR儀 美國(guó)ABI應(yīng)用生物系統(tǒng)公司;WFH-20ZB紫外投射分析儀 上海精科實(shí)業(yè)有限公司;FC-16C高速冷凍臺(tái)式離心機(jī) 方統(tǒng)生物技術(shù)有限公司;GE-100核酸電泳儀 杭州生物科技有限公司;Gel Doc EQ凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)BIO-RAD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)藻株處理

藻種的鑒定已通過(guò)光學(xué)顯微鏡及掃描電鏡形態(tài)觀察,結(jié)合rDNA序列比較等方法確定。單藻種培養(yǎng)在含500 mL f/2培養(yǎng)液的1000 mL錐形瓶中,接種密度約為160 cells/mL,培養(yǎng)溫度(20±1) ℃,光照強(qiáng)度為100 μmol photons/(m2·s),由白色熒光燈供光,光∶暗=12 h∶12 h。每天定時(shí)晃動(dòng)錐形瓶2次,每周更換培養(yǎng)基1次。每天早上9:00,取藻液滴于浮游生物計(jì)數(shù)框上,在光學(xué)顯微鏡下鏡檢計(jì)數(shù)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 亞歷山大藻基因組DNA提取 利用凍融-CTAB方法提取基因組DNA[11]。

1.3.2 插入片段制備 在滅菌的、潔凈的PCR反應(yīng)管中,用限制性?xún)?nèi)切酶Sau3A I部分酶切基因組DNA,酶切體系見(jiàn)表1。

表1 亞歷山大藻基因組DNA酶切體系

輕混后,37 ℃酶切2 h后,75 ℃、15 min失活Sau3AI酶。酶切結(jié)束后用等體積酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)抽提一次,氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提一次,小心吸出水相并加入1/10體積的3 mol/L乙酸鈉(pH5.2)和兩倍體積的冰預(yù)冷的無(wú)水乙醇,于-20 ℃中靜置數(shù)小時(shí)。然后在4 ℃下最大轉(zhuǎn)速離心,沉淀用冰預(yù)冷的70%乙醇洗一次,待乙醇揮發(fā)完全后,溶于適量無(wú)菌超純水中保存于-20 ℃。

1.3.3 酶解DNA片段克隆至T載體

1.3.3.1 插入片段的量 連接反應(yīng)中需要的插入片段的量采用以下公式:

插入片段的量(ng)=加入載入載體的量(ng)×插入片段的大小(kb)×插入片段和載體的摩爾比/載體大小

式中的PMD-18T載體系統(tǒng)插入的DNA片段和載體的摩爾比3∶1的連接比例。加入載入載體的量為50 ng。插入片段大小為200 bp～2 kb。載體大小為2.6 kb,濃度為50 ng/μL。

1.3.3.2 插入片段與供體載體的體外連接 反應(yīng)前將2×快速連接緩沖液混勻,在滅菌的0.2 mL PCR反應(yīng)管中依次按照表2加入組分。

連接反應(yīng):在16 ℃條件下,反應(yīng)過(guò)夜。

表2 連接反應(yīng)體系

1.3.4 制備大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞 參照文獻(xiàn)[11]。

1.3.5 轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒提取 在過(guò)夜培養(yǎng)的生長(zhǎng)有白色菌落和藍(lán)色菌落LB/氨芐/IPTG/X-Gal平板上,用無(wú)菌的接種針挑取白色菌落,接種在含有100 mg/mL氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜,在相應(yīng)的每個(gè)白色菌落做上標(biāo)記。提取質(zhì)粒,通過(guò)凝膠電泳確認(rèn)是否含有質(zhì)粒及其質(zhì)粒的大小。

1.3.6 序列測(cè)定及特異性鑒定 將提取的含有插入片段的質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定,去除質(zhì)粒本身DNA序列,得到插入片段的DNA序列。根據(jù)測(cè)序結(jié)果,設(shè)計(jì)合成擴(kuò)增引物,分別擴(kuò)增產(chǎn)毒微小亞歷山藻ATMW02和無(wú)毒藻塔瑪亞歷山大藻L35基因組DNA,根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行特異性鑒定。

1.3.7 反向PCR法分析與產(chǎn)毒相關(guān)DNA片段上游未知序列 常規(guī)PCR技術(shù)是擴(kuò)增兩個(gè)引物之間的DNA片段,而反向PCR是用反向的引物來(lái)擴(kuò)增兩引物之外的DNA片段。其目的是擴(kuò)增一般已知目的順序旁側(cè)的DNA[9-13]。由于反向PCR可用于研究與已知DNA片段相連的未知DNA序列,因此又被稱(chēng)為DNA步移。此法所選擇的引物雖與已知DNA序列互補(bǔ),但兩引物3′端是反向的。反向PCR擴(kuò)增前,先用限制性?xún)?nèi)切酶酶切DNA,然后用連接酶使帶有粘性末端的DNA片段進(jìn)行自身環(huán)化,最后用一對(duì)反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到的線性DNA將含有兩引物外側(cè)的未知序列,如圖1所示。

圖1 反向PCR擴(kuò)增特異性片段兩端未知序列原理圖Fig.1 Process of amplification of the two ends of specific DNA fragment by inverse PCR

1.3.7.1 引物設(shè)計(jì)和限制性?xún)?nèi)切酶選擇 反向PCR中,上游引物應(yīng)該靠近序列3′端,下游引物應(yīng)該偏向序列5′端。限制型內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)應(yīng)該在已知下游序列前,而且必須保證引物之間和上游引物后面無(wú)該限制性?xún)?nèi)切酶的酶切位點(diǎn)。另外,限制性?xún)?nèi)切酶的選擇還應(yīng)該考慮:酶切識(shí)別位點(diǎn)不可有簡(jiǎn)并位點(diǎn),因?yàn)榭赡軙?huì)影響下一步的連接反應(yīng);避免選擇稀有的內(nèi)切酶,一來(lái)價(jià)錢(qián)過(guò)高,二來(lái)往往這種內(nèi)切酶濃度較低,影響酶切效果;盡量避免識(shí)別位點(diǎn)較短的內(nèi)切酶,因?yàn)槊盖泻竽軌颢@得的序列可能過(guò)短,需要的目的序列信息過(guò)少。在本實(shí)驗(yàn)中,以插入片段序列信息為已知序列的模板,設(shè)計(jì)反向引物獲得旁側(cè)未知序。

1.3.7.2 限制性?xún)?nèi)切酶酶切消化染色體DNA 酶切消化的反應(yīng)體系見(jiàn)表3。輕混后,37 ℃反應(yīng)2 h。反應(yīng)后將PCR管放于75 ℃,15 min滅活內(nèi)切酶。酶切產(chǎn)物放于-20 ℃或直接進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

表3 PCR產(chǎn)物酶切反應(yīng)體系

1.3.7.3 酶切產(chǎn)物的自身環(huán)化 用T4連接酶進(jìn)行酶切產(chǎn)物的自身連接環(huán)化,反應(yīng)體系見(jiàn)表4。環(huán)化條件:在PCR儀中16 ℃反應(yīng)過(guò)夜。94 ℃反應(yīng)15 min,來(lái)終止反應(yīng)。

表4 自身環(huán)化反應(yīng)體系

1.3.7.4 反向PCR反應(yīng) 將引物均溶解并稀釋至10 μmol/L濃度。反向PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表5。

表5 反向PCR擴(kuò)增體系

按照下列程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增:第一步,94 ℃變性5 min;第二步,按照下列參數(shù)重復(fù)30個(gè)循環(huán),94 ℃變性0.5 min,52 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min;最后延伸72 ℃、7 min。該反應(yīng)程序是第一類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶反向PCR程序,其他反向PCR的退火溫度因設(shè)計(jì)的引物不同而有所改變。

濃度為1%的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳,電壓為100 V時(shí)間為30 min。

1.3.7.5 擴(kuò)增片段測(cè)序及序列分析 直接將反向PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序的結(jié)果用contig1、chromas進(jìn)行序列拼接。使用DNATool軟件對(duì)DNA序列進(jìn)行分析,在http://www.ddbj.nig.ac.jp/search/blast-e.html網(wǎng)站應(yīng)用BLASTN程序?qū)Λ@得的基因片段進(jìn)行同源性檢索。用Gene tool軟件去除序列中的內(nèi)含子,然后用計(jì)算機(jī)軟件BioEdit將拼接后的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列。將其他物種的氨基酸序列(來(lái)自GenBank)用BioEdit包含的Clustal W package進(jìn)行多序列對(duì)位分析,并預(yù)測(cè)獲得的該部分氨基酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)功能位點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 插入片段制備結(jié)果

按本文方法,共獲得150 μg亞歷山大藻ATMW02和L35基因組DNA,0.5 μg/μL,A260/A280為1.80,電泳結(jié)果表明獲得的基因組DNA為大分子量,質(zhì)量較好。經(jīng)酶切后,DNA大片段被降解,制備的插入片段大小大部分介于200 bp～2 kb之間,連續(xù)片段分布,符合載體插入片段要求。

2.2 插入片段大小

選擇PMD-18T載體系統(tǒng)進(jìn)行DNA未知片段的克隆,該載體可用于PCR 產(chǎn)物的克隆,含有T7和SP6 RNA聚合酶啟動(dòng)子,其側(cè)翼和多克隆位點(diǎn)區(qū)相接,多克隆位點(diǎn)區(qū)位于β半乳糖苷酶的α肽編碼區(qū)內(nèi)。α肽插入失活允許在指示培養(yǎng)基用顏色直接篩選重組克隆。插入片段成功克隆至PMD-18T載體中,可阻斷β半乳糖苷酶的編碼序列,因而重組克隆可在指示培養(yǎng)基上通過(guò)顏色進(jìn)行篩選,選擇白斑菌落作為可能的轉(zhuǎn)化子。

在過(guò)夜培養(yǎng)的生長(zhǎng)有白色菌落和藍(lán)色菌落LB/氨芐/IPTG/X-Gal平板上,用無(wú)菌的接種針挑取白色菌落,接種在含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜,在相應(yīng)的每個(gè)白色菌落做上標(biāo)記。全部提取質(zhì)粒,通過(guò)凝膠電泳確認(rèn)是否含有質(zhì)粒及其質(zhì)粒的大小。陽(yáng)性質(zhì)粒電泳圖見(jiàn)圖2,具體插入DNA片段大小通過(guò)測(cè)序分析獲得。

圖2 提取的部分質(zhì)粒電泳圖Fig.2 Partial plasmids extracted from transformants注:1:質(zhì)粒載體;2～11:從平板上挑選的部分白色菌落提取的質(zhì)粒;12:DL4000 Marker。

2.3 序列測(cè)定及特異性鑒定結(jié)果

通過(guò)質(zhì)粒測(cè)序,其中獲得一段長(zhǎng)度為1014 bp大小的DNA片段。根據(jù)這段序列的測(cè)序結(jié)果,設(shè)計(jì)一對(duì)引物,分別擴(kuò)增有毒微小亞歷山大藻ATMW02基因組DNA和無(wú)毒塔瑪亞歷山大藻基因組L35的DNA,判斷這段序列的特異性。同時(shí),擴(kuò)增兩株亞歷山大藻屬特異性核糖體保守區(qū)域。根據(jù)獲得的DNA片段設(shè)計(jì)的序列特異性引物為:A-U:5′-TAACC GAGGTTAAAGCTAAGC-3′;A-D:5′-GATTCACCG GCAACCCGACT-3′。同時(shí),利用甲藻18S rDNA專(zhuān)一性引物:B-U:5′-TGTGTGAAAGATTAAGCCATG-3′;B-D:5′-ACTTCTCCTTCCTCTAAGTGA-3′,PCR擴(kuò)增兩株亞歷山大藻ATMW02基因組作為背景對(duì)照。根據(jù)獲得的DNA片段設(shè)計(jì)的引物退火溫度Tm為52 ℃,屬特異性引物退火溫度為55 ℃,擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖3,結(jié)果顯示引物對(duì)為屬特異性引物兩者均有擴(kuò)增,ATMW02有強(qiáng)烈的擴(kuò)增反應(yīng),而L35沒(méi)有擴(kuò)增跡象。

麻痹性貝毒素(PSP)是一類(lèi)嘌呤化合物,沒(méi)有對(duì)應(yīng)翻譯的核酸序列,是由多種相關(guān)基因合成不同的酶,再由酶作用合成PSP。微小亞歷山大藻ATMW02為PSP產(chǎn)毒藻株,應(yīng)含有PSP產(chǎn)生過(guò)程完整的相關(guān)基因群,無(wú)毒藻株L35則相關(guān)基因群至少不完整。因此,分離PSP相關(guān)基因群一個(gè)特征為相對(duì)于無(wú)毒藻株的有毒株株系特異性。從圖3結(jié)果看出,兩種藻株均可以擴(kuò)增出甲藻專(zhuān)一性DNA片段。而利用本文獲得的特異性DNA片段設(shè)計(jì)的引物可以在ATMW02基因組中擴(kuò)增出1000 bp左右大小的特異性條帶有強(qiáng)烈擴(kuò)增信號(hào),而在L35基因組中不能擴(kuò)增出相應(yīng)的特異性條帶,說(shuō)明這段序列具有產(chǎn)毒株特異性,可能為產(chǎn)麻痹性貝毒素(PSP)相關(guān)的DNA片段。兩種藻株中都能擴(kuò)增的條帶說(shuō)明是亞歷山大藻背景條帶,與PSP毒素產(chǎn)生關(guān)系不大。

圖3 篩選片段的ATMW02與L35的株系特異性Fig. 3 Strain specificity of gene fragment between ATMW02 and L35注:1、2:引物對(duì)為屬特異性引物;3、4:引物對(duì)為本文分析序列。

2.4 反向PCR引物設(shè)計(jì)與限制性?xún)?nèi)切酶選擇

已知特異性DNA片段可能與產(chǎn)毒有關(guān),通過(guò)反向PCR方法探知其旁側(cè)DNA序列,尋找與產(chǎn)毒相關(guān)的基因群。對(duì)特異性片段DNA序列分析后選擇AsuII和XhoI 這兩種限制性?xún)?nèi)切酶分別對(duì)特異性DNA片段進(jìn)行酶切。酶切后,兩個(gè)粘性末端會(huì)結(jié)合成環(huán),未知的DNA序列環(huán)于環(huán)中。根據(jù)酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物,引物與已知DNA序列互補(bǔ),但兩引物3′端是反向的。針對(duì)限制性酶AsuII設(shè)計(jì)的反向PCR引物為:上游引物AsuII-U:5′-TCGCCATCAGTAGTT CGCTC-3′;下游引物AsuII-D:5′-GCAACGAGTTAA ACAACGAG-3′。針對(duì)限制性酶XhoI設(shè)計(jì)的反向PCR引物為:上游引物XhoI-U:5′-TCGGTGCC GCTACTGCCCGC-3′;下游引物XhoI-D:5′-GCACATCCGGTGATCTT GA-3′。序列及引物分析結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 反向PCR引物及內(nèi)切酶分析Fig.4 Primers and endonucleases for inverse PCR注:內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)以方框標(biāo)示,引物序列及方向以箭頭標(biāo)示。

2.5 反向PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析

圖7 微小亞歷山大藻ATMW02的MAP部分氨基酸序列與其他物種的比對(duì)結(jié)果Fig.7 The alignment of partial MAP sequences among five species注:Alexandrium fundyense:AAD20316;Arabidopsis thaliana:AAG33975;Oryza sativa:XP_473849;Bos Taurus:AAI13347.1. 比對(duì)結(jié)果的方框部分是MAP銅離子結(jié)合區(qū)域。

通過(guò)反向PCR擴(kuò)增產(chǎn)毒微小亞歷山大藻A.minitumATMW02特異性DNA片段兩側(cè)未知區(qū)域,其中利用AsuII酶得到750 bp左右的片段,利用XhoI酶得到1.0 kb左右的片段。將反向PCR產(chǎn)物送至測(cè)序,測(cè)序結(jié)果分別是755 bp和1100 bp。將所得的兩段DNA序列與之前得到的特異性片段進(jìn)行拼接并去除其中內(nèi)含子,獲得一段去除了內(nèi)含子的240 bp大小的核苷酸序列。參照Alexandiumfundyense(芬地亞歷山大藻)的開(kāi)放閱讀框架[14],利用BioEdit軟件將拼接后的序列翻譯成氨基酸。反向PCR產(chǎn)物電泳圖及序列結(jié)構(gòu)分析結(jié)果參見(jiàn)圖5及圖6。

圖5 反向PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.5 Inverse PCR product注:Lane M:DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);Lane 1,2:利用AsuII酶得到的反向PCR產(chǎn)物,利用XhoI酶得到的反向PCR產(chǎn)物。

圖6 核苷酸序列分析Fig.6 Nucleotide sequence analysis注:方框中部分是核苷酸序列的氨基酸翻譯產(chǎn)物。

反向PCR擴(kuò)增結(jié)果翻譯的氨基酸序列經(jīng)過(guò)在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast比較分析,發(fā)現(xiàn)其中471～710 bp之間一段氨基酸序列翻譯的對(duì)象屬于甲硫氨酰氨肽酶(methionine aminopeptidase,MAP)氨基酸序列的一部分,通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),其與芬地亞歷山大藻A.fundyenseMAP的氨基酸序列的相似性為97%,與擬南芥(Arabidopsisthaliana)相似性為53%,與水稻(Oryza sativa)相似性為55%,與牛(Bos Taurus)的相似性為51%(圖7)。

甲硫氨酰氨膚酶(MAP)廣泛存在于從低等到高等的所有生物體中,在蛋白質(zhì)加工過(guò)程中負(fù)責(zé)切除新生膚鏈N端的起始甲硫氨酸,這對(duì)于對(duì)蛋白質(zhì)的修飾、成熟以及在細(xì)胞中的準(zhǔn)確定位等極其重要,MAP活性是正常生理功能所必需的。一般在原核生物中,MAP單基因單拷貝就能滿足細(xì)胞的正常生理功能,但真核生物中卻至少存在兩種構(gòu)型的MAP。Taroncher-Oldenburg等利用同步化技術(shù)和差異顯示技術(shù),發(fā)現(xiàn),甲硫氨酰胺肽酶有可能參與了麻痹性貝毒素的生物合成,推測(cè)其對(duì)應(yīng)的map基因與毒素合成有關(guān),且為表達(dá)上調(diào)基因[14]。

MAP具有金屬離子依賴(lài)性,已知在A.fundyense中該酶具有5個(gè)銅離子結(jié)合位點(diǎn),在本文微小亞歷山大藻ATMW02甲硫氨酰胺肽酶的部分氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)3個(gè)區(qū)域,分別為GHG、LEP和EHT,同時(shí)也說(shuō)明這三個(gè)區(qū)域在MAP中高度保守。

在http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/seq-search/struc-predict.html網(wǎng)站上,分析這段氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)及其功能位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)該酶具有三個(gè)功能區(qū)域,分別是:位于29～34的GTTFTL是N-14烷基化位點(diǎn)(N-myristoylation site);位于47～50的TWDD是酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)(Casein kinase II phosphorylation site);位于57～59的SDR是蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)(protein kinase phosphorylation site)。

分析這段核苷酸序列,發(fā)現(xiàn)在編碼區(qū)與已報(bào)道的核苷酸序列完全相同,主要區(qū)別在3′端的非編碼區(qū),本研究得到的這段序列在非編碼區(qū)末端突變了三個(gè)堿基CAG(見(jiàn)圖6中標(biāo)下劃線的堿基),并且已報(bào)道的研究也發(fā)現(xiàn)差別均在終止密碼子之外的非編碼區(qū)。因此,可以判斷不可能是由同一轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不同加工造成的。據(jù)研究,在微小亞歷山大藻ATMW02中存在至少三個(gè)map基因拷貝,它們分別轉(zhuǎn)錄得到三種mapmRNA分子,或者轉(zhuǎn)錄得到兩種mapmRNA后,由反式拼接或者RNA編輯產(chǎn)生第三種mapmRNA[15]。根據(jù)序列同源性MAP分為MAP-I和MAP-II兩類(lèi),兩者的區(qū)別在于MAP-II的C端插入了一個(gè)約60個(gè)氨基酸殘基組成的a螺旋[16],通過(guò)分析在本文微小亞歷山大藻ATMW02的C端沒(méi)有發(fā)現(xiàn)60個(gè)左右的氨基酸插入,所以判斷微小亞歷山大藻A.minitumATMW02的MAP可能為I型酶。

到目前為止,對(duì)亞歷山大藻的產(chǎn)毒基因和產(chǎn)毒機(jī)制的研究還處于剛起步階段[17-22],產(chǎn)毒基因和具體產(chǎn)毒機(jī)制都不清楚。在原核生物中,MAP單基因單拷貝就能滿足細(xì)胞的正常生理功能,但是真核生物中卻至少存在兩種構(gòu)型的MAP。Giglione發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞的不同空間可能需要不同的MAP酶來(lái)執(zhí)行其功能[23]。亞歷山大藻正常生長(zhǎng)代謝需要MAP的多個(gè)基因拷貝,本研究發(fā)現(xiàn)的這段非編碼區(qū)堿基發(fā)生突變,根據(jù)生物信息學(xué)分析,推測(cè)其突變可能是由于在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中,MAP執(zhí)行了不同的生理功能需求,在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)毒素的產(chǎn)生進(jìn)行了調(diào)控,map基因通過(guò)其編碼產(chǎn)物對(duì)其他產(chǎn)毒相關(guān)基因進(jìn)行了誘導(dǎo),使其具有活性表達(dá),開(kāi)始毒素合成。

3 結(jié)論

本文通過(guò)構(gòu)建微小亞歷山大藻A.minitumATMW02文庫(kù),篩選到具有產(chǎn)毒株陽(yáng)性而無(wú)毒株陰性的株系特異性重組片段,并運(yùn)用反向PCR方法擴(kuò)增及測(cè)定特異性片段兩端未知DNA片段,同時(shí)對(duì)獲得序列的特征和功能進(jìn)行了分析。用稀有限制性?xún)?nèi)切酶Sau3A I酶切微小亞歷山大藻ATMW02基因組DNA,通過(guò)插入片段與載體的連接、轉(zhuǎn)化以及平板篩選,獲得一段1014 bp大小的特異性DNA片段。然后通過(guò)PCR驗(yàn)證其在有毒株中有強(qiáng)烈的擴(kuò)增信號(hào),而在無(wú)毒株中無(wú)擴(kuò)增信號(hào),判斷該片段具有產(chǎn)毒株株系特異性。利用反向PCR分析特異性片段旁側(cè)DNA序列信息。通過(guò)序列分析獲得其中一段240 bp大小的核苷酸序列,其對(duì)應(yīng)的氨基酸序列翻譯的對(duì)象是甲硫氨酰氨肽酶(MAP)。氨基酸比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),其與芬地亞歷山大藻MAP氨基酸序列相似性達(dá)到97%。獲得的氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)存在三個(gè)非常保守的銅離子結(jié)合區(qū),其二級(jí)結(jié)構(gòu)存在三個(gè)功能區(qū)域。

本研究對(duì)于深入研究藻毒素產(chǎn)生的機(jī)理提供了一種新的思路,運(yùn)用分子生物學(xué)手段和生物信息學(xué)分析能夠?qū)ο嚓P(guān)基因群進(jìn)行有效解析。研究結(jié)果對(duì)于快速檢測(cè)有毒藻株、安全有效監(jiān)測(cè)海產(chǎn)食品、防止污染麻痹性貝毒素污染的海產(chǎn)食品流入市場(chǎng)、保障消費(fèi)者飲食安全等方面都具有積極的促進(jìn)作用[24-25]。

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Construction of genomic library of strains producingAlexandriumMinudumalgae for the screening of related genes

YANG Cui-qi1,ZHAO Li-chao1,2,LI Xian1,WANG Li1,2,*

(1.College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510642,China;2.Institute of Food Safety and Nutrition in Jinan University,Guangzhou 510632,China)

Paralytic shellfish poison(PSP),which is mainly produced by dinoflagellates of water,is a serious threat to Marine food quality and safety.AlexandriumminutumATMW02 genomic library was built to search the related gene group in PSP by using molecular biology and bioinformatics technology. After compared with non-toxicAlexandriumL35,a specificity fragments of the DNA in ATMW02 was obtained and the flanking sequences were expanded through reverse PCR. By analyzing the sequence features and functions,the key enzymes were explored that migth cause the poison also obtained a 240 bp nucleotide sequence without intron. This nucleotide sequence mutated three bases outside the termination codon and existed three conservative copper-binding domain,which could be translated into MAP and 97% match with theAlexandiumfundyenseMAP. The results of this study provided a theoretical foundation for further research onAlexandriumtoxin-producing mechanisms. In the meantime,it could provided technical support to enhance marine food quality and supervision.

Alexandriumminudum;paralytic shellfish poison;genomic library;molecular biology

2016-07-25

楊翠琪(1995-)，女，大學(xué)本科，研究方向：食品科學(xué)與工程，E-mail：2744243473@qq.com。

*通訊作者:王麗(1980-)，女，博士，副教授，研究方向：食品微生態(tài)與質(zhì)量安全，E-mail：wangli_scau@scau.edu.cn。

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2016A040403103)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31301445)；國(guó)家星火計(jì)劃(2015GA780080)；廣東省級(jí)“質(zhì)量工程項(xiàng)目”-精品資源共享課“食品微生物檢驗(yàn)學(xué)”。

TS254.7

A

1002-0306(2017)06-0179-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.026