王大銘　周琳　宋新元

摘要：以我國自主研制的轉(zhuǎn)EPSPS基因抗除草劑玉米CL38-1為試驗材料，通過抗除草劑噴施和生存競爭能力評價，研究其對目標除草劑草甘膦的耐受性以及在農(nóng)田和荒地環(huán)境下雜草化的可能性。結(jié)果表明，在噴施41%草甘膦異丙胺鹽水劑1230g/hm2（推薦劑量）和2460g/hm2（推薦劑量的2倍量）1、2、4周后，對玉米的株高及生長無不良影響，受害率為0。在農(nóng)田環(huán)境下，轉(zhuǎn)基因玉米CL38-1與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ锗?8在生育期、株高、覆蓋度、產(chǎn)量等方面無明顯差異，在栽培地環(huán)境中可正常生長；在荒地條件下，較之雜草沒有競爭優(yōu)勢，無雜草化風險。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因玉米；除草劑抗性；生存競爭能力；雜草化；環(huán)境安全評價

中圖分類號：S451文獻標志碼：A文章編號：1003-935X（2016）02-0023-06

轉(zhuǎn)基因玉米產(chǎn)業(yè)在世界范圍內(nèi)取得重要成功，并在多個國家獲批種植或作為食品及飼料[1-3]，1996至2015年全球轉(zhuǎn)基因作物累計種植面積達20億hm2，其中6億hm2為轉(zhuǎn)基因玉米[4]。如今，培育多基因、以抗蟲抗除草劑性狀為代表的復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因玉米成為重要的發(fā)展趨勢[5]。

研發(fā)與安全評價同步是轉(zhuǎn)基因育種的重要原則，因此，對于轉(zhuǎn)基因玉米的安全性問題，尤其對環(huán)境和生態(tài)多樣性可能帶來的潛在風險被廣泛關(guān)注[6-7]。針對抗逆性狀轉(zhuǎn)基因植物，對生態(tài)系統(tǒng)是否具有破壞性[8-9]，目標性狀是否能滿足產(chǎn)業(yè)需求以及是否存在雜草化風險等方面是環(huán)境安全評價的重點[10-13]。

本試驗選址在我國春玉米產(chǎn)區(qū)吉林省，選用我國自主研發(fā)、具有知識產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)EPSPS基因抗除草劑玉米CL38-1及其對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ锗?8為研究對象。利用田間噴施目標除草劑（草甘膦）試驗，以施藥1、2、4周后的株高及受害率作為評價指標，評價其除草劑耐受性；利用栽培地與荒地模擬試驗，以玉米株高、覆蓋度、產(chǎn)量、雜草種類等作為評價指標，評價其生存競爭能力，旨在為轉(zhuǎn)EPSPS基因抗除草劑玉米CL38-1在吉林省未來的產(chǎn)業(yè)化推廣提供基礎(chǔ)參考數(shù)據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

轉(zhuǎn)EPSPS基因抗除草劑玉米CL38-1（CL38-1）及其對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ锗?8（CK），均由中國農(nóng)業(yè)大學提供。供試除草劑：41%草甘膦異丙胺鹽水劑，購于孟山都公司。

1.2試驗地點

試驗于吉林省農(nóng)業(yè)科學院公主嶺院區(qū)國家轉(zhuǎn)基因玉米大豆中試與產(chǎn)業(yè)化基地（公主嶺）環(huán)境安全研究試驗圃場進行。公主嶺市屬中溫帶濕潤地區(qū)大陸性季風氣候；處于124°02′～125°18′E，43°11′～44°09′N，與同緯度的美國玉米帶、烏克蘭玉米帶并稱為“世界三大黃金玉米帶”。

1.3試驗設(shè)計

1.3.1除草劑耐受性評價種植方式：參考當?shù)赜衩状筇锷a(chǎn)方式，分區(qū)設(shè)計，小區(qū)面積為24m2（4m×6m），3次重復(fù)，區(qū)組隨機排列。2013年5月15日播種，采用人工播種方式，2～3粒/穴。

處理方式：轉(zhuǎn)基因玉米噴施清水、目標除草劑；對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ锗?8噴施清水、目標除草劑。所用除草劑為41%草甘膦異丙胺鹽水劑，施用劑量分別為農(nóng)藥登記標簽的推薦劑量（1230g/hm2）和推薦劑量2倍量（2460g/hm2）。在玉米植株生長至6葉期噴施除草劑。各小區(qū)中間2行為調(diào)查行。分別在用藥1、2、4周后調(diào)查，記錄成苗率、植株高度（選取最高的5株）、藥害癥狀（選取藥害癥狀最輕的5株）。藥害癥狀分級按GB/T19780.42《農(nóng)藥田間藥效試驗準則（一）除草劑防治玉米地雜草》執(zhí)行。

各小區(qū)草甘膦除草劑危害率計算公式：

X=[SX（]∑（N×S）[]T×M[SX）]×100%。

其中：X為草甘膦危害率，%；N為同一危害級別的植株數(shù)，株；S為危害級別；T為調(diào)查植株總數(shù)，株；M為試驗觀測到的最高危害級別。

1.3.2生存競爭能力評價栽培地：每個小區(qū)面積為25m2（5m×5m），3次重復(fù)，各小區(qū)隨機排列，按吉林省常規(guī)耕作模式進行管理，玉米常規(guī)播種時間為2013年5月15日，采用雙粒點播的方式進行播種，株間距25cm。記錄玉米主要生育期（包括種植時間、出苗期、抽穗期、吐絲期及成熟期）。在玉米苗期（定苗7d后）、心葉中期（小喇叭口期）、心葉末期（大喇叭口期）、抽雄期以及吐絲期，采用對角線5點取樣法，每小區(qū)調(diào)查10株玉米的株高，并估算覆蓋度。在成熟期每小區(qū)收獲20株玉米果穗，比較轉(zhuǎn)基因玉米與對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩自诋a(chǎn)量性狀方面的差異。

荒地：每個小區(qū)面積為6m2（2m×3m），4次重復(fù)，各小區(qū)隨機排列。試驗分2批播種，第1批于2013年5月15日播種，第2批于2013年6月10日播種。每次播種均采用地表撒播和深度（5cm）播種2種方式，播種量為每小區(qū)150粒種子，播種后不進行任何栽培管理。采用對角線5點取樣法，每點調(diào)查0.25m2。播前調(diào)查1次，播種30d開始至玉米成熟，每月調(diào)查1次。調(diào)查并記錄試驗小區(qū)內(nèi)玉米植株的高度與植株垂直投影面積占小區(qū)面積的比例，估算出覆蓋度，以及雜草種類、數(shù)量與覆蓋度。

1.4數(shù)據(jù)分析

采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對調(diào)查數(shù)據(jù)進行方差分析。

2結(jié)果分析

2.1除草劑耐受性評價

如表1所示，噴施除草劑1周后，噴施推薦劑量除草劑處理試驗區(qū)中，轉(zhuǎn)基因玉米生長正常，受害率為0；對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩罪@示出明顯的藥害癥狀，出現(xiàn)植株停止生長、葉片枯萎發(fā)黃等癥狀，受害率達到67%。噴施2倍推薦劑量除草劑試驗區(qū)，轉(zhuǎn)基因玉米生長正常，受害率為0；對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩罪@示出明顯的藥害癥狀，出現(xiàn)植株停止生長、葉片枯萎發(fā)黃等癥狀，受害率達到75%。在不噴施除草劑、噴施推薦量除草劑、噴施推薦量2倍除草劑等3個處理中，轉(zhuǎn)基因玉米株高稍有不同，但差異較小。對應(yīng)非轉(zhuǎn)基因玉米在噴施除草劑與未噴施除草劑處理間的株高差異顯著。

噴施除草劑2周后，噴施推薦量除草劑處理試驗區(qū)，轉(zhuǎn)基因玉米生長正常，受害率為0；對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩拙哂忻黠@的藥害癥狀，大部分植株停止生長，受害率達到92%。噴施2倍推薦劑量除草劑試驗區(qū)，轉(zhuǎn)基因玉米生長正常，受害率為0；對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩拙哂忻黠@的藥害癥狀，植株停止生長，受害率達到100%。在不噴施除草劑、噴施推薦量除草劑、噴施推薦量2倍除草劑的3個處理中，轉(zhuǎn)基因玉米株高基本一致，無顯著差異。

噴施除草劑4周后，噴施推薦劑量除草劑處理試驗區(qū)，轉(zhuǎn)基因玉米生長正常，受害率為0；對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩罪@示出明顯的藥害癥狀，植株全部枯萎死亡，受害率達到100%。噴施2倍推薦劑量除草劑試驗區(qū)，轉(zhuǎn)基因玉米生長正常，受害率為0；對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩字仓耆靠菸劳?，受害率達到100%。在不噴施除草劑、噴施推薦量除草劑、噴施推薦量2倍除草劑的3個處理中，轉(zhuǎn)基因玉米株高基本一致，無顯著差異。

以上分析表明，對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩讓Τ輨┟舾校瑹o耐受性或耐受性較差。轉(zhuǎn)基因玉米對除草劑具有明顯的耐受性，并且不噴除草劑、噴施推薦劑量、噴施2倍推薦劑量除草劑等3個處理對轉(zhuǎn)基因玉米植株的生長發(fā)育無明顯影響。

2.2生存競爭能力評價

2.2.1栽培地生存競爭能力

2.2.1.1生長期監(jiān)測如表2所示，轉(zhuǎn)基因玉米及其對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩咨诨疽恢?，無明顯差異。

2.2.1.2株高

栽培地試驗中，對轉(zhuǎn)基因抗除草劑玉米CL38-1及其對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ锗?8的株高分別在苗期、心葉中期、心葉末期、抽雄期、吐絲期進行5次調(diào)查。如表3所示，各調(diào)查時期轉(zhuǎn)基因抗除草劑玉米CL38-1及其對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ锗?8的株高差異均未達到顯著水平。

2.2.1.3栽培地玉米覆蓋度

栽培地試驗中，對轉(zhuǎn)基因抗除草劑玉米CL38-1及其對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏母采w度分別在苗期、心葉中期、心葉末期、抽雄期、吐絲期進行5次調(diào)查。如表4所示，僅在苗期，轉(zhuǎn)基因玉米及其對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ赵诟采w度上差異顯著，其余各個時期，兩者覆蓋度均不存在顯著差異。

2.2.1.4產(chǎn)量性狀產(chǎn)量、穗長、穗莖和百粒質(zhì)量的測定結(jié)果如表5所示，轉(zhuǎn)基因玉米與其對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ锗?8的調(diào)查結(jié)果基本相同，無顯著差異。

2.2.2荒地生存競爭能力

表面撒播和深度播種各處理小區(qū)優(yōu)勢雜草種類一致，優(yōu)勢雜草種類主要有稗草、龍葵、藜、反枝莧、豚草、苘麻、葎草，還有少量蒼耳、狗尾草、酸模葉蓼、地膚等。如表6所示，比較轉(zhuǎn)基因玉米及其對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩?個處理的雜草覆蓋度，除2013年7月份表面撒播處理外，其余均不存在顯著差異。

3結(jié)論與討論

目標性狀有效性是應(yīng)用轉(zhuǎn)基因植物的基礎(chǔ)所在，針對抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米，一般采用田間人工接蟲鑒定與室內(nèi)生測相結(jié)合的方法。武奉慈等采用田間人工接蟲鑒定方法，根據(jù)玉米抗螟性田間鑒定評價標準，研究轉(zhuǎn)基因玉米Bt799和NC6304YGRR對亞洲玉米螟的抗性，研究結(jié)果表明，2種轉(zhuǎn)基因玉米對亞洲玉米螟抗性均顯著高于各自對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ锗?8，均能保護玉米在整個生育期內(nèi)不受亞洲玉米螟危害[14]。王月琴等采用田間接蟲與室內(nèi)生測相結(jié)合的方法研究轉(zhuǎn)基因玉米Bt799對亞洲玉米螟的抗性，室內(nèi)生測結(jié)果表明玉米Bt799對亞洲玉米螟具有較好的毒殺效果，田間接蟲結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因玉米在整個生育期對亞洲玉米螟都有較高的抗性[15]。針對抗除草劑性鑒定，一般采用田間植株噴施目標除草劑的方法。Heck等將雙價[WTBX][STBX]CP4-EPSPS[WTBZ][STBZ]轉(zhuǎn)入玉米，通過在玉米植株3葉期和6葉期噴灑164.94g/hm2草甘膦的方法來篩選高抗株系，得到了可抗4倍生產(chǎn)劑量草甘膦的轉(zhuǎn)基因玉米[16]。高秀清等對新培育的抗除草劑（草甘膦）轉(zhuǎn)基因大豆新材料SNT1進行了田間鑒定，研究結(jié)果表明，抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆SNT1在大田條件下能穩(wěn)定、有效抵抗草甘膦除草劑，且抗草甘膦性狀的表達并未影響其他農(nóng)藝性狀[17]。

在生存競爭能力評價研究方面，孫紅煒等對抗蟲耐除草劑棉花639017、當?shù)孛藁矫?06在2種土壤類型條件下開展生存競爭能力研究，結(jié)果表明，外源基因的導入并未增強抗蟲耐除草劑棉花的生存競爭能力，因此，抗蟲耐除草劑棉花無雜草化風險[18]。宋新元等完成了對抗除草劑玉米CC-2生存競爭能力評價，結(jié)果表明在栽培地環(huán)境中，轉(zhuǎn)基因玉米CC-2與其對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ锗?8在株高、雜草覆蓋度和產(chǎn)量等方面均一致，可正常生長；在荒地環(huán)境中，轉(zhuǎn)基因玉米CC-2及其對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ锗?8與雜草相比不具備競爭優(yōu)勢，無雜草化風險[19]。陳小文等研究轉(zhuǎn)[WTBX][STBX]CRY1AC[WTBZ][STBZ]基因玉米及對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ锗?8在野外自然條件及模擬野外條件下的生存能力，結(jié)果表明，生存競爭能力從弱到強的順序為非轉(zhuǎn)基因玉米<轉(zhuǎn)基因玉米<雜草，轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米雖然在與雜草的競爭中優(yōu)于非轉(zhuǎn)基因受體，其種子也能越冬，但在試驗條件下不會演變成超級雜草[1]。

鑒于目標性狀有效性及雜草化風險與擬推廣區(qū)環(huán)境的相關(guān)性，本試驗選取我國自主研制的轉(zhuǎn)基因抗除草劑玉米CL38-1，在擬推廣區(qū)吉林省，利用田間噴施目標除草劑方法研究其對草甘膦的耐受性；并綜合利用栽培地與荒地模擬試驗，評價其生存競爭能力。研究結(jié)果表明，噴施除草劑4周后，轉(zhuǎn)基因玉米生長正常，受害率為0，對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ锗?8顯示出明顯的藥害癥狀，植株全部枯萎死亡，受害率達到100%；不噴除草劑、噴施推薦劑量、噴施2倍推薦劑量除草劑等3個處理對轉(zhuǎn)基因玉米CL38-1植株的生長發(fā)育無明顯影響?？膳卸ㄞD(zhuǎn)基因玉米CL38-1對除草劑（草甘膦）有明顯的耐受性，達到產(chǎn)業(yè)應(yīng)用要求。

在生存競爭能力方面，栽培地和荒地試驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因玉米CL38-1與其對應(yīng)的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩灼贩N鄭58在生育期、株高、覆蓋度、產(chǎn)量等方面無明顯差異，在栽培地環(huán)境中可正常生長；在荒地條件下，較之雜草沒有競爭優(yōu)勢，無雜草化風險。

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