裘紀(jì)瑩,趙雙枝,趙玉忠,陳蕾蕾,王同燕,王未名,*

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所/山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東濟(jì)南 250100; 2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院,山東濟(jì)南 250062)

裘紀(jì)瑩1,趙雙枝1,趙玉忠2,陳蕾蕾1,王同燕1,王未名1,*

(1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所/山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東濟(jì)南 250100; 2.山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院,山東濟(jì)南 250062)

建立了采用高壓半制備液相色譜制備石菖蒲中β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚高純單體化合物的方法。首先以石菖蒲為原料制備石菖蒲揮發(fā)油,然后采用高壓半制備液相色譜,設(shè)定流動(dòng)相為甲醇∶水=65∶35(v/v),對(duì)β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚進(jìn)行精制純化。產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)采用EI-MS、1H-NMR 和13C-NMR進(jìn)行鑒定,而且它們的純度分別達(dá)到99.43%和99.08%。該方法操作簡(jiǎn)單、制備量大、產(chǎn)物純度高,可用于石菖蒲中高純度β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚對(duì)照品的制備。

石菖蒲,高壓半制備液相色譜法,β-細(xì)辛醚,α-細(xì)辛醚,純化

石菖蒲為天南星科多年生草本植物石菖蒲(AcorustatarinowiiSchott)的干燥根莖,具有豁痰開竅、化濕和胃、醒神益智、芳香寧神的功效[1]。近代藥理學(xué)研究表明石菖蒲的有效成分——揮發(fā)油對(duì)中樞神經(jīng)、心血管、呼吸和消化等多種系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用[2],其主要有效成分為β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚(圖1)[3]。同時(shí)研究表明,β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚在抗腫瘤、治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病及抗炎方面均具有良好的藥效[4-7]?？梢?制備β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚高純單體化合物對(duì)于石菖蒲藥材的質(zhì)量控制、成藥的生產(chǎn)工藝優(yōu)化和質(zhì)量控制以及β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚的藥理學(xué)研究等都非常重要。

高壓半制備/制備液相色譜技術(shù)是目前發(fā)展迅速的一種快速分離純化技術(shù),該技術(shù)在分析型高效液相色譜技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展而來,具有上樣量大、分離度和靈敏度高、分離速度快和目標(biāo)化合物純度高等特點(diǎn),是目前半制備/制備高純度單體化合物的優(yōu)選手段[8]。如王智聰?shù)萚9]采用高壓制備液相色譜法制備沒食子兒茶素沒食子酸酯高純單體化合物,結(jié)果顯示該方法操作簡(jiǎn)單、制備量大、收率高、產(chǎn)物純度高,可用于沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制。丁雯靜等[10]采用快速制備液相色譜從庫拉索蘆薈中高效分離制備了10-羥基蘆薈大黃素苷A和B,結(jié)果顯示該方法簡(jiǎn)便、快速,所得產(chǎn)物純度較高,可用于對(duì)照品的制備和藥理毒理活性研究。本文以石菖蒲為原料制備其揮發(fā)油,并采用高壓半制備液相色譜法對(duì)其進(jìn)行精制純化和結(jié)構(gòu)鑒定,最后得到高純度的β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚,以期為采用高壓制備液相色譜法制備石菖蒲中的β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)提供參考。

圖1 α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1 The structures of α-asarone and β-asarone

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石菖蒲藥材 濟(jì)南建聯(lián)中藥店;甲醇 色譜級(jí),山東禹王試劑有限公司;乙醇、石油醚等 均為分析純,天津市廣成化學(xué)試劑廠。

安捷倫1200分析型高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司;島津LC-6A高壓半制備液相色譜儀 日本島津公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 石菖蒲揮發(fā)油的制備 制備方法參照文獻(xiàn)[2],具體為:稱取一定量的石菖蒲藥材,采用50%乙醇回流提取3次,合并提取液,提取液濃縮至無醇味,過濾,將沉淀部分減壓干燥后用石油醚回流提取3次,合并石油醚提取液,回收溶劑至干,既得石菖蒲揮發(fā)油提取物。

1.2.2 高壓半制備液相色譜分離 將上述提取物用100%甲醇溶解,通過0.45 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣量200 μL,根據(jù)色譜圖接收餾分,對(duì)所得餾分采用HPLC面積歸一法[11]進(jìn)行純度檢測(cè),采用EI-MS、1H-NMR和13C-NMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

1.2.3 液相色譜條件 分析采用1200型高效液相色譜儀,配置G1311A型四元梯度泵,G1329A型自動(dòng)控溫進(jìn)樣器,G1314B型可變波長(zhǎng)檢測(cè)器,G1316A型柱溫箱,Agilent Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相為甲醇-水(70∶30,v/v),流速1.0 mL/min,進(jìn)樣量10 μL。制備采用島津LC-6A高壓半制備液相色譜儀,配置YMC色譜柱(20 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相為甲醇-水(65∶35,v/v),流速10.0 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)均為254 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 石菖蒲有效部位的高壓半制備液相色譜分離結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)采用不同洗脫條件、不同進(jìn)樣體積對(duì)α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚進(jìn)行分離,結(jié)果發(fā)現(xiàn),采用甲醇-水體系作為流動(dòng)相,甲醇的比例越高,α-細(xì)辛醚和β-細(xì)辛醚的保留時(shí)間越短,可縮短兩種產(chǎn)物的制備周期,但兩者的分離度下降,從而使產(chǎn)物純度下降。降低甲醇比例可提高兩者的分離度,但同時(shí)延長(zhǎng)了產(chǎn)物的制備周期,使制備成本上升。在采用半制備液相色譜進(jìn)行分離純化時(shí),進(jìn)樣體積同樣影響分離效果,過大的進(jìn)樣量使產(chǎn)物峰產(chǎn)生平頭峰,從而使保留時(shí)間延后,影響分離度,而過小的進(jìn)樣量又達(dá)不到制備的目的。通過多次實(shí)驗(yàn)表明,當(dāng)流動(dòng)相條件為甲醇-水(65∶35,v/v),流速10.0 mL/min時(shí),洗脫時(shí)間合適,同時(shí)當(dāng)進(jìn)樣量為200 μL,可實(shí)現(xiàn)兩個(gè)峰的較好分離,最終制備得到β-細(xì)辛醚(峰1)和α-細(xì)辛醚(峰2),純度分別為99.43%和99.08%,半制備液相色譜圖和制備產(chǎn)物液相色譜圖分別見圖2、圖3。

圖2 石菖蒲揮發(fā)油提取液的高壓半制備液相色譜圖Fig.2 Chromatogram of semi-preparative HPLC of volatile oil extract of Acorus tatarinowii Schott注:峰1:β-細(xì)辛醚,峰2:α-細(xì)辛醚。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

化合物1(圖2-峰1):EI-MS:m/z 208[M]+,193[M-CH3]+,165[M-CH3CO]+,162.1[M-CH3HOCH2]+。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:1.86(3H,dd,J=1.5,7.5 Hz,H-3′),3.82,3.86,3.91(each,3H,s,OCH3),5.77(1H,dq,J=7.2,11.4,H-2′),6.46(1H,dq,br d,H-1′),6.55(1H,s,H-3),6.88(1H,s,H-6)。13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:14.7(C-3′),56.1(OCH3),56.4(OCH3),56.6(OCH3),97.5(C-3),114.1(C-6),118.0(C-5),124.8(C-2′),125.8(C-1′),142.4(C-1),148.5(C-2),151.5(C-4)。通過與文獻(xiàn)[12]比較,化合物1被鑒定為β-細(xì)辛醚(β-asarone)。

化合物2(圖2-峰2):EI-MS:m/z 208[M]+,193[M-CH3]+,165[M-CH3CO]+,162[M-CH3HOCH2]+。1H-NMR(600 MHz,CDCl3)δ:1.87(3H,dd,J=1.2,7.2 Hz,H-3′),3.81,3.85,3.88(each,3H,s,OCH3),6.12(1H,dq,J=6.6,15.6,H-2′),6.67(1H,dq,br d,H-1′),6.50(1H,s,H-3),6.96(1H,s,

圖3 石菖蒲揮發(fā)油及純化物的液相色譜圖Fig. 3 HPLC chromatograms of the volatile oil extract of Acorus tatarinowii Schott and the purified products注:A:石菖蒲揮發(fā)油提取物,B:β-細(xì)辛醚,C:α-細(xì)辛醚。

H-6)。13C-NMR(150 MHz,CDCl3)δ:18.8(C-3′),56.1(OCH3),56.5(OCH3),56.7(OCH3),97.9(C-3),109.7(C-6),119.0(C-5),124.3(C-2′),125.0(C-1′),143.3(C-1),148.7(C-2),150.6(C-4)。通過與文獻(xiàn)[13]比較,化合物2被鑒定為α-細(xì)辛醚(α-asarone)。

3 結(jié)論

本文首次采用高壓半制備液相色譜法對(duì)石菖蒲藥材的主要有效成分β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚進(jìn)行一步式分離純化,該方法操作簡(jiǎn)單、制備量大、產(chǎn)物純度高,可用于石菖蒲中高純度β-細(xì)辛醚和α-細(xì)辛醚對(duì)照品的制備。

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Preparation of high purityβ-asarone andα-asarone fromAcorustatarinowiiSchott

QIU Ji-ying1,ZHAO Shuang-zhi1,ZHAO Yu-zhong2,CHEN Lei-lei1,WANG Tong-yan1,WANG Wei-ming1,*

(1.Institute of Agro-Food Science and Technology & Shandong Provincial Key Laboratory of Agro-Products Processing Technology,Shandong Academy of Agricultural Sciences,Jinan 250100,China; 2.Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan 250062,China)

To establish a method for preparation of high purityβ-asarone andα-asarone fromAcorustatarinowiiSchott by high pressure semi-preparative liquid chromatography,its volatile oil was prepared fromAcorustatarinowiiSchott,and a semi-preparative high performance liquid chromatography was used to refine and purifyβ-asarone andα-asarone with a solvent composed of methanol and water(65∶35,v/v). The structures of product were identified by EI-MS,1H-NMR and13C-NMR,and their purities reached 99.43% and 99.08%,respectively. The method is easily operated,with high purity and preparation amount. It is suitable for high purityβ-asarone andα-asarone reference material preparation fromAcorustatarinowiiSchott.

AcorustatarinowiiSchott;high pressure semi-preparative liquid chromatography;β-asarone;α-asarone;purification

2016-12-27

裘紀(jì)瑩(1981-)，女，碩士，助理研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工方面的研究，E-mail：qjyfood@163.com。

*通訊作者:王未名(1957-)，男，學(xué)士，研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工方面的研究，E-mail：wweiming@163.com。

山東省自然科學(xué)基金三院聯(lián)合基金項(xiàng)目(ZR2014YL020)；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科研基金項(xiàng)目(2014QNM47)；泰山學(xué)者建設(shè)工程專項(xiàng)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)07-0293-03

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.048