張 颯，許佳慧，柳素玲，李大強

復旦大學生物醫(yī)學研究院及腫瘤研究所，上海 200032

染色質(zhì)重塑蛋白MORC2通過調(diào)節(jié)ALDH1A3表達促進乳腺癌細胞的干性

張 颯，許佳慧，柳素玲，李大強

復旦大學生物醫(yī)學研究院及腫瘤研究所，上海 200032

背景與目的：染色質(zhì)重塑蛋白MORC家族CW型鋅指結(jié)構(gòu)蛋白2(microrchidia family CW-type zinc finger 2, MORC2)在DNA介導的基因轉(zhuǎn)錄及DNA損傷修復等基本生物學過程中發(fā)揮重要作用，但其對乳腺癌細胞生物學行為的影響目前尚無相關(guān)報道。乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)家族成員ALDH1A3(aldehyde dehydrogenase family 1 member A3，ALDH1A3)是一種公認的乳腺癌干細胞的標志物，但其在乳腺癌細胞中的調(diào)控機制目前尚不清楚。該研究擬探討敲低MORC2基因?qū)LDH1A3表達以及對乳腺癌細胞干性的影響。方法：利用短發(fā)夾RNA (short hairpin RNA，shRNA) 介導的基因沉默方法構(gòu)建穩(wěn)定敲低MORC2基因的乳腺癌細胞系；利用實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)和蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)分析敲低MORC2基因?qū)LDH1A3表達的影響；利用微球體形成實驗和流式細胞熒光分選技術(shù)(fluorescence activated cell sorting, FACS)分析敲低MORC2對乳腺癌干細胞亞群的影響。結(jié)果：Western blot和RTFQ-PCR分析結(jié)果顯示，敲低MORC2基因顯著下調(diào)ALDH1A3蛋白及mRNA水平；微球體形成實驗顯示敲低MORC2基因顯著抑制MCF-7細胞的成球能力；FACS分析顯示敲低MORC2基因顯著下調(diào)ALDH1A3陽性乳腺癌干細胞亞群, 而對CD44+CD24-乳腺癌干細胞亞群沒有明顯影響。結(jié)論：MORC2通過調(diào)節(jié)ALDH1A3的表達促進乳腺癌干細胞表型。

MORC2；ALDH1A3；乳腺癌；乳腺癌干細胞

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一［1］。在我國，近年來乳腺癌的發(fā)病率逐年上升，在大中城市尤為突出［2］。以北京和上海為例，乳腺癌已經(jīng)成為女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，有逐步接近歐美發(fā)達國家水平的趨勢［3］。大量的臨床研究表明，侵襲轉(zhuǎn)移以及治療耐藥是導致大約90%的乳腺癌患者治療失敗和死亡的最主要原因［4-5］，但其具體的分子機制目前尚不清楚。

MORC家族CW型鋅指結(jié)構(gòu)蛋白2(MORC family CW-type zinc finger 2，MORC2)屬于新的核蛋白MORC家族中的一員［6］。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析顯示(圖1)，其氨基端存在一個保守的ATP酶(ATPase) 結(jié)構(gòu)域，羧基端有一個染色體樣(chromo-like)的結(jié)構(gòu)域, 在其中間部分存在一個衍生的植物同源結(jié)構(gòu)域(divergent plant homeodomain，PHD-X)，也被稱作CW型鋅指結(jié)構(gòu)域(CW-type zinc finger，CW-ZF)［6-12］。根據(jù)包含有這些重要結(jié)構(gòu)域的其他蛋白質(zhì)的功能(圖1)，提示MORC2蛋白可能與基因轉(zhuǎn)錄以及DNA損傷修復功能有關(guān)［6，11］。

我們最近的研究發(fā)現(xiàn)，MORC2是一個新的染色體重塑蛋白，以ATP酶依賴性的方式改變?nèi)旧w的結(jié)構(gòu)從而有效地修復離子照射誘導的DNA損傷［8］。然而，迄今為止有關(guān)MORC2在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用研究甚少。其中，Wang等［13］報道MORC2蛋白主要定位于細胞核，通過轉(zhuǎn)錄抑制抑癌基因p21［14］和細胞骨架相關(guān)基因ArgBP2［15］的表達，以及PAK1蛋白激酶介導的磷酸化［16］參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展。另外，Chen等［17］利用基因芯片技術(shù)對185個三陰性乳腺癌患者的癌組織基因表達譜進行了分析，發(fā)現(xiàn)包括MORC2在內(nèi)的6個基因能預測三陰性乳腺癌的復發(fā)風險，但該研究并沒有探討MORC2基因在三陰性乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的具體作用及其分子機制。其他文獻報道細胞質(zhì)MORC2能調(diào)節(jié)脂肪細胞的分化［18］，MORC2基因在結(jié)直腸癌中存在熱點突變［19］以及在肺癌細胞中高表達［20］。綜上所述，目前我們對MORC2蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，特別是MORC2蛋白在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及其分子機制知之甚少。

圖 1 MORC2蛋白結(jié)構(gòu)域以及包含這些結(jié)構(gòu)域的其他蛋白質(zhì)的功能Fig. 1 Functional domains of MORC2 protein and the biological functions of the proteins containing these functional domains

ALDH1A3(aldehyde dehydrogenase 1 family member A3)是乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)家族的成員之一，在細胞內(nèi)主要催化醛類物質(zhì)的氧化代謝［21］。最近的研究表明，ALDH1A3是一種乳腺癌干細胞標志物［22］，并且ALDH1A3高表達與乳腺癌復發(fā)轉(zhuǎn)移以及不良預后密切相關(guān)［23］。然而，ALDH1A3在乳腺癌細胞中的調(diào)控機制目前尚不清楚。

因此，本研究主要探討MORC2對乳腺癌干細胞相關(guān)基因ALDH1A3表達以及乳腺癌細胞干性的影響。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

人乳腺癌MCF-7細胞株及HEK293T細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫，DMEM/ F12及DMEM培養(yǎng)基購自美國Mediatech公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，胰酶及PBS購自上海源培生物科技股份有限公司，細胞培養(yǎng)皿和超低黏附6孔板購自美國Mediatech公司，MORC2 shRNA(shMORC2)以及陰性對照shRNA(shNC)表達載體購自美國Origene公司，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑、TRIzol、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)、堿性成纖維生長因子(basic epidermal growth factor，bFGF)、肝素及B27購自美國Invitrogen公司，嘌呤霉素購自美國Cayman公司，RNA反轉(zhuǎn)試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司，SYBR green購自美國Bio-Rad公司，兔抗人MORC2多克隆抗體(貨號：A300-149)、兔抗人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2，HER-2)多克隆抗體(貨號：A300-623A)和兔抗人雌激素受體α(estrogen receptor α，ERα)多克隆抗體(貨號：A300-498A)均購自美國Bethyl公司，兔抗人ALDH1A3多克隆抗體購自美國Proteintech公司(貨號：25167-1-AP)，鼠抗人Vinculin單克隆抗體購自美國Sigma公司(貨號：V9131)，鼠抗人CD44熒光單克隆抗體(貨號：559942)和鼠抗人CD24 熒光單克隆抗體(貨號：555428)購自美國BD Pharmingem公司，羊抗兔IgG二抗購自美國Santa Cruz公司(貨號：sc-2004)，羊抗鼠IgG二抗購自美國Santa Cruz公司(貨號sc-2005)，ALDEFLUOR分析試劑盒購自美國STEMCELL公司(貨號：01700)。

1.2 實驗方法

1.2.1 MCF-7穩(wěn)定敲低MORC2基因的細胞系構(gòu)建

shNC及shMORC2表達載體轉(zhuǎn)染HEK293T細胞，48 h后收集病毒上清液用于感染MCF-7細胞。24 h后加入2 μg/mL的嘌呤霉素進行篩選，1～2周后獲得穩(wěn)定敲低MORC2基因的細胞系。

1.2.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR)檢測MORC2及ALDH1A3的表達水平

TRIzol法提取細胞總RNA，取1 μg RNA按照寶生物工程(大連)有限公司的PrimeScriptRTRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄反應體系為10 μL，反轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃，30 min，85 ℃，15 s。反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA用ddH2O稀釋5倍作為RTFQ-PCR的反應模板，于Eppendorf PCR儀對MORC2和ALDH1A3基因進行擴增和檢測，內(nèi)參基因為β-actin。RTFQ-PCR具體反應條件為反應條件為95 ℃預變性3 min、95 ℃變性15 s、57 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，擴增40個循環(huán)。RTFQ-PCR所得結(jié)果用2-ΔΔCt法分析。

RTFQ-PCR所用引物序列：MORC2順義鏈為AAGCCGTTTCAAGACC，反義鏈為GTCGCAACATCACCCT；ALDH1A3順義鏈為TTAAAGAAGCTGCGTCCCG，反義鏈為CACTCCACTGCCAAGTCCAA；β-actin順義鏈為AGCCATGTACGTAGCCATCC，反義鏈為CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA。

1.2.3 蛋白［質(zhì)］印跡法(Western blot)檢測實驗

采用RIPA裂解液(含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)于4 ℃搖床裂解細胞20 min，然后20 000×g 于4 ℃離心20 min，取蛋白上清液用BCA法進行蛋白定量。取相同蛋白量樣品加4×上樣緩沖液于100 ℃加熱5 min，離心后上樣。采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%的牛血清白蛋白(BSA)的封閉液于室溫封閉1 h后分別加入MORC2(1∶2 000稀釋)、ALDH1A3(1∶2 000稀釋)、HER-2(1∶2 000稀釋)、ERα(1∶2 000稀釋)和Vinculin(1∶5 000稀釋)抗體，于4 ℃搖床溫育過夜。第二天用PBST洗膜3次，每次10 min，然后分別加入1∶5 000稀釋的HRP標記的羊抗兔或羊抗鼠二抗，室溫溫育1 h，用PBST漂洗3次，每次10 min，然后用ECL發(fā)光液發(fā)光。

1.2.4 微球體形成實驗檢測微球體形成情況

取對數(shù)期生長的MCF-7細胞，用含表皮生長因子 (EGF 20 ng/mL)、堿性成纖維生長因子(bFGF 10 ng/mL)、肝素(4 ng/mL)和B27(1×)的DMEM/F12的培養(yǎng)液重懸，接種至超低黏附6孔板中，在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%的條件下進行培養(yǎng)，每3天換1次液，培養(yǎng)兩周后于倒置顯微鏡下拍照觀察微球體形成情況并計數(shù)，直徑大于200 μm的記為一個微球，統(tǒng)計并分析各組微球體形成數(shù)量。

1.2.5 FACS分析敲低MORC2基因?qū)LDH陽性乳腺癌干細胞亞群的影響

ALDEFLUOR試劑盒是以ALDH的活性為基礎(chǔ)［22］。ALDH可以將ALDH的底物BAAA(BodipyTM-aminoacetaldehyde)轉(zhuǎn)化為熒光產(chǎn)物BAA(BodipyTM-aminoacetate)。ALDH高表達的細胞呈現(xiàn)明亮的熒光(ALDHbr)，可以通過流式細胞儀進行分選和評估。用含2%胎牛血清(FBS)的PBS重懸經(jīng)胰酶消化的細胞(加入的量取決于細胞團塊的大小)，并進行細胞計數(shù)。在TEST管加入1×106個細胞，離心后去上清液。用Aldefluor檢測緩沖液按照細胞濃度為1×106個/mL重懸細胞，在DEAB管中加入5 μL的DEAB溶液(抑制劑)，立刻蓋上蓋子。在TEST管中加入5 μL活化的BAAA(1×106個細胞)，混合均勻，立刻把TEST溶液中的0.3 mL細胞轉(zhuǎn)移到對應的DEAB管中，混勻并蓋上蓋子。將所有流式管置于37 ℃培養(yǎng)箱中避光溫育40 min。加入含有2%FBS的PBS，離心棄去上清液洗去多余的抗體，重復洗2～3次。在TEST管和DEAB管中加入含 2% FBS的PBS和DAPI重懸細胞(每300～500 μL 1×106個細胞)。把樣品保存在冰上置于黑暗環(huán)境中，轉(zhuǎn)移到流式細胞儀(型號：MOFLO ASTRIOS)上檢測。

1.2.6 FACS分析敲低MORC2基因?qū)D44+CD24-乳腺癌干細胞亞群的影響

用含2%FBS的PBS重懸經(jīng)胰酶消化的細胞(加入的量取決于細胞團塊的大小)，并進行細胞計數(shù)。在TEST管和CTRL管中分別加入0.5×106個細胞，離心后去上清液。用含2%FBS的PBS以適當比例稀釋抗體，然后在TEST管中加入50 μL抗體稀釋液(每100 μL 1×106個細胞)。將TEST管置于冰上避光溫育30 min，用含有2% FBS的PBS也洗滌2～3次。在TEST管和CTRL管中加入含有2%FBS的PBS和DAPI重懸細胞(每300～500 μL 1×106個細胞)。把樣品保存在冰上置于黑暗環(huán)境中，轉(zhuǎn)移到流式細胞儀(型號：MOFLO ASTRIOS)上檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，兩組樣品均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 MCF-7穩(wěn)定敲低MORC2基因細胞系的鑒定

本研究采用Western blot方法分析MORC2及ALDH1A3在10種常用的乳腺癌細胞系中的表達情況，同時分析ERα以及HER-2的表達狀態(tài)作為陽性對照。與以前報道的結(jié)果一致，MCF-7、T47D、ZR-75-1以及BT474細胞表達ERα，而BT474、SK-BR-3以及MDA-MB-453細胞表達HER-2(圖2A)，表明這10種乳腺癌細胞系生物學特征無誤。另外，MORC2在大多數(shù)乳腺癌細胞系中均高表達，而ALDH1A3在SK-BR-3、ZR-75-30、MDA-MB-468以及Hs578T細胞系中表達水平最高(圖2A)。根據(jù)以上結(jié)果，我們選擇最常用的MCF-7乳腺癌細胞系作為模型，采用慢病毒感染的方法建立穩(wěn)定敲低MORC2的細胞系，然后分別提取蛋白質(zhì)和RNA進行Western blot以及RTFQ-PCR分析以驗證MORC2敲低情況。結(jié)果顯示，與shNC對照細胞相比，MORC2蛋白(圖2B)和mRNA (圖2C)水平在shMORC2感染細胞中均顯著下調(diào)，提示MORC2基因在MCF-7細胞中穩(wěn)定敲低。

2.2 Western blot法和RTFQ-PCR分析檢測敲低MORC2基因?qū)LDH1A3蛋白和mRNA表達水平的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照shNC細胞相比，ALDH1A3蛋白表達水平在shMORC2細胞中下調(diào)達60%(圖3A)。RTFQ-PCR分析結(jié)果顯示，與對照shNC細胞相比，ALDH1A3 mRNA水平在MORC2基因敲低細胞中下調(diào)了70%(P＜0.05，圖3B)。這些結(jié)果表明，MORC2作為一個染色質(zhì)重塑蛋白的基因轉(zhuǎn)錄激活ALDH1A3基因的表達。

2.3 敲低MORC2基因?qū)CF-7細胞微球體形成能力的影響

穩(wěn)定敲低MORC2基因的MCF-7細胞用微球體培養(yǎng)液培養(yǎng)兩周后在倒置顯微鏡下觀察、拍照。結(jié)果顯示，shNC組微球體形成數(shù)量顯著多于shMORC2組(圖4A)。定量結(jié)果顯示，與對照組相比，MORC2基因敲低組細胞成球數(shù)量下調(diào)50%(圖4B)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。表明敲低MORC2能顯著降低MCF-7細胞的成球能力，提示MORC2促進乳腺癌干細胞特性的改變。

圖 2 10種乳腺癌細胞系中MORC2蛋白表達水平的檢測及穩(wěn)定敲低MORC2基因的MCF-7乳腺癌細胞系的建立Fig. 2 Detection of MORC2 protein levels in 10 breast cancer cell lines and establishment of MCF-7 stable clone cells expressing shNC and shMORC2

2.4 流式細胞術(shù)檢測敲低MORC2對乳腺癌細胞干細胞亞群的影響

最近發(fā)現(xiàn)了一種鑒定乳腺癌干細胞的新方法，即利用 ALDEFLUOR試劑來檢測細胞中的ALDH活性［22］。表達高水平ALDH的細胞會發(fā)出熒光并且能夠通過流式細胞術(shù)被檢測到。我們利用此方法分析發(fā)現(xiàn)，MORC2基因敲低后ALDH酶的活性從0.98%下降到0.22%(圖5A)?？紤]到ALDH比例可作為干細胞分離的標志，這些結(jié)果表明敲低MORC2能減少MCF-7細胞中干細胞數(shù)量，即下調(diào)MCF-7細胞的干性。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，敲低MORC2對CD44+CD24-乳腺癌干細胞亞群沒有明顯影響(圖5B)。

圖 3 Western blot檢測和RTFQ-PCR分析敲低MORC2對ALDH1A3蛋白及mRNA水平的影響Fig. 3 Western blot and RTFQ-PCR analysis of the effects of MORC2 knockdown on the protein and mRNA level of ALDH1A3

圖 4 微球體形成實驗檢測敲低MORC2對MCF-7細胞成球能力的影響Fig. 4 Analysis of mammosphere formation ability in MCF-7 cells stably expressing shNC and shMORC2

圖 5 敲低MORC2對乳腺癌干細胞亞群的影響Fig.5 Effects of knockdown of endogenous MORC2 by specific shRNAs targeting human MORC2 on breast cancer stem cell population

3 討 論

自2003年Al-Hajj等［24］從乳腺癌患者標本中分離得到乳腺癌干細胞以來，乳腺癌干細胞在乳腺癌轉(zhuǎn)移及耐藥性發(fā)生過程中的關(guān)鍵作用日益受到重視［25］。因此，深入研究乳腺癌干細胞在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的關(guān)鍵作用、探索有效針對乳腺癌干細胞的治療策略是乳腺癌防治的一個新方向。本研究通Western blot和RTFQ-PCR方法分析發(fā)現(xiàn)在穩(wěn)定敲低MORC2的MCF-7細胞系中MORC2可以正向調(diào)控乳腺癌干細胞相關(guān)基因ALDH1A3的表達。功能實驗分析進一步證實，敲低MORC2基因能顯著降低MCF-7細胞的成球能力以及ALDH陽性乳腺癌干細胞亞群的數(shù)量。這些結(jié)果表明MORC2基因沉默顯著下調(diào)ALDH1A3基因的表達以及抑制MCF-7細胞的干性。基于此研究結(jié)果，我們推測MORC2有可能是未來干細胞治療乳腺癌的有效靶點。

本研究發(fā)現(xiàn)了MORC2正向調(diào)控ALDH1A3基因的表達，但MORC2調(diào)控ALDH1A3基因表達的分子機制有待進一步深入研究。另外，本研究僅在乳腺癌MCF-7細胞系中對MORC2-ALDH1A3通路進行了研究，是否該信號通路在其他乳腺癌細胞系中可得到證實將是我們今后研究的另外一個重點。

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Chromatin remodeling protein MORC2 promotes a breast cancer stem-like phenotype by regulating

ALDH1A3 expression

ZHANG Sa, XU Jiahui, LIU Suling, LI Daqiang (Institutes of Biomedical Sciences and Cancer Institute, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

Correspondence to: LI Daqiang E-mail: daqiangli1974@fudan.edu.cn

Background and purpose: MORC2 (microrchidia family CW-type zinc finger 2, MORC2) is a newly identified chromatin remodeling protein that plays key roles in DNA-based biological processes including gene transcription and DNA damage repair. However, its functional role in breast cancer development and progression remains unknown. ALDH1A3 (aldehyde dehydrogenase 1 family member A3), a member of the aldehyde dehydrogenases (ALDH) superfamily, is a putative breast cancer stem cell marker, but its regulatory mechanism in breast cancer is poorly characterized. This study aimed to investigate the effects of knockdown of endogenous MORC2 on the expression levels of ALDH1A3 and the breast cancer stem-like phenotype in MCF-7 cells. Methods: Human breast cancer MCF-7 cells were infected with negative control short hairpin RNAs (shNC) and specific shRNAs targeting human MORC2 (shMORC2), followed by selection with puromycin to generate stable MORC2 gene knockdown cell lines. Western blot and real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (RTFQ-PCR) were used to examine the protein and mRNA levels of ALDH1A3 in MCF-7 cells stably expressing shNC and shMORC2. Microsphere formation and fluorescence-activated cell sorting (FACS) assays were used to analyze the effects of knockdown of MORC2 on the breast cancer stem-like phenotype. Results: Western blot and RTFQ-PCR analyses revealed that the protein and mRNA levels of ALDH1A3 were significantly down-regulated in shMORC2 expressing cells as compared with shNC -transfectedcontrol cells. Moreover, mammosphere formation assay showed that knockdown of endogenous MORC2 in MCF-7 cells significantly reduced the ability of cells to form microspheres. Consistently, FACS assays demonstrated that shMORC2-transfected cells had a lower proportion of ALDH-positive stem cells as compared with shNC expressing cells. In contrast, knockdown of MORC2 did not significantly affect the CD44+CD24-stem cell population. Conclusion: MORC2 promotes a breast cancer stem-like phenotype through, at least in part, regulating ALDH1A3 expression.

MORC2; ALDH1A3; Breast cancer; Breast cancer stem cells

10.19401/j.cnki.1007-3639.2017.03.001

R737.9

A

1007-3639(2017)03-0161-08

2016-09-15

2016-12-10）

國家自然科學基金(81372847)。

李大強 E-mail:daqiangli1974@fudan.edu.cn