徐建平,蔡錦源,李林軒,王萌璇,張彩云,梁豪榮,韋坤華，*,李旻輝,,*

(1.包頭醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古包頭 0140403;2.廣西藥用植物園廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530023;3.廣西科技大學(xué)鹿山學(xué)院,廣西柳州 545616)

徐建平1,蔡錦源2,3,李林軒2,王萌璇3,張彩云3,梁豪榮3,韋坤華2，*,李旻輝1,2,*

(1.包頭醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古包頭 0140403;2.廣西藥用植物園廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西南寧 530023;3.廣西科技大學(xué)鹿山學(xué)院,廣西柳州 545616)

總評歸一值,山豆根莖多糖,微波預(yù)處理-超聲波提取,抗氧化活性,清除亞硝酸鹽活性,穩(wěn)定性

微波預(yù)處理-超聲波提取法[1]可較好地結(jié)合微波內(nèi)加熱破壁破膜和超聲波空化、機(jī)械攪拌等優(yōu)點(diǎn),可快速高效地從植物中提取有效成分,已應(yīng)用于香菇多糖[1]和山茱萸多糖[2]的提取?？傇u歸一值(Overall desirability,簡稱OD)法[3]可較全面地將多個(gè)指標(biāo)綜合為一個(gè)指標(biāo),再結(jié)合正交設(shè)計(jì)或響應(yīng)面法進(jìn)行工藝優(yōu)化,為多指標(biāo)的藥用植物有效成分提取工藝優(yōu)化提供了新的研究思路。

山豆根(SophoratonkinensisGapnep.),又名廣豆根[4-5],植物多糖含量約占干藥材重量的3%～8%。近年來,山豆根多糖因其具有調(diào)節(jié)免疫、清除肝炎病毒和抗腫瘤等生物活性[6-8],備受廣大學(xué)者關(guān)注。但目前對山豆根多糖的研究主要集中在根部[9],山豆根莖枝的產(chǎn)量遠(yuǎn)大于根部,如能對其進(jìn)行有效的綜合開發(fā)利用,將有助于推動(dòng)山豆根藥材的綜合開發(fā)利用。前期實(shí)驗(yàn)研究表明山豆根莖部也富含多糖類成分,但目前尚未有關(guān)山豆根莖部多糖的提取和生物活性等方面研究的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究旨在以多糖得率和多糖純度的總評歸一值為指標(biāo),優(yōu)選山豆根莖多糖的微波預(yù)處理-超聲波提取工藝,并對粗多糖進(jìn)行抗氧化活性、清除亞硝酸鹽活性和穩(wěn)定性三種生物活性進(jìn)行研究,為篩選山豆根莖多糖的提取方法以及綜合開發(fā)利用山豆根莖多糖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山豆根莖枝 采自廣西藥用植物園實(shí)驗(yàn)田；葡萄糖、濃硫酸、苯酚、乙醇、石油醚、鄰苯三酚、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、亞硫酸鈉、抗壞血酸、檸檬酸、氯化鋁、氯化鈉、氯化銅、氯化鐵、氯化鈣、VC、亞硝酸鈉、對氨基苯磺酸和鹽酸萘乙二胺等 均為分析純。

KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司;G70F20CN3L-C2(B0)格蘭仕Galanz微波爐 廣東格蘭仕微波電器制造有限公司;UV-5100紫外可見分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司;TDL-80-2B低速離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;CP225D型精密電子天平(1/10萬) 德國LaiLa。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 提取工藝線路 山豆根莖→切碎→恒溫烘干(60 ℃)→粉碎過篩(60目)→石油醚回流脫脂→恒溫烘干(60 ℃)→稱量并按比例加入解吸劑(超純水)→微波預(yù)處理→按比例加入提取溶劑(超純水)并進(jìn)行超聲波提取→抽濾→旋蒸濃縮→醇沉(75%乙醇)→離心→固液分離→干燥至恒重(60 ℃)→即得山豆根莖粗多糖。

1.2.2 山豆根莖多糖含量測定、得率和純度計(jì)算 采用苯酚-硫酸法[10]測定多糖含量,以吸光度為縱坐標(biāo),總糖濃度為橫坐標(biāo),回歸方程為:A=0.0531X+0.0083,r=0.9999,多糖濃度在2.5～17.5 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。按方法“1.2.1”制備粗多糖,稱重后用蒸餾水復(fù)溶并定容,采用苯酚-硫酸法測定吸光度,根據(jù)回歸方程計(jì)算總糖濃度,多糖質(zhì)量按式(1)計(jì)算,多糖得率按式(2)計(jì)算,多糖純度按式(3)計(jì)算:

W總糖=N×X/(1000M)

式(1)

y(%)=W總糖/M×100

式(2)

Y(%)=W總糖/m×100

式(3)

注:W總糖為多糖質(zhì)量,g;X為總糖濃度,mg/mL;y為多糖得率,%;M為投料質(zhì)量,g;m為粗多糖質(zhì)量,g;Y為多糖純度,%。

1.2.3 總評歸一值計(jì)算 以多糖得率和多糖純度為指標(biāo),采用Hassan法進(jìn)行歸一化處理,多糖得率和多糖純度取值越大越好,單指標(biāo)評價(jià)值(d)按式(4)進(jìn)行計(jì)算,總評歸一值[2]按式(5)進(jìn)行換算。

d=(Yi-Ymin)/(Ymax-Ymin)

式(4)

OD=(d1+d2)/2

式(5)

其中：d為單指標(biāo)評價(jià)值,d1為多糖得率指標(biāo)評價(jià)值,d2為多糖純度指標(biāo)評價(jià)值,Yi為指標(biāo)中第i個(gè)值,Ymin為指標(biāo)中最小值,Ymax為指標(biāo)中最大值。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,固定微波功率700 W和提取溫度60 ℃的條件下,采用正交表L16(45)對解吸劑比、微波時(shí)間、料液比、超聲功率和提取時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),因素與水平見表1。

表2 對比實(shí)驗(yàn)Table 2 Contrast experiment

表1 正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素與水平表Table 1 Factors and levels for orthogonal experiment

1.2.5 對比實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在正交設(shè)計(jì)優(yōu)選的最優(yōu)工藝條件的基礎(chǔ)上,將熱水浸提法(a)、超聲波提取法(b)與微波預(yù)處理-超聲波提取法(c)進(jìn)行比較,對比實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。

1.2.6 粗多糖的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 按表2的b法和c法分別提取山豆根莖粗多糖,從溫度、金屬離子、食品添加劑和氧化還原劑四方面考察粗多糖的穩(wěn)定性,實(shí)驗(yàn)方案參考史娟[2]和許小向等[11]的方法并略做修改,具體如下:

光照對粗多糖的影響：取4 mL粗多糖溶液2組,每組各6份,1組在0、2、4、6、8、10 h下見光常溫保存,另一組則避光常溫保存,按方法“1.2.2”測定吸光度。

溫度對粗多糖的影響：取4 mL粗多糖溶液7份,分別在40、50、60、70、80、90、100 ℃下避光保溫1 h,按方法“1.2.2”測定吸光度。

金屬離子對粗多糖的影響：取4 mL粗多糖溶液6份,分別加入2.0 mL超純水和濃度為0.05 mol/L的Na+、K+、Ga2+、Cu2+和Fe3+,搖勻后避光密封保存3 h,按方法“1.2.2”測定吸光度。

食品添加劑對粗多糖的影響：取4 mL粗多糖溶液3份,分別加入2.0 mL超純水、0.05 mol/L的檸檬酸和0.05 mol/L抗壞血酸,搖勻后避光密封保存3 h,按方法“1.2.2”測定吸光度。

氧化還原劑對粗多糖的影響：取4 mL粗多糖溶液14份,分別加入2.0 mL濃度為0.00、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mol/L的雙氧水和亞硫酸鈉,搖勻后避光密封保存3 h,按方法“1.2.2”測定吸光度。

1.2.8 粗多糖清除亞硝酸鹽活性 參考郭小鵬等[14]和李佩艷等[15]的方法并做修改,先配制成濃度為5 μg/mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液,在錐形瓶中加入2 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液和一定體積的粗多糖(或VC溶液),于超聲清洗儀中40 ℃放置10 min,加入2 mL 0.4%對氨基苯磺酸溶液混勻,靜置5 min,加入1 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺,混勻后靜置15 min,最后加蒸餾水定容至50 mL,在538 nm波長處測定吸光度值(A1),以蒸餾水代替標(biāo)準(zhǔn)溶液測定樣品空白對照的吸光度值(A2),以蒸餾水代替粗多糖(或VC溶液)測定標(biāo)準(zhǔn)液空白對照的吸光度值(A0)。亞硝酸鹽清除率按式(6)計(jì)算。按優(yōu)選的最優(yōu)工藝提取粗多糖,并稀釋成濃度為0.98 mg/mL,另精密稱取0.0040 g VC,溶解并定容為100 mL,分別取1、2、4、8、12、16、20 mL按上述方法進(jìn)行測定。

清除率(%)=[A0-(A1-A2)]×100/A0

式(6)

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel和Origin7.5等數(shù)據(jù)處理軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按表1進(jìn)行正交設(shè)計(jì),結(jié)果見表3。由表3直觀分析可知影響山豆根莖多糖的微波預(yù)處理-超聲波提取工藝的順序大小為:提取時(shí)間(E)>微波時(shí)間(B)>超聲功率(D)>解析劑比(A)>料液比(C),最優(yōu)工藝組合為A2B1C3D2E2,即為解析劑比1∶5 (g/mL)、微波時(shí)間30 s、料液比1∶25 (g/mL)、超聲功率140 W和提取時(shí)間20 min。由表4可知,提取時(shí)間、微波時(shí)間和超聲功率對OD值有顯著影響,而解析劑比和料液比對OD值影響不顯著。按最優(yōu)工藝組合進(jìn)行3次平行提取實(shí)驗(yàn),此時(shí)山豆根莖多糖平均得率為3.27%,平均純度為29.49%,總評OD值為1.04,優(yōu)于正交實(shí)驗(yàn)表中的16個(gè)實(shí)驗(yàn)組合,表明實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)穩(wěn)定、可行。

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiments results

注:*表述影響顯著。

表5 對比實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of contrast experiment

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal experiment results

按方法1.2.5的表2進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),結(jié)果見表5。三種方法中,微波預(yù)處理-超聲波提取法所提取的山豆根莖多糖得率和純度均為最高,超聲波提取法次之,熱水浸提法最低;b法與a法比較發(fā)現(xiàn),采用超聲波提取比熱水浸提法的多糖得率提高了17.30%,而純度也提高了31.04%;c法與b法對比發(fā)現(xiàn),在超聲波提取之前增加微波預(yù)處理,山豆根莖多糖得率可提高17.63%,多糖純度也提高了11.24%。綜上所述,表明采用微波預(yù)處理-超聲波提取法可大大提高山豆根莖多糖的提取效率。

2.2 山豆根莖粗多糖的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 光照對粗多糖的影響 光照對粗多糖穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。由圖1可知,不論b法還是c法,所提取的粗多糖,與避光相比,光照對粗多糖的穩(wěn)定性有一定的影響,且放置2 h后,吸光度隨著光照時(shí)間的延長而逐漸下降,原因可能是粗多糖可能在光照條件下發(fā)生部分分解[2],故建議避光保存。

圖1 光照對多糖穩(wěn)定性的影響Fig.1 Effect of light on the stability of polysaccharose

2.2.2 溫度對粗多糖的影響 溫度對粗多糖穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。由圖2可知,b法和c法提取的粗多糖隨溫度變化,具有相同的變化趨勢;在40～70 ℃時(shí)吸光度無明顯變化,表明穩(wěn)定性較好,但當(dāng)溫度超過70 ℃以后,吸光度明顯增大,原因可能是過高的溫度導(dǎo)致粗多糖水解,增大了溶液顯色效果[11],故建議采用低于70 ℃的溫度進(jìn)行粗多糖的提取或存放。

圖2 溫度對多糖穩(wěn)定性的影響Fig.2 Effect of temperature on the stability of polysaccharose

2.2.3 金屬離子對粗多糖的影響 金屬離子對粗多糖的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示,由圖3可知,兩種方法所提取的粗多糖受金屬離子的影響趨勢相同;在含Ca2+的溶液中吸光度未發(fā)生明顯變化,即比較穩(wěn)定;在含F(xiàn)e3+和Cu2+的溶液中吸光度升高較明顯,在含Al3+和Na+溶液中的吸光度下降較多,原因可能是金屬離子本身具有一定的顏色或者與粗多糖發(fā)生了氧化反應(yīng)、絡(luò)合反應(yīng)等[11],導(dǎo)致粗多糖與金屬離子之間結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,從而引起吸光度變化明顯,即對粗多糖的穩(wěn)定性影響較大。

圖3 金屬離子對多糖穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of metal ions on the stability of polysaccharose

2.2.4 食品添加劑對粗多糖的影響 食品添加劑對粗多糖的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示,由圖4可知,與空白對照對比,加入抗壞血酸(VC)后,莖多糖(b)和莖多糖(c)的吸光度均明顯增大,而添加檸檬酸對莖多糖(b)和莖多糖(c)的吸光度變化不明顯,表明檸檬酸對粗多糖的穩(wěn)定性無影響,但VC對粗多糖的穩(wěn)定性影響較大,原因可能是VC抗氧化活性較強(qiáng),易競爭性發(fā)生氧化反應(yīng)生成過氧化氫,過氧化氫易與粗多糖發(fā)生反應(yīng),生成深色產(chǎn)物,從而導(dǎo)致吸光度增大[11]。

圖4 食品添加劑對多糖穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of food additives on the stability of polysaccharose

2.2.5 氧化還原劑對粗多糖的影響 氧化劑和還原劑對粗多糖的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示,由圖5可知,莖多糖(b)和莖多糖(c)受氧化還原劑的影響變化趨勢一致;粗多糖溶液的吸光度隨著雙氧水濃度的增大而增大,原因可能是多糖與氧化劑發(fā)生了反應(yīng),生成深褐色產(chǎn)物[11],導(dǎo)致吸光度增大;山豆根粗莖多糖卻隨著亞硫酸鈉濃度的增大而減小,但下降趨勢不明顯,原因可能是部分多糖被還原劑還原,生成的糖苷數(shù)量減少,故吸光度減小。綜合表明粗多糖易被氧化,也會被還原,即粗多糖在氧化劑和還原劑的條件下不穩(wěn)定。

圖5 氧化還原劑對多糖穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of oxidant and reductant on the stability of polysaccharose

2.3 山豆根莖粗多糖的體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按方法“1.2.7”測定粗多糖對·OH的清除率,結(jié)果如圖6所示。由圖6可知莖多糖(b)和莖多糖(c)均具有一定的抗氧化活性,且清除效果與多糖濃度呈量效關(guān)系,當(dāng)多糖濃度為1.96 mg/mL時(shí),莖多糖(b)和莖多糖(c)對·OH的清除率分別為68.57%和78.14%;相同濃度下,莖多糖(c)對·OH清除率高于莖多糖(b),但兩種方法提取的粗多糖抗氧化效果均不如陽性對照VC。

圖6 多糖對·OH自由基的清除能力Fig.6 ·OH scavenging ability of polysaccharose

圖7 多糖對自由基的清除能力

2.4 山豆根莖粗多糖對亞硝酸鹽的清除效果

按方法“1.2.8”分別測定粗多糖和VC對亞硝酸鹽的清除率,結(jié)果如圖8所示。由圖8可知粗多糖對亞硝酸鹽具有良好的清除作用,隨著提取液添加量的增大,清除作用也逐漸增大,表明粗多糖與亞硝酸鹽清除率存在量效關(guān)系;兩種方法所提取的粗多糖,在相同濃度下,清除亞硝酸鹽能力相當(dāng);在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),粗多糖對亞硝酸鹽的清除作用均低于同添加量的VC;當(dāng)粗多糖(c)溶液添加量為20 mL(多糖重量為19.60 mg)時(shí),亞硝酸鹽清除率達(dá)82.95%,與8 mL VC(0.32 mg)清除率(83.01%)相當(dāng)。

圖8 多糖對亞硝酸鹽的清除作用Fig.8 Scavenging activity on nitrite of polysaccharose

3 結(jié)論

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Optimization of ultrasonic extraction coupled with microwave treatment of polysaccharose fromSophoraTonkinensisGapnep. by overall desirability and its biological activity

XU Jian-ping1,CAI Jin-yuan2,3,LI Lin-xuan2,WANG Meng-xuan3,ZHANG Cai-yun3, LIANG Hao-rong3,WEI Kun-hua2，*,LI Min-hui1,2，*

(1.Baotou Medical College,Baotou,Inner Mongolia 014040,China; 2.Guangxi Key Laboratory of Medicinal Resources Protection and Genetic Improvement, Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plant,Nanning 530023,China; 3.Lushan College of Guangxi University of Science and Technology,Liuzhou 545616,China)

overall desirability;S.tonkinensispolysaccharose;ultrasonic extraction coupled with microwave treatment;antioxidant activity;nitrite scavenging activity;stability

2016-10-24

徐建平 (1992-)，女，碩士，從事中藥資源學(xué)研究， E-mail:xu_jianping1992@163.com。

*通訊作者:韋坤華 (1983-)，女，博士，副研究員，從事藥用植物生物技術(shù)研究，E-mail:divinekh@163.com。 李旻輝 (1978-)，男，博士，教授，從事中藥資源學(xué)研究，E-mail:li_minhui@aliyun.com。

國家中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)(201507002)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81460582, 81473309)；國家科技重大專項(xiàng)(2012ZX09304006)；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2013GXNSFBA019086)；廣西大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201613639005)。

TS201.2

B

1002-0306(2017)07-0187-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.028