袁俊杰　魏霜　馬華　龍陽(yáng) 張娜 陳文 楊卓瑜

摘要：以trnH-psbA序列作為DNA條形碼，對(duì)從國(guó)外截獲的9種蒼耳屬雜草及1種國(guó)內(nèi)蒼耳進(jìn)行物種鑒定研究。采用DNeasyPlantMiniKit試劑盒進(jìn)行總DNA的提取，應(yīng)用通用引物對(duì)其trnH-psbA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序得到10種蒼耳屬雜草的trnH-psbA序列，并利用MEGA7.0軟件進(jìn)行比對(duì)分析構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果顯示：蒼耳屬雜草trnH-psbA基因序列共有543個(gè)位點(diǎn)，其中有53個(gè)變異位點(diǎn)，31個(gè)變異信息位點(diǎn)，22個(gè)單突變位點(diǎn)，30個(gè)堿基缺失；種間遺傳距離為0～0.093，種內(nèi)無(wú)遺傳差異；進(jìn)化樹(shù)顯示10個(gè)蒼耳物種均處于獨(dú)立分支，能夠利用該條形碼對(duì)蒼耳屬雜草進(jìn)行區(qū)分鑒定。

關(guān)鍵詞：trnH-psbA序列；DNA條形碼；蒼耳屬；雜草鑒定

中圖分類號(hào)：S451文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1003-935X（2016）02-0001-06

蒼耳屬（Xanthium）雜草是菊科的一類重要惡性雜草，該屬雜草幼苗具有毒性，威脅牲畜健康，成熟總苞具刺和喙，易刺傷牲畜及人類，且入侵性極強(qiáng)，一旦傳入、定植，將嚴(yán)重影響我國(guó)人畜健康和環(huán)境安全[1-2]，因此，防止蒼耳屬雜草的入侵具有重要意義。在進(jìn)出口貨物中，蒼耳屬雜草種類繁多，近似種相似性較高，鑒定困難；且種子在運(yùn)輸過(guò)程中總苞表面堅(jiān)硬的刺以及密布的柔毛等重要鑒定特征會(huì)發(fā)生較大磨損，給形態(tài)學(xué)鑒定帶來(lái)很大的難度[3-4]。因此，建立穩(wěn)定且準(zhǔn)確的分子生物學(xué)分類方法具有重要意義。

DNA條形碼（DNAbarcoding）技術(shù)是利用1段至幾段標(biāo)準(zhǔn)的、易擴(kuò)增的、種間差異顯著大于種內(nèi)差異的DNA片段來(lái)鑒別物種的新技術(shù)[5-7]，是傳統(tǒng)植物分類與鑒定的強(qiáng)有力的補(bǔ)充。張偉等在建立檢疫性雜草銀毛龍葵的DNA條形碼檢測(cè)技術(shù)中，使用來(lái)自不同基因組的3個(gè)DNA片段（tunS-trnG、ndhF、waxy）建立快速檢測(cè)方法，并在此基礎(chǔ)上探討這3個(gè)基因作為茄屬條形碼輔助片段的可能性[8]；陳冬美分析了毒麥屬種內(nèi)和種間rDNAITS區(qū)序列的差異來(lái)快速分辨鑒定6個(gè)近似種，結(jié)果與形態(tài)學(xué)分類基本一致[9]；Gao等針對(duì)菊科494屬2315種3490個(gè)樣品進(jìn)行最佳條形碼篩選，提出以ITS2作為條形碼，鑒定效率達(dá)76.4%[10]。以上研究均表明DNA條形碼技術(shù)已經(jīng)運(yùn)用在雜草鑒定上，具有一定的可行性，對(duì)口岸快速鑒定雜草籽具有重要的意義。

在口岸鑒定中須將雜草籽鑒定至種，屬于精確的物種鑒定，然而，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法需要很強(qiáng)的專業(yè)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)，受鑒定人主觀意識(shí)影響較大，所以應(yīng)該在形態(tài)學(xué)初步鑒定的基礎(chǔ)上（鑒定至科屬水平較容易），探索分子層面鑒定物種的可能性。DNA條形碼技術(shù)能夠在較短時(shí)間內(nèi)建成易被利用的應(yīng)用系統(tǒng)，使標(biāo)本鑒定過(guò)程實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化，突破對(duì)經(jīng)驗(yàn)的過(guò)度依賴，在物種分類和鑒定方面展示出強(qiáng)大的生命力。trnH-psbA片段是進(jìn)化速率最快的葉綠體間隔區(qū)之一，片段兩端存在75bp的保守序列，便于設(shè)計(jì)通用引物。該片段引物通用性較好，擴(kuò)增成功率較高，并且平均長(zhǎng)度較短（大多數(shù)在450bp左右），有利于對(duì)降解材料擴(kuò)增[11]。本研究以trnH-psbA序列作為DNA條形碼，對(duì)10種蒼耳屬雜草進(jìn)行物種區(qū)分鑒定研究，旨在為口岸雜草鑒定工作提出新思路。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的蒼耳屬雜草種子樣本是從近5年的進(jìn)境糧谷（美國(guó)黃大豆、巴西黃大豆、烏克蘭玉米、澳大利亞油菜籽、加拿大油菜籽、美國(guó)高粱等）中截獲的，具體情況如表1所示，經(jīng)中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院鑒定，憑證標(biāo)本保存于湛江出入境檢驗(yàn)檢疫局。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1DNA提取

采用改良后的DNeasyPlantMiniKit試劑盒法提取DNA，得到200μLDNA樣品，于-20℃冰箱保存。

1.2.2PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)

引物序列為trnH-psbAf-5′GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′；trnH-psbAr-5′CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′。PCR反應(yīng)使用寶生物工程（大連）有限公司的rTaq酶進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)采用50μL體系：3μLDNA模板，5μL10×PCRbuffer，4μLdNTPs，0.25μLrTaq，各1μL正反引物，補(bǔ)充ddH2O至50μL。trnH-psbA的PCR條件：95℃4min；94℃30s，52℃1min，72℃1min，35個(gè)循環(huán)；72℃10min；4℃冷卻。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、凝膠成像分析系統(tǒng)分析。

1.2.3測(cè)序及拼接

使用ABI3730XL測(cè)序儀（AppliedBiosystemsCo.，USA）對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序。利用序列拼接軟件CodonCodeAlignerV3.7.1對(duì)測(cè)序峰圖文件進(jìn)行剪切拼接，去除引物區(qū)及低質(zhì)量序列。使用Clustalt和MEGA7.0軟件對(duì)拼接后的序列進(jìn)行比對(duì)分析并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1PCR結(jié)果

從圖1可看出，10種蒼耳屬雜草的trnH-psbA序列擴(kuò)增條帶單一清晰，無(wú)特異性條帶及拖尾現(xiàn)象，與marker對(duì)比可知，該擴(kuò)增產(chǎn)物大小接近500bp，與預(yù)期大小一致。登陸NCBI，將拼接后的序列進(jìn)行BLAST檢測(cè)，結(jié)果證明10種蒼耳屬雜草的trnH-psbA序列擴(kuò)增及測(cè)序成功。

2.2堿基構(gòu)成分析

利用MEGA7.0軟件對(duì)10種蒼耳屬雜草進(jìn)行ClustalW校對(duì)，校對(duì)后的序列繼續(xù)用MEGA7.0進(jìn)行分子進(jìn)化遺傳分析。從表2可以看出，蒼耳屬雜草trnH-psbA序列的G、A、C、T堿基的變化范圍依次減小，分別為1.3%、1%、1%、0.9%。其中，G堿基含量最高的是刺蒼耳，為15.1%，最低的是北美蒼耳、球果蒼耳、西方蒼耳、賓州蒼耳、沃式蒼耳，均為13.8%；A堿基含量最高的是北美蒼耳、球果蒼耳、西方蒼耳、賓州蒼耳、沃式蒼耳，均為33.3%，最低的是蒼耳，為32.3%；C堿基含量最高的是柱果蒼耳、意大利蒼耳、河岸蒼耳，為12.8%，最低的是刺蒼耳，為11.8%；T堿基含量最高的是柱果蒼耳、意大利蒼耳、河岸蒼耳，均為40.8%，最低的是刺蒼耳，為39.9%。

2.3基因位點(diǎn)分析

由MEGA7.0測(cè)算可知，蒼耳屬雜草trnH-psbA序列共有543個(gè)位點(diǎn)，其中490個(gè)保守位點(diǎn)、53個(gè)變異位點(diǎn)、31個(gè)變異信息位點(diǎn)、22個(gè)單突變位點(diǎn)，30個(gè)堿基缺失（表3）。

2.4遺傳距離分析

同一地區(qū)樣本的不同個(gè)體序列完全相同，種內(nèi)遺傳距離為0。利用MEGA7.0軟件，采用Tajima-Nei模型計(jì)算種間遺傳距離（表4），蒼耳屬雜草trnH-psbA序列的遺傳距離最高值為0.093，為刺蒼耳與柱果蒼耳、意大利蒼耳、河岸蒼耳的遺傳距離；最小值為0.000，為北美蒼耳與球果蒼耳、西方蒼耳、賓州蒼耳、沃式蒼耳的遺傳距離。這說(shuō)明雖然北美蒼耳與球果蒼耳、西方蒼耳、賓州蒼耳、沃式蒼耳從序列上看，于449～458位點(diǎn)存在片段缺失差異，但在Kimura2-parameter模型中被忽略不計(jì)，所以從遺傳距離上無(wú)法區(qū)分。

2.5系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)

利用MEGA7.0軟件，采用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2），蒼耳、刺蒼耳被分為一支；柱果蒼耳、意大利蒼耳、河岸蒼耳被分為一支；北美蒼耳、球果蒼耳、賓州蒼耳、沃式蒼耳、西方蒼耳被分為一支；對(duì)其進(jìn)行Bootstrap檢驗(yàn)，其分組支持率為100%，說(shuō)明這3支蒼耳屬雜草在系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育中是相互獨(dú)立的。柱果蒼耳、意大利蒼耳、河岸蒼耳又被劃分為3個(gè)不同級(jí)別的分支，但其Bootstrap檢驗(yàn)支持率較低，說(shuō)明這3種蒼耳屬雜草獨(dú)立性相對(duì)較弱。北美蒼耳、球果蒼耳、賓州蒼耳、沃式蒼耳、西方蒼耳也被分為各自獨(dú)立的分支，但其Bootstrap檢驗(yàn)支持率較低，說(shuō)明這5種蒼耳屬植物獨(dú)立性相對(duì)較弱。

3結(jié)論與討論

蒼耳屬雜草種間的傳統(tǒng)鑒定方法主要依賴于形態(tài)鑒定，依靠總苞的大小、顏色，苞刺的長(zhǎng)短、疏密、碾去時(shí)的難易程度及果柄橫切面和總苞表皮毛茸的顯微特征等方面[12]。近些年發(fā)展為化學(xué)分析層面，從果實(shí)粉末的薄層色譜、紫外吸收光譜的差異分析來(lái)區(qū)分蒼耳屬種間的親緣關(guān)系[13]。然而在蒼耳屬雜草檢疫鑒定過(guò)程中存在鑒定材料不完整、化學(xué)分析耗時(shí)長(zhǎng)等問(wèn)題，難以滿足過(guò)關(guān)檢疫快速準(zhǔn)確的要求，因此筆者依據(jù)當(dāng)代分子生物學(xué)技術(shù)，利用DNA條形碼技術(shù)，開(kāi)發(fā)了可適用于蒼耳屬雜草的鑒定條形碼trnH-psbA序列。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，trnH-psbA序列可作為DNA條形碼對(duì)10種蒼耳屬雜草進(jìn)行區(qū)分，9種檢疫性蒼耳可與本地蒼耳進(jìn)行鑒定區(qū)分；將10種蒼耳屬雜草分為3個(gè)大類群，并在基因位點(diǎn)上進(jìn)一步區(qū)分，各不同檢疫性蒼耳處于獨(dú)立分支，可通過(guò)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行區(qū)別。但不足之處是，柱果蒼耳、意大利蒼耳、河岸蒼耳僅在序列397位存在點(diǎn)突變，在進(jìn)化樹(shù)中分支的Bootstrap支持率較低；西方蒼耳、賓州蒼耳在序列上完全相同，不存在變異變點(diǎn)，在進(jìn)化樹(shù)中分支的Bootstrap支持率較低。為了更好地區(qū)分其他蒼耳物種之間的區(qū)別，建議開(kāi)發(fā)其他條形碼序列進(jìn)行補(bǔ)充。

參考文獻(xiàn)：

[1]伏建國(guó)，安榆林，楊曉軍.雜草風(fēng)險(xiǎn)分析概述[J].植物檢疫，2009，23（增刊1）：39-44.

[2]諶運(yùn)清，劉翔，楊萬(wàn)風(fēng)，等.進(jìn)境大豆植物檢疫截獲疫情分析及工作建議[J].植物檢疫，2009，23（增刊1）：61-64.

[3]熊穎，劉啟德，宓穗卿.蒼耳子化學(xué)研究進(jìn)展[J].廣東藥學(xué)，2005，15（6）：65-68.

[4]高銳紅，龔大坤，張星明.蒼耳子及其偽品單喙蒼耳子的比較鑒別[J].中藥材，2001，24（6）：410-411.

[5]CBOLPlantWorkingGroup.ADNAbarcodeforlandplants[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences，2009，106（31）：12794-12797.

[6]丁潛，邢光東，胡肄農(nóng)，等.識(shí)別杜洛克豬個(gè)體身份的DNA條形碼[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2014，30（5）：1058-1063.

[7]HollingsworthPM，GradamSW，LittleDP.ChoosingandusingaplantDNAbarcode[J].PlosOne，2011，6（5）：e19254.

[8]張偉，范曉虹，邵秀玲，等.DNA條形碼在檢疫性雜草銀毛龍葵鑒定中的應(yīng)用研究[J].植物檢疫，2013，27（3）：60-65.

[9]陳冬美.毒麥屬6個(gè)種的分子檢測(cè)檢疫應(yīng)用研究[D].長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué).2007.[ZK）]

[10]GaoT，YaoH，SongJ，etal.EvaluatingthefeasibilityofusingcandidateDNAbarcodesindiscriminatingspeciesofthelargeAsteraceaefamily[J].BMCEvolutionaryBiology，2010，10（1）：324.

[11]程佳月，王麗華，彭克美，等.國(guó)際生命條形碼計(jì)劃-DNABarcoding[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2009（8）：49-53.

[12]呂益濤，侯海宮，蘇耀海，等.蒼耳屬植物的鑒別研究[J].中國(guó)中藥雜志，2001，26（1）：17-20.

[13]阮貴華，李攻科.蒼耳子的化學(xué)成分及其分離分析研究進(jìn)展[J].中成藥，2008，30（3）：421-426.