張康逸,宋范范,高玲玲,何夢影

(河南省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心,河南鄭州 450002)

離子液體提取醫(yī)藥級磷脂酰膽堿的研究

張康逸,宋范范*,高玲玲,何夢影

(河南省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心,河南鄭州 450002)

以大豆粉末磷脂為原料,采用混合溶劑萃取技術,研究了醫(yī)藥級磷脂酰膽堿的制備方法。首先通過單因素實驗考察了混合溶劑1-乙基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([Emim]PF6)-甲醇的溶劑比、料液比、萃取溫度、萃取時間等因素對提取效果的影響,并在此基礎上進行優(yōu)化。響應面結(jié)果表明:萃取時間60.12 min,[Emim]PF6-甲醇混合溶劑比2.95∶1(v/v),料液比1∶7.50(g/mL),萃取溫度30.53 ℃,磷脂酰膽堿的純度為87.65%,提取率為70.76%。再將磷脂酰膽堿經(jīng)過氧化鋁色譜柱純化,最終產(chǎn)品的純度可達98.85%。

大豆粉末磷脂,磷脂酰膽堿,離子液體

磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)的應用范圍非常廣泛,被應用于食品、醫(yī)藥[1-2]、保健[3-4]、化妝品、飼料等領域。能夠抑制乙醇引起的肝纖維化和肝硬化,有效防止肝臟病變[5-7],能使血漿中膽固醇水平有效降低,預防心血管疾病[8],提高大腦活性[9],增強記憶力[10-11]。高純度的PC是醫(yī)藥工業(yè)中優(yōu)質(zhì)乳化劑和制備脂質(zhì)體的關鍵基礎原料,近幾年來國內(nèi)外對醫(yī)藥級PC的市場需求也逐漸增多。

國內(nèi)關于醫(yī)藥級PC的制備研究較少,醫(yī)藥級PC的生產(chǎn)標準仍未出臺,但在進口藥品注冊標準中明確規(guī)定了PC的限度為72%～85%。盡管國內(nèi)有少數(shù)企業(yè)和研究機構在醫(yī)藥級PC制備方面進行了研究和開發(fā),但其質(zhì)量一直不合格,故我國的醫(yī)藥級PC仍然需要進口。目前,PC的提純方法主要包括溶劑萃取法[12-13],低溫冷凍法[14-15],超臨界CO2萃取法[16-17],柱層析法[18-19]以及高效液相色譜法[20]等。溶劑萃取法操作工藝簡便,但可能會涉及到毒性溶劑及環(huán)境問題。然而,單純一種溶劑在萃取過程中往往會存在局限性,復配的混合溶劑會呈現(xiàn)單一溶劑所不能呈現(xiàn)的優(yōu)點,代玲莉[21]研究了單一溶劑和混合溶劑對PC的提取率和選擇性的影響,結(jié)果表明,混合溶劑的綜合性能大大優(yōu)于單一溶劑。低溫冷凍法利用溶解度的差異對原料進行萃取后再進行冷凍純化,雖然步驟比較簡化,但產(chǎn)品的純度和回收率不高。超臨界萃取法也存在純度低、收率低及設備投資大的問題,柱層析法和高效液相色譜法制備的產(chǎn)品雖然純度相對較高,但溶劑的損耗過大,且存在環(huán)境污染的潛在問題。

目前溶劑法制備PC多采用乙醇多次萃取法,但是乙醇對PC的選擇性不好,在溶解PC的同時也會溶解其他一些磷脂成分。Tremblay等人[22]研究發(fā)現(xiàn)在低濃度下乙腈對PC具有非常高的選擇性。離子液體作為新型溶劑,與傳統(tǒng)溶劑相比具有選擇性高、溶解能力強、結(jié)構可設計、無毒等多種優(yōu)點[23],已被用于很多萃取工藝和催化反應中[24-25]。本研究采用離子液體(1-乙基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽,簡稱[Emim]PF6)和甲醇的混合溶劑為萃取劑,考察了[Emim]PF6-甲醇溶劑比、料液比、萃取溫度、萃取時間等因素對提取效果的影響,并結(jié)合響應面實驗設計軟件對萃取條件進行優(yōu)化,以期為PC的純化工藝提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆粉末磷脂(純度≥96%,PC30%、磷脂酰乙醇胺25%、磷脂酰肌醇25%、溶血磷脂酰乙醇胺0.5%) 河南新百維食品科技有限公司;甲醇(分析純)、乙醇(分析純) 煙臺雙雙化工有限公司;1-乙基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽(分析純) 上海成捷化學有限公司;正己烷(分析純) 煙臺雙雙化工有限公司;甲醇(色譜純) 美國honeywell公司;Al2O3(100～200目) 上海五四化學試劑有限公司;PC(99%)標準品 Sigma公司(St. Louis,MO,USA)。

1260 型高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司;202-00A臺式電熱恒溫干燥箱 中國天津泰斯特儀器有限公司;JW-1042低速離心機 安徽嘉文儀器裝備有限公司;FD-100S真空冷凍干燥機 北京惠誠佳儀科技有限公司;層析柱(Φ15 mm×50 cm) 鄭州興華玻璃儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱型號:Agilent ZORBAX RX-SIL(4.6×250 mm,5 μm);柱溫:35 ℃;流速:1.0 mL/min;流動相:A:甲醇,B:甲醇∶水(8∶1,V/V);進樣量5 μL。流動相:溶劑A(甲醇∶水=8∶1,V/V),溶劑B(甲醇),流速1.0 mL/min;洗脫梯度:0～10.0 min,60%～40% A;10.0～20.0 min,40% A;20.0～20.1 min,40%～60% A;20.1～25 min,60% A[26]。

1.2.2 PC標準曲線的繪制 將PC標準品配成1、1.5、2、2.5、3、3.5 mg/mL不同濃度標準溶液,用HPLC-ELSD測定峰面積,以峰面積對濃度做標準曲線。得出回歸方程,由回歸方程計算出PC純度為:Y(%)=C×V×D×100/M。

式中,Y為純度,%;C為待測溶液中PC的濃度,mg/mL;V為待測溶液的體積,mL;D為稀釋倍數(shù);M為樣品質(zhì)量,g。

1.2.3 PC提取方法 取5.0 g粉末磷脂置于圓底燒瓶中,加入25 mL混合溶劑,連接冷凝管后置于恒溫加熱磁力攪拌器下攪拌,萃取溫度為30 ℃,提取時間60 min,反應結(jié)束后,收集萃取液。向萃取液中加入定量的正己烷進行反萃取,離子液體相處理后可循環(huán)利用,通過旋蒸回收溶劑,即得到產(chǎn)物,溶解定容后進行HPLC-ELSD分析,計算PC的提取率。

1.2.4 單因素實驗 以大豆粉末磷脂為原料,[Emim]PF6-甲醇混合溶劑為萃取劑。在[Emim]PF6-甲醇混合溶劑比3∶1(V/V),料液比1∶7.5(g/mL),溫度30 ℃,提取時間60 min的條件下進行萃取,離心,將上清液旋蒸濃縮。分別考察[Emim]PF6-甲醇混合溶劑比1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1及8∶1(V/V),料液比1∶5、1∶7.5、1∶10、1∶12.5、1∶15(g/mL),溫度20、25、30、35、40 ℃,時間10、30、60、110、240 min對分離效果的影響,每組實驗重復3次。

1.2.5 響應面實驗 采用Design Expert 8.0.6軟件進行響應面設計,根據(jù)Box-Behnken的中心組合設計原理,以溶劑比、料液比及溫度3個因素為自變量,以PC純度為考察指標來進行響應面優(yōu)化。溶劑比、料液比及溫度3個自變量分別以A、B、C表示,以PC純度Y作為考察指標,因素及水平見表1。

表1 響應面實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experimental

1.2.6 層析柱的制備 將活化過的氧化鋁加入無水乙醇制成漿狀,裝柱,洗滌,平衡。

1.2.7 水分測定方法 采用GB 5009.3-2010;過氧化值測定方法采用GB/T 5538-2005。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

響應面實驗結(jié)果利用Design Expert 8.0.6軟件進行分析,建立回歸方程并作等高線和3D曲面圖,對因素間的交互作用進行分析和評價,得到最佳工藝組合。其他實驗結(jié)果用Microsoft Excel進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PC標準曲線的制作

由1.2.2的方法制得的標準曲線方程為Y=12.2819X-5.7906(R2=0.9926),二者呈良好的線性關系(見圖1)。

圖1 PC標準曲線Fig.1 The standard curve of PC

2.2 PC提取條件的初步選擇

2.2.1 溶劑比對PC提取效果的影響 由圖2看出,[Emim]PF6-甲醇溶劑比對PC純度的影響比較大,隨著溶劑比的增大,即[Emim]PF6體積分數(shù)的增加,PC的純度逐漸增大,在溶劑比4∶1時純度達到最大,繼續(xù)增大溶劑比PC純度開始下降。由于[Emim]PF6對磷脂中PC的選擇性較高,故隨著[Emim]PF6體積分數(shù)的增加,PC的純度隨之增大,當[Emim]PF6體積分數(shù)達到一定程度后,會溶解磷脂中的磷脂酰乙醇胺等其他組分,故純度逐漸下降。在幾種溶劑比下,提取率基本維持在67%～72%左右。故選擇4∶1為最佳[Emim]PF6-甲醇溶劑比。

圖2 溶劑比對純度和提取率的影響Fig.2 The influence of solvent ratio on the purity and extracting yield of PC

2.2.2 料液比對PC提取效果的影響 由圖3可知,料液比為1∶7.5(g/mL)時的PC純度達到最大,隨著料液比的繼續(xù)增加,PC純度逐漸下降,這是因為過多的溶劑會促使粉末磷脂中磷脂酰肌醇和磷脂酰乙醇胺溶解,即會使整個溶劑體系對PC的選擇性降低,導致溶劑體系中PC的含量相對下降,故純度降低。但過量的溶劑會造成資源的浪費,并增加溶劑回收過程中的工作量。因此,在本實驗條件下,選擇1∶7.5(g/mL)為最佳料液比。

2.2.3 溫度對PC提取效果的影響 由圖4可知,隨著溫度的升高,PC的純度呈先上升后下降的趨勢,當溫度為30 ℃時,PC的提純效果達到最好,為85.71%。這是因為溫度的適當升高,有助于增加溶質(zhì)分子的熱運動,增大分子的動能,提高分子的傳質(zhì)速率,增加溶質(zhì)在溶劑中的溶解能力,提高溶解度;但是PC在溶劑中的溶解是一個放熱的過程,當溫度上升幅度較大時,PC溶解放熱成為影響其溶解的主要因素,溶解程度隨溫度升高而減小,故當溫度高于30 ℃時PC純度逐漸下降。提取率一般會隨著溫度升高而增加,因為溫度升高后分子擴散作用加劇,從而使磷脂能過多溶解在溶劑中,繼續(xù)升高溫度會導致料液間出現(xiàn)汽化層,阻礙分子的擴散[27]。此外,由于[Emim]PF6的黏度較大,甲醇的存在會適當降低體系的黏度,利于傳質(zhì),溫度升高后甲醇揮發(fā),體系粘度增大,分子擴散能力變差,不利于萃取的進行。由于在30 ℃和35 ℃時提取率差別不大,故本實驗選擇30 ℃為最佳提取溫度。

圖4 溫度對純度和提取率的影響Fig.4 The influence of temperature on the purity and extracting yield of PC

2.2.4 時間對PC提取效果的影響 溶質(zhì)在溶劑中充分溶解需要一定的時間,但是隨著溶質(zhì)的溶解,溶劑中溶質(zhì)的濃度逐漸增大,溶質(zhì)分子的傳質(zhì)推動力減小,不利于溶質(zhì)的溶解。由圖5可以看出,提取時間為60 min時PC純度達到最高,隨后純度開始下降。這是因為隨著時間的延長,溶劑揮發(fā)嚴重,導致體系黏度增加,不利于PC的溶解,且長時間的萃取會促使部分PC氧化[28-29]。隨著提取時間的延長,提取率呈逐漸下降的趨勢,這主要是由于溶劑揮發(fā)后磷脂在溶劑體系中的溶解程度相對下降。因此,綜合純度和提取率來看,PC的最佳提取時間選擇60 min。

圖5 時間對純度和提取率的影響Fig.5 The influence of time on the purity and extracting yield of PC

2.3 響應面設計及結(jié)果分析

2.3.1 響應面設計及結(jié)果 由于在單因素實驗過程中發(fā)現(xiàn)各因素水平的變化對提取率的影響并不明顯,故響應面實驗中只選取PC的純度為考察指標。由單因素實驗結(jié)果可知,時間在60～120 min內(nèi)PC的純度變化不太明顯,故響應面實驗以溶劑比、料液比及溫度3個因素為自變量來進行設計優(yōu)化,實驗設計及結(jié)果見表2。

表2 實驗設計及結(jié)果Table 2 Experimental design and results

2.3.2 數(shù)學模擬及方差分析 對表2中響應面實驗結(jié)果的相關數(shù)據(jù)進行方差分析和多元回歸擬合分析,方差分析及回歸系數(shù)的顯著性分析采用F檢驗,p-value(Prob>F)判定某模擬項為顯著項,方差分析結(jié)果見表3,PC純度對自變量A、B、C的二次多項回歸方程式為:

表3 二次模型ANOVA分析表Table 3 ANOVA for quadratic model

Y(%)=83.44+21.11A-2.88B+1.80C-0.96AB+0.31AC+2.72BC-20.37A2-6.79B2-8.67C2

由表3可知,回歸模型的顯著性水平p<0.0001,說明此模型極顯著,失擬項p=0.1220>0.05,影響不顯著,回歸方程R2=0.9968,表明該模型擬合效果好,可以用該回歸方程對實驗結(jié)果進行分析,并能夠?qū)υ撦腿》ㄖ苽銹C的實際情況進行預測。檢驗結(jié)果表明,溶劑比、料液比、溫度的一次項和二次項為顯著項,料液比和溫度的交互項顯著,3個因素對PC純度影響大小的順序為:溶劑比>料液比>溫度。

各個因素之間的交互作用響應面圖如圖6所示,溶劑比對PC的影響極其顯著,料液比和溫度的交互影響顯著,表現(xiàn)為曲線比較陡峭。溶劑比與溫度、溶劑比與料液比的交互影響不顯著,表現(xiàn)為曲線比較平滑。由圖6a可以看出,在溶劑比為3∶1～5∶1和料液比1∶6～1∶8時,PC的純度較高,當料液比一定時,隨著溶劑比的增加,PC的純度出現(xiàn)逐漸增高的趨勢,當溶劑比一定時,PC的純度隨料液比的變化趨勢不明顯,證明溶劑比對PC純度的影響較大。由圖6b可以看出,當溶劑比一定時,溫度的變化對PC純度的影響并不明顯,溶劑比對PC純度的影響要大于溫度對PC純度的影響。由圖6c可以看出,當溫度一定時,隨著料液比的增加,PC純度出現(xiàn)先增加后減小的趨勢,當料液比一定時,隨著溫度的增加,PC純度同樣出現(xiàn)先增加后減小的趨勢,這是因為適宜的溫度可以減小體系的黏度,利于PC的萃取,溫度過高時,甲醇會有一定程度的揮發(fā),料液比的增加雖會在一定程度對體系進行稀釋,但PC的相對濃度會下降,而其他組分會一定程度的溶解進溶劑體系中,這一點在液相色譜圖檢測結(jié)果中得到證實。

圖6 各因素交互作用的響應面圖Fig.6 Effect of the interaction between different factors注:a溶劑比和料液比的交互作用,b溶劑比與溫度的交互作用,c料液比和溫度的交互作用。

2.3.3 模型的驗證 根據(jù)響應面優(yōu)化的解決方案中選取的最優(yōu)反應條件為:萃取時間60.12 min,[Emim]PF6-甲醇混合溶劑比2.95∶1(V/V),料液比1∶7.50(g/mL),萃取溫度30.53 ℃。在此最佳反應條件下,經(jīng)過三次重復驗證實驗得到PC的純度為87.65%±2.1%(預測值為89.56%),提取率為70.76%±1.7%。這說明實驗結(jié)果與模型預測結(jié)果具有良好的相關性,因此,該模型可以較成功地預測PC的制備過程。

2.4 PC的柱色譜純化

將最優(yōu)方案萃取后的PC用無水乙醇溶解后上氧化鋁層析柱,采用無水乙醇做洗脫劑,收集洗脫液并將其真空濃縮、冷凍干燥得到醫(yī)藥級PC產(chǎn)品,最終產(chǎn)品的純度可達98.85%,回收率為85.23%,水含量為1.91%,過氧化值2.37 mmol/kg,產(chǎn)品的液相色譜圖見圖7。

圖7 PC純化后的液相色譜圖Fig.7 Chromatograms of purified PC

3 結(jié)論

本實驗采用[Emim]PF6-甲醇混合溶劑作為萃取劑分離純化PC,該方法制備的PC純度比文獻中同樣采用乙腈-甲醇體系作為萃取劑所得的PC純度(72.8%)[21],高出約15%,明顯優(yōu)于傳統(tǒng)有機溶劑萃取法。經(jīng)過氧化鋁色譜柱純化后,最終產(chǎn)品的純度可達98.85%。

此外,本研究引入了新型溶劑離子液體[Emim]PF6代替了有機溶劑,降低了體系的毒性,[Emim]PF6-甲醇體系的分離也更為簡單,通過控制溫度就可實現(xiàn)甲醇的回收,離子液體經(jīng)過簡單處理后就可以循環(huán)使用。根據(jù)離子液體可設計的特點,后期將尋找合適的離子液體替代體系中的有機溶劑。

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Study on extraction of pharmaceutical grade phosphatidylcholine by ionic liquid

ZHANG Kang-yi,SONG Fan-fan*,GAO Ling-ling,HE Meng-ying

(Institute of Agricultural Products Processing,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002,China)

The phosphatidylcholine was purified from soybean lecithin powder by mixed solvent. The influence factors(mixing solvent ratio of 1-ethyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate([Emim]PF6)and methanol,solid-liquid ratio,extracting temperature and extracting time)of separation were investigated by single factor experiment. The purified phosphatidylcholine products(with purity 87.65% and extracting yield 70.76%)were obtained based on response surface experiment at the conditions as follows:extracting time 60.12 min,mixing solvent ratio of[Emim]PF6and methanol 2.95∶1(v/v),solid-liquid ratio 1∶7.50(g/mL),and extracting temperature 30.53 ℃. The phosphatidylcholine was purified by aluminum column chromatography and the purity of final product was 98.85%.

soybean lecithin powder;phosphatidylcholine;ionic liquid

2016-04-08

張康逸(1981-)，男，博士，副研究員，研究方向：脂質(zhì)化學，E-mail：kangyiz@163.com。

*通訊作者:宋范范(1988-)，女，碩士，研究方向：脂質(zhì)化學，E-mail：495536703@qq.com。

河南省農(nóng)業(yè)科學院科研發(fā)展專項資金項目(YCY20167822)；河南省農(nóng)業(yè)科學院自主創(chuàng)新基金項目(豫財科【2015】183號)。

TS229

B

1002-0306(2017)07-0235-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.038