艾 薇,劉經(jīng)倫,李曉嬌

(保山學院 資源環(huán)境學院,云南保山 678000)

羅勒精油的微波輔助提取工藝及其抑菌效果研究

艾 薇,劉經(jīng)倫,李曉嬌

(保山學院 資源環(huán)境學院,云南保山 678000)

采用微波輔助提取羅勒精油,優(yōu)化了實驗條件對精油得率的影響。在單因素實驗的基礎(chǔ)上,通過正交實驗對提取工藝進行優(yōu)化。將所得精油作為抑菌劑,結(jié)合濾紙片法和二倍稀釋法,確定了羅勒精油的抑菌活性和最低抑菌濃度(MIC)、最低殺菌濃度(MBC)。結(jié)果表明:選用粗粉碎干料羅勒,在料液比1∶16 g/mL,NaCl濃度4%,浸泡時間6 h,微波功率567 W,微波時間120 s的條件下,羅勒精油的最佳得率為0.3758%(n=3)。羅勒精油對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌均有抑制作用,最低抑菌濃度分別為31.25、62.5、125 μg/mL,最低殺菌濃度分別為31.25、125、500 μg/mL,表明抑菌作用大小為:大腸桿菌(E.coli)>枯草芽孢桿菌(B.subtilis)>金黃色葡萄球菌(S.auTeus)。該研究為羅勒的綜合利用與開發(fā)提供了理論依據(jù)。

羅勒,精油,微波輔助提取,抑菌效果

羅勒(OcimumbasilicumLinn)為唇形科羅勒屬一年生芳香草本植物,又名甜羅勒、九層塔、丁香等[1]。羅勒分布于熱帶和溫帶地區(qū)[2],因其藥食兼用的特性,被廣泛的用于各少數(shù)民族食物烹制和藥材使用。在云南,羅勒別名轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)香、帕友新(傣語),是傣族、景頗族不可缺少的一種調(diào)味料,在傣味食材中用于熟食或作涼拌。在維藥和中醫(yī)理論中,羅勒也用于疏風解表、化濕和中、行氣活血、解毒消腫等[3-4]。近幾年關(guān)于羅勒藥理研究表明羅勒提取物具有抗炎殺菌、抗病毒、抗血栓形成、抗腫瘤轉(zhuǎn)移、抗氧化、降血糖、降血脂等作用[2-3,5],以鮮嫩花葉最佳,味辛,性溫。

經(jīng)查閱文獻,對羅勒的研究集中在引種栽培[6]、化學成分[7]、藥理[3,5]、黃酮提取[4,8]、多糖提取[9]及腫瘤治療[10]等幾個方面,而在羅勒精油提取方面的研究報道很少。張文成等[11]研究表明,分別采用水蒸氣蒸餾法和SFC-CO2萃取,羅勒揮發(fā)油的出油率和主要成分差異都較大。任吉君等[12]探索出SFC-CO2萃取羅勒芳香油的最優(yōu)條件為陰干與萃取壓力15 MPa。曹維金等[13]研究表明,3種羅勒子油提取法：溶劑浸出法、索氏抽提法和氯仿-甲醇法中,氯仿-甲醇法提取率最高、提取時間最短。國外學者對采自伊朗的兩種人工種植的羅勒揮發(fā)油進行分析,結(jié)果顯示含量最高的皆為甲基胡椒酚[14];也有國外學者報道羅勒中含有菊苣酸、迷迭香酸、咖啡酸[15]。Jamal等[16]研究表明,花和葉的組織中酚酸主要為迷迭香酸。近年來植物精油具有良好的抑菌抗炎活性,且較化學抑菌劑具有副作用和殘留毒性小的優(yōu)勢,進而使其在抑菌研究方面得到了廣泛的關(guān)注,而用微波輔助提取羅勒精油并研究其抑菌活性卻沒有報道。本文采用微波輔助的方法提取羅勒枝葉干料中的精油,且以精油得率為指標,采用L9(34)正交表進行實驗,確定最佳工藝參數(shù),并在此基礎(chǔ)上對其抑菌效果進行研究,旨在為精油的深加工及藥理作用提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

羅勒 原料購于保山市農(nóng)貿(mào)市場,經(jīng)洗凈放陰涼處風干,用粉碎機粉碎,再用密封袋密封保存?zhèn)溆茫欢讈嗧?、無水乙醇、蛋白胨、氯化鈉、乙醚、硫酸鎂 分析純,國藥集團化學試劑有限公司；大腸埃希氏菌Escherichiacoli標準菌株ATCC25922，金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus標準菌株ATCC259226538，枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis標準菌株ATCC6633 廣東微生物菌種保藏中心。

Q/OANN 10-2008電子天平 奧豪斯儀器上海有限公司;G70F20N2L-DG(SO)微波爐 格蘭仕微波爐電器有限公司;LDZX-75KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;HZQ-X100A恒溫培養(yǎng)箱、HZQ-F160A高低溫恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 精油得率的計算 根據(jù)楊艷等[17]采用微波輔助水蒸氣蒸餾法提取孜然精油工藝的研究,本研究采用類似的工藝流程,略作改動。稱取羅勒枝葉粉末20 g,料液比1∶20(m∶v,g/mL,下同)浸泡在4% NaCl溶液中2 h,微波功率為567 W,輔助加熱120 s,水蒸氣蒸餾法提取羅勒精油,用乙醚萃取。羅勒精油的得率參考何君等[18]的計算方法,即:

式中:A1-提取精油的質(zhì)量,g;A2-羅勒枝葉粉末的質(zhì)量,g。

1.2.2 單因素實驗 稱取羅勒枝葉粉末20 g,以羅勒精油得率為考察指標,固定料液比為1∶20 g/mL,NaCl濃度為4%,浸泡時間為2 h,微波功率為567 W輔助加熱120 s,依次對其進行不同水平的NaCl濃度(2%、3%、4%、5%、6%)、浸泡時間(2、4、6、8、10 h)、料液比(1∶16、1∶18、1∶20、1∶22、1∶24 g/mL)、微波功率(126、252、406、567、700 W)、微波時間(60、90、120、150、180 s)的單因素實驗,測定方法同 1.2.1。

1.2.3 最優(yōu)工藝條件的選擇 通過單因素實驗的結(jié)果分析,篩選了浸泡時間、料液比、微波功率、微波時間等因素進行優(yōu)化(正交實驗的各因素及其水平見表1),建立L9(34)的正交實驗,確定羅勒精油提取的最優(yōu)工藝條件參數(shù)。

表1 正交實驗因素及水平Table 1 Factor and levels of orthogonal experiment

1.2.4 精油抑菌實驗

1.2.4.1 菌種活化及菌懸液的制備 用接種環(huán)挑取適量的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌于LB液體培養(yǎng)基中進行活化,37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取一環(huán)已活化的菌苔放入100 mL無菌生理鹽水中,搖勻菌懸液,150 r/min振蕩培養(yǎng),37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.2.4.2 不同濃度羅勒精油的制備 用二倍稀釋法[19]配制不同濃度羅勒精油。稱取2000 μg羅勒精油,用二甲亞砜制備1000 μg/mL的精油溶液,采用二倍稀釋法稀釋為以下幾個濃度:1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 μg/mL。放置冰箱中冷凍保存,備用。

1.2.4.3 不同羅勒精油濃度對3種細菌抑制活性實驗 濾紙片法[20]測定抑菌活性,每皿設計四片濾紙片。紙片法判定標準[21]:極敏:抑菌圈直徑>20 mm;高敏:抑菌圈直徑15～19 mm;中敏:抑菌圈直徑10～15 mm;低敏:抑菌圈直徑<10 mm。具體方法如下:用無菌的移液槍吸取0.1 mL菌懸液至已冷卻的LB固體培養(yǎng)基中,用無菌涂布器均勻涂布,晾干后,將3片浸入不同濃度的羅勒精油,直徑為6 mm的圓形無菌濾紙片,等距離放置于培養(yǎng)基中,以二甲亞砜作空白對照組。細菌的培養(yǎng)條件參照1.2.4.1,如有抑菌圈說明對供試菌具有抑菌作用,無抑菌圈則說明對供試菌無抑菌作用。

1.2.4.4 最低抑菌濃度(MIC)測定和最低殺菌濃度(MBC)測定 將制備好的羅勒精油濃度1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 μg/mL的溶液用濾紙片法測定精油的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度,具體方法參照1.2.4.3,重復三次,取平均值。細菌置于37 ℃下培養(yǎng)24 h,以完全沒有菌生長的最低濃度作為該精油的最低抑菌濃度(MIC)[22]。把上述沒有長菌的培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)48 h后觀察,以完全無菌生長的濃度為最低殺菌濃度(MBC)[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅勒精油的單因素實驗

2.1.1 NaCl濃度對羅勒精油得率的影響 如圖1所示,隨著NaCl濃度的增加,羅勒精油得率也相對增加,但是當NaCl濃度超過4%,精油得率就開始減少。加入NaCl溶液能夠增大植物細胞內(nèi)外滲透壓差,使精油能夠容易溶出,也可能對精油揮發(fā)性及溶解性有一定的影響[18],所以NaCl濃度控制在4%左右較合適。

圖1 NaCl濃度對羅勒精油得率的影響Fig.1 Effect of concentration of NaCl on extraction yield of essential oil注：標注不同字母表示數(shù)據(jù)有顯著差異(p<0.05),圖2～圖5同。

2.1.2 浸泡時間對羅勒精油得率的影響 如圖2所示,在一定浸泡時間內(nèi),精油得率有所增加,浸泡時間為8 h時達到最大值0.39%,當浸泡時間超過這個時間段,精油得率反而減少。這是由于精油具有揮發(fā)性,長期暴露在空氣中易揮發(fā)。因此,浸泡時間在4～8 h左右精油得率較高。

圖2 浸泡時間對羅勒精油得率的影響Fig.2 Effects of soaking time on extraction yield of essential oil

2.1.3 料液比對羅勒精油得率的影響 如圖3所示,在其他因素不變的情況下,料液比在1∶16～1∶20之間精油得率增加緩慢;當料液比增大到1∶20后,得率急劇減少;在料液比為1∶20時,羅勒精油得率為0.30%,達到最大值。隨著料液比的增大,精油得率逐漸增大,由于滲入細胞內(nèi)的水分迅速升溫,使細胞內(nèi)壓急劇增大,導致細胞破裂,使水蒸汽更容易將精油帶出;但隨著料液比進一步增加,得率下降,同時增加能耗和時間,液面厚度可能一定程度上影響了微波的吸收[17]。因此羅勒精油提取的料液比控制在1∶20。

圖3 料液比對羅勒精油得率的影響Fig.3 Effects of solid-liquid ratio on extraction yield of essential oil

圖4 微波功率對羅勒精油得率的影響Fig.4 Effects of microwave power on extraction yield of essential oil

2.1.4 微波功率對羅勒精油得率的影響 如圖4所示,微波功率為126～252 W時無明顯變化,當微波功率增大到406 W時急劇增大,在567 W時達到最大值,超過567 W提取率又開始降低。這是因為外加電場作用增強,微波引起的極性分子如水的極化作用增強,此時,分子熱運動動能增大,可以在較短的時間內(nèi)得到精油;但隨著功率繼續(xù)增大,得率下降,溶液中物質(zhì)也可能容易發(fā)生氧化分解[17]。因此,微波功率在567 W時精油得率最佳。

2.1.5 微波時間對羅勒精油得率的影響 如圖5所示,隨著微波時間的增長(60～120 s),精油得率開始增加,達到120 s時羅勒精油的得率到達最高點,繼續(xù)延長微波時間,精油得率又開始逐漸下降。這可能是由于微波對羅勒細胞具有破膜作用,處理時間長,羅勒細胞破膜速度增大,羅勒精油得率增加,當微波處理時間超過120 s時,羅勒細胞被破壞強烈,導致精油乳化現(xiàn)象嚴重,且由于細胞膜的破壞,導致雜質(zhì)進入到精油中,因此得率下降[23]。因此,微波時間在120 s時用微波輔助水蒸汽蒸餾法提取羅勒精油的得率最佳。

圖5 微波時間對羅勒精油得率的影響Fig.5 Effects of microwave time on extraction yield of essential oil

2.2 正交實驗優(yōu)化羅勒精油提取工藝

由表2可得,從羅勒精油提取得率的直觀分析結(jié)果看,最佳工藝為5號實驗A2B2C3D1,但從極差分析可知羅勒精油提取的最優(yōu)工藝方案為:A2B1C3D1。為此,在相同條件下,對A2B2C3D1和A2B1C3D1分別進行3次重復性驗證實驗,實驗結(jié)果表明,羅勒精油的平均出油率分別為0.3698%和0.3758%,由此可得微波輔助蒸餾法提取羅勒精油最優(yōu)工藝組合A2B1C3D1,即浸泡時間6 h,料液比1∶16,微波功率567 W,微波時間120 s。在此提取條件下,羅勒精油得率達到最大值。

表4 不同濃度羅勒精油的抑菌活性Table 4 The antimicrobial activity of essential oil

注:“-”表示無抑菌作用。

表5 羅勒精油對細菌的最低抑菌濃度(MIC)Table 5 The minimum inhibitory concentration(MIC)of essential oil

注:+表示有抑菌作用,有抑菌圈;-表示無抑菌作用,表6同。

表2 正交實驗及結(jié)果分析表Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment

注:K1,K2,K3分別是同一水平羅勒精油得率平均值,R極差為同一水平因素的最小值與最大值之間的差。

2.3 正交實驗方差分析

由表3可見,以精油得率為考察指標,經(jīng)方差分析可得,FA、FB、FC、FD均小于F0.05=4.460,說明浸泡時間、料液比、微波功率和微波時間對精油得率的影響不顯著,其中綜合評價極差大小結(jié)果顯示影響羅勒精油得率的因素順序為C>D>B>A,即微波功率>微波時間>料液比>浸泡時間。

表3 正交實驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal array design

2.4 羅勒精油抑菌實驗結(jié)果

2.4.1 羅勒精油對3種不同細菌的抑菌活性測定結(jié)果 不同濃度的羅勒精油對3種細菌均出現(xiàn)了大小不等的抑菌圈。由表4可知,對于大腸桿菌,羅勒精油濃度為1000 μg/mL時為高敏,精油濃度為500～62.5 μg/mL時為中敏,精油濃度為31.25 μg/mL為低敏;對于金黃色葡萄球菌,精油濃度為1000～250 μg/mL時為中敏,精油濃度為125 μg/mL為低敏;對于枯草芽孢桿菌,精油濃度為1000 μg/mL時為高敏,精油濃度為500～250 μg/mL時為中敏,濃度為125～62.5 μg/mL時為低敏。測定結(jié)果表明,羅勒精油對大腸桿菌的抑菌效果最好,其次是枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌。

2.4.2 最低抑菌濃度的測定(MIC) 由表5可知,羅勒精油對金黃色葡萄球菌,枯草芽孢桿菌和大腸桿菌都有一定的抑菌作用,最低抑菌濃度分別為125,62.5,31.25 μg/mL。

2.4.3 最低殺菌濃度的測定(MBC) 表6列出了三種供試菌在不同精油濃度下生長狀況和MBC值。從表6中可以看出,羅勒精油對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌都表現(xiàn)出一定的殺菌能力,尤其對大腸桿菌表現(xiàn)出了強烈的殺菌能力,MBC值為31.25 μg/mL。

表6 羅勒精油對細菌的最低殺菌濃度(MBC)Table 6 The minimum bactericidal concentration(MBC)of essential oil

3 結(jié)論

本實驗采用微波輔助水蒸氣蒸餾法提取羅勒精油,通過單因素實驗及正交實驗的驗證,最終確定了微波輔助水蒸氣蒸餾法提取羅勒精油的最優(yōu)工藝是:浸泡時間6 h,料液比1∶16,微波功率567 W,微波時間120 s,選用干料粗粉碎羅勒,在促溶劑4% NaCl溶液浸泡的條件下,進行重復性實驗并整理計算得出精油平均得率為0.3758%(n=3)。由羅勒精油抑菌活性測定實驗得出,羅勒精油對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌都有一定的抑制作用,抑菌效果從大到小的順序為:大腸桿菌(E.coli)>枯草芽孢桿菌(B.subtilis)>金黃色葡萄球菌(S.auTeus),不同濃度的羅勒精油對三種細菌的抑制作用不同,并與濃度成正比。該抑菌實驗結(jié)果與丁華等對羅勒精油抑菌實驗的結(jié)果相同,羅勒精油對大腸桿菌與金黃色葡萄球菌均具有強效抑菌作用[22]。陸占國等在對黑龍江培育的白花羅勒花精油抑菌活性的研究上也得到了類似的結(jié)論,羅勒花精油抑制細菌的生長活性大小順序為:大腸桿菌>白色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌[24]。近年來,精油的抗菌性被很多學者所研究,越來越得到人們的重視與關(guān)注,在云南羅勒作為少數(shù)民族不可缺少的調(diào)味品,是傣味中的重要食材,具有獨特的發(fā)展前景。

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Microwave-assisted extraction and antibacterial effect of essential oil fromOcimumbasilicumLinn

AI Wei,LIU Jing-lun,LI Xiao-jiao

(Resources and Environmental Sciences,Baoshan University,Baoshan 678000,China)

In this study,microwave-assisted extraction was applied to extract the essential oil fromOcimumbasilicumLinn with petroleum ether. By using orthogonal methodology,the effects of concentration of NaCl,soaking time,solid-liquid ratio,microwave power and extraction time were investigated. It was found that when soaking time was 6 h,solid-liquid ratio was 1∶16,microwave power was 567 W and microwave time was 120 s,the optimal oil yield was 0.3758%(n=3). Then,essential oil’s antibacterial effect was determined by using paper discassay and fold dilution plate method. The results indicated that the minimum inhibitory concentration(MIC)forEscherichiacoli,BacillussubtilisandStaphylococcusaureuswere 31.25,62.5,125 μg/mL,respectively,and the minimum bactericidal concentration(MBC)for these were 31.25,125,500 μg/mL,respectively. The antibacterial order was:Escherichiacoli>Bacillussubtilis>Staphylococcusaureus. The research provides the theoretical basis for development and comprehensive utilization ofOcimumbasilicumLinn.

OcimumbasilicumLinn;essential oil;microwave-assisted extraction;antibacterial effect

2016-08-26

艾薇(1979-)，女，碩士，副教授，從事食品科學的研究及教學工作，E-mail:fwaiwei@aliyun.com。

保山學院食品科學重點學科建設項目；云南省教育廳科學研究基金資助性項目(2016ZZX221)。

TS201.2

B

1002-0306(2017)07-0240-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.039