李 敏,郭 斌,韓冠英,崔 鏨

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,遼寧錦州 121000;2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,遼寧錦州 121000)

李 敏1,郭 斌2,*,韓冠英2,崔 鏨2

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,遼寧錦州 121000;2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,遼寧錦州 121000)

采用堿提酸沉法對蘿藦果殼蛋白的提取條件進行研究,以蛋白提取率為指標,在單因素實驗的基礎(chǔ)上,進行正交實驗。結(jié)果表明在料液比1∶20 (g/mL)、提取液pH11.5、浸提溫度60 ℃、提取時間1.0 h的條件下,蛋白提取率最高，為89.18%。并對最佳條件下提取的蛋白進行體外抗氧化實驗。結(jié)果顯示,提取蛋白對DPPH·、·OH的清除率分別為79.45%(8 mg/mL)、55.35%(8 mg/mL),且清除DPPH·、·OH的半抑制濃度(IC50)分別為4.19、3.30 mg/mL,并具有還原能力,但弱于VC。

蘿藦果殼,蛋白,正交實驗,抗氧化性能

蘿藦(Metaplexisjaponica)為蘿藦科蘿藦屬植物,多年生草質(zhì)藤本。其全草、塊根、果實皆可藥用[1]。已有對蘿藦全草中糖類、黃酮類化合物、生物堿類化合物等的研究[2-3]。大量文獻表明,植物蛋白具有多重營養(yǎng)功能。在降低膽固醇、抗腫瘤、降血壓和預(yù)防心血管疾病等方面作用顯著[4]。植物蛋白提取方法主要有鹽析法、有機溶劑法、堿提酸沉法等[5]。考慮到鹽析法提取蛋白不充分[6],有機溶劑法易引起蛋白變性失活等特點[7],本實驗采用堿提酸沉法。利用植物蛋白易溶于堿性溶液,且促進結(jié)合物與蛋白分離,從而提高蛋白提取率的特點,對蘿藦果殼蛋白進行提取,并對提取的蛋白進行體外抗氧化活性測定,以期為其藥理活性的研究提供前期幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蘿藦果殼 采自錦州市周邊地區(qū),經(jīng)由錦州市藥品檢驗所瞿鐵紅主任藥師鑒定為蘿藦屬蘿藦果殼;氫氧化鈉(NaOH)、水楊酸、硫酸亞鐵(FeSO4)、雙氧水(H2O2)、鐵氰化鉀、三氯化鐵 天津永晟精細化工有限公司;1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH) 上海源葉生物科技有限公司;三氯乙酸、考馬斯亮藍G250 天津市光復(fù)精細化工研究所;牛血清白蛋白 購自上海藍季科技發(fā)展有限公司;維生素C(VC) 購自國藥集團;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

KDN-08消化爐、KDN-08定氮儀 上海昕瑞儀器儀表有限公司;BP 211D型電子分析天平 德國Sartorius公司;恒溫水浴鍋 上海騰方公司;PHSJ-4A實驗室pH計 上海精密科學(xué)儀器有限公司;LD4-2A(Ⅲ)低速離心機 北京京立離心機有限公司;UV-2550型紫外分光光度計 日本島津;SCIENTZ-10N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘿藦果殼蛋白的提取 將干燥蘿藦果殼粉碎,過40目篩。取蘿藦果殼粉,按比例加入堿性提取液,并在一定溫度下提取。用紗布過濾,在4000 r/min條件下離心20 min。收集上清液,調(diào)節(jié)pH使蛋白沉淀。離心,去除上清液,調(diào)節(jié)pH至中性[8],凍干。既得蛋白粗提物。蘿藦果殼粉中總蛋白含量采用凱氏定氮法測定,總蛋白質(zhì)含量=總氮含量×6.25。經(jīng)測定蘿藦果殼粉中總蛋白含量為6.78%。參考文獻[9]采用考馬斯亮藍法測定蛋白含量,繪制牛血清白蛋白標準曲線為A=0.0308C+0.0158,R2=0.9965,線性范圍在20～100 μg/mL。蛋白提取率(%)=提取的蛋白質(zhì)量/蘿藦果殼粉中總蛋白質(zhì)量×100

1.2.2 蘿藦果殼蛋白等電點測定 取果殼粉10 g,加入200 mL、pH11.0的NaOH溶液,于50 ℃水浴浸提1.0 h。過濾,離心。分別取上清液20 mL,鹽酸調(diào)節(jié)pH,分別為3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4、4.6。4000 r/min離心,20 min。將上清液定容至50 mL,采用考馬斯亮藍法測定各上清液的蛋白濃度。以pH為橫坐標(X),濃度為縱坐標(Y),繪制濃度-pH的關(guān)系圖。

1.2.3 單因素實驗設(shè)計 采用1.2.1中提到的方法,在提取液pH11.0、浸提溫度50 ℃、提取時間1.0 h的條件下,考察料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30,g/mL)對蘿藦果殼蛋白提取率的影響；在料液比為1∶20(g/mL)、浸提溫度50 ℃、提取時間1.0 h的條件下,考察提取液pH(10.0、10.5、11.0、11.5、12.0)對蘿藦果殼蛋白提取率的影響；在料液比為1∶20 (g/mL)、提取液pH11.0、提取時間1.0 h的條件下,考察浸提溫度(30、40、50、60、70 ℃)對蘿藦果殼蛋白提取率的影響；在料液比為1∶20 (g/mL)、浸提溫度50 ℃、提取液pH11.0的條件下,考察提取時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)對蘿藦果殼蛋白提取率的影響。以蘿藦果殼蛋白提取率為指標,進行單因素實驗。分析各因素對蘿藦果殼蛋白提取率的影響。

1.2.4 蘿藦果殼蛋白提取工藝優(yōu)化 在上述單因素實驗的基礎(chǔ)上,選定料液比、提取液pH、浸提溫度和提取時間四個影響因素,每個因素取三個水平作正交實驗,以蘿藦果殼蛋白提取率為衡量實驗結(jié)果的指標,對提取工藝進行優(yōu)化,以期找到更好的提取條件。因素水平表見表1。

表1 正交實驗因素與水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.5 蘿藦果殼蛋白體外抗氧化活性實驗 進行抗氧化活性實驗所用的蛋白均為優(yōu)化工藝條件下提取的蘿藦果殼蛋白,配制濃度分別為0.5、1、2、4、8 mg/mL的樣品溶液。

1.2.5.1 DPPH·清除能力的測定 取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液2 mL于試管中,加入2 mL DPPH·無水乙醇溶液(0.04 mg/mL),暗處充分混合,反應(yīng)30 min,于517 nm處測定其吸光度[10]。以蒸餾水代替樣品溶液,無水乙醇代替DPPH·溶液,作空白實驗調(diào)零用。各組平行測定3次,取平均值。VC為陽性對照,清除率計算如式(1):

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式(1)

式中:A0為空白組,蒸餾水代替樣品溶液的吸光度值;A1為樣品溶液吸光度值;A2為樣品干擾實驗,是無水乙醇代替DPPH·溶液的吸光度值。

1.2.5.2 ·OH清除能力的測定 取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液1 mL于試管中,依次加入FeSO4(6 mmol/mL)和H2O2(0.6 mmol/mL)各1 mL,混合均勻后靜置10 min;再加入1 mL水楊酸醇溶液(6 mmol/mL),混勻靜置30 min,于波長510 nm處測定其吸光度[11],各組平行測定3次,取平均值。VC為陽性對照,清除率計算公式同式(1)。

式中:A0為空白組,蒸餾水代替樣品溶液的吸光度值;A1為樣品溶液吸光度值;A2為蒸餾水代替H2O2的吸光度值。

1.2.5.3 還原能力的測定 取不同質(zhì)量濃度的樣品溶液1 mL于試管中,加入2.5 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L、pH6.6)和2.5 mL的鐵氰化鉀溶液(1%),混勻后于50 ℃水浴中反應(yīng)20 min,快速冷卻,加入2.5 mL三氯乙酸(10%),混勻,4000 r/min離心10 min,取上清液2.5 mL于試管中,加入0.5 mL三氯化鐵溶液(0.1%)、2.5 mL蒸餾水,充分混勻常溫反應(yīng)10 min。于700 nm處測定其吸光值A(chǔ)[12],吸光值越大表示還原能力越強。以蒸餾水為空白,各組平行測定3次,取平均值。VC為陽性對照。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0軟件進行方差分析,Origin8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘿藦果殼蛋白等電點的確定

以pH為橫坐標(X),蘿藦果殼蛋白濃度(mg/mL)為縱坐標(Y),繪制濃度-pH的關(guān)系圖,從圖1可知,pH為4.2時殘留的蛋白濃度最小。說明此時絕大部分蛋白質(zhì)已經(jīng)沉淀。因此,在進行加酸沉淀蛋白時,應(yīng)將離心后所得的堿性蛋白上清液的pH調(diào)到4.2,以使蛋白最大程度沉淀。

圖1 pH對殘留蛋白濃度的影響Fig.1 Effect of pH on residual concentration of protein

2.2 單因素實驗

2.2.1 料液比對蘿藦果殼蛋白提取率的影響 從圖2可知,當(dāng)料液比在1∶10～1∶20 (g/mL)范圍內(nèi)時,蛋白提取率隨著料液比的增加而增加,料液比為1∶20 (g/mL)時,蛋白提取率最大為76.03%。這是因為在一定范圍內(nèi)增加料液比有利于增大浸提物與溶劑的接觸面積,使蛋白充分溶出,從而提高萃取效率。但當(dāng)料液比繼續(xù)增大時,蛋白提取率反而平緩下降。是因為溶劑繼續(xù)增加會使蛋白分子與水分子之間的相互作用力增加[13],而使蛋白分子不易沉淀,導(dǎo)致蛋白殘留在上清液中,造成提取率下降。

圖2 料液比對蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of ratios of water to material on extraction yield of protein

2.2.2 提取液pH對蘿藦果殼蛋白提取率的影響 從圖3可知,在一定范圍內(nèi),隨著pH的升高,蛋白提取率表現(xiàn)出上升趨勢,是因為適當(dāng)?shù)膲A性條件加速蛋白酸式解離反應(yīng),提高了蛋白的溶解量,而且增大了對蛋白次級鍵特別是對氫鍵的破壞,使蛋白質(zhì)增溶作用增加。在pH11.0時,提取率達到76.53%。當(dāng)pH高于11.0時蛋白提取率呈現(xiàn)下降趨勢,可能因為堿性過強引起蛋白質(zhì)變性[14],且部分蛋白質(zhì)會發(fā)生水解生成低分子量化合物,以上清液的形式流失,使得蛋白質(zhì)提取率降低。

圖3 提取液pH對蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of pH on extraction yield of protein

2.2.3 浸提溫度對蘿藦果殼蛋白提取率的影響 從圖4可知,在浸提溫度較低時,升高提取溫度提取率隨之升高,因為溫度升高可以促進分子運動,從而促進蛋白分子浸出,而且熱作用對細胞壁有破壞作用,使蛋白質(zhì)更容易溶出。在50 ℃和60 ℃條件下,蘿藦果殼蛋白提取率比較高,之后提取率明顯下降。一方面,蛋白質(zhì)發(fā)生凝膠作用而沉淀;另一方面,升高溫度增加了蛋白質(zhì)的熱變性程度、降解反應(yīng)[15],引起蛋白質(zhì)聚集,從而降低蛋白質(zhì)溶解度,最終表現(xiàn)為提取率降低。

圖4 浸提溫度對蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of temperature on extraction yield of protein

2.2.4 提取時間對蘿藦果殼蛋白提取率的影響 從圖5可知,蘿藦果殼蛋白的提取率隨著浸提時間的延長呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,當(dāng)浸提時間為1.5 h時,提取率達到最大值為61.08%?？赡苁且驗榈鞍兹艹霾⑦_到平衡需要一定時間。而繼續(xù)延長浸提時間,會導(dǎo)致蛋白變性、水解等,致使浸提時間延長蛋白提取率反而下降,還有可能是蘿藦果殼多糖與蛋白結(jié)合,從而導(dǎo)致蛋白難以沉淀。

圖5 提取時間對蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of time on extraction yield of protein

2.3 正交實驗結(jié)果及數(shù)據(jù)分析

表2中極差大小反映實驗因素對考察指標的影響程度,極差越大,因素對指標的影響就越大。在影響蘿藦果殼蛋白提取工藝的四個因素中,對蛋白提取率的影響作用由大到小為:料液比>浸提液pH>提取時間>浸提溫度,即料液比對蛋白提取率影響最大,浸提溫度影響最小。方差分析結(jié)果見表3。

從表2中還可以得出提取蛋白的最佳組合條件A1B3C2D3,即提取時間1.0 h、提取液pH11.5、料液比1∶20 (g/mL)、浸提溫度60 ℃。驗證實驗表明,所得平均提取率為89.18%。

由表3可知,提取時間、浸提液pH、料液比對蘿藦果殼蛋白提取率的影響顯著,說明上述三個因素對蘿藦果殼蛋白提取率的影響起主要作用。浸提溫度對蘿藦果殼蛋白提取率的影響不顯著。

表2 正交實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Orthogonal test design and results

注:Ki值為同一水平下的分值之和,ki值為同一水平下的平均值,R為不同水平間均值的極差。

表3 正交實驗方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal test

注:*p<0.05表示影響顯著。

2.4 蘿藦果殼蛋白抗氧化性實驗結(jié)果

2.4.1 DPPH·清除能力的測定結(jié)果 DPPH·是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基,在517 nm處有強烈的吸收。但若體系中存在其他抗氧化性物質(zhì)時,便會由于單電子配對,使其吸收減少。故可以通過記錄DPPH·在517 nm處的吸光度值變化來評價抗氧化物質(zhì)的抗氧化能力強弱。蘿藦果殼蛋白對DPPH·的清除作用結(jié)果如圖6所示,以VC作為對照。從圖中可知,當(dāng)蘿藦果殼蛋白質(zhì)量為8 mg/mL時,清除率就可以達到79.45%,且在一定范圍內(nèi),隨質(zhì)量濃度增加而升高。其中6.45 mg/mL的蘿藦果殼蛋白的清除能力與64.5 μg/mL的VC相當(dāng)。通過數(shù)學(xué)模擬方程可知:蘿藦果殼蛋白清除DPPH·的IC50為4.19 mg/mL。

圖6 MJNP對DPPH·的清除作用Fig.6 DPPH· radical-scavenging activities of MJNP

2.4.2 ·OH清除能力的測定結(jié)果 實驗應(yīng)用Fenton反應(yīng),其本質(zhì)是Fe2+與H2O2在催化作用下生成·OH?！H被水楊酸捕捉生成2,3-二羥基苯甲酸和2,5-二羥基苯甲酸,并在510 nm處有最大吸收。蛋白溶液加入后會與水楊酸競爭·OH,使510 nm處的吸光度降低,進而可以評價其抗氧化能力[16]。結(jié)果如圖7所示,蘿藦果殼蛋白和VC對·OH都有清除作用,清除率隨蛋白濃度的增大不斷增加,濃度達到4 mg/mL時清除率達到55.35%,說明蘿藦果殼蛋白具有一定的清除·OH作用,但弱于陽性對照組VC。其中6.18 mg/mL的蘿藦果殼蛋白的清除能力與61.8 μg/mL的VC相當(dāng)。通過數(shù)學(xué)模擬方程可知:蘿藦果殼蛋白清除·OH的IC50為3.30 mg/mL。

圖7 MJNP對·OH的清除作用Fig.7 ·OH radical-scavenging activities of MJNP

2.4.3 還原能力測定結(jié)果 鐵氰化鉀在還原性物質(zhì)作用下被還原成亞鐵氰化鉀,其可在酸性條件下與Fe3+反應(yīng),生成有色物質(zhì),在700 nm處具有特征吸收,且濃度越大,其吸光值越大,即還原能力越強[17]。由圖8可知,蘿藦果殼蛋白還原能力在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)隨濃度增大而提高,并呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。表明蘿藦果殼蛋白具有一定的還原能力,但還原能力明顯低于陽性對照組VC。

圖8 蘿藦果殼蛋白的還原能力Fig.8 Reducingt power of MJNP

3 結(jié)論與討論

通過正交實驗可知:在料液比1∶20 (g/mL)、提取液pH11.5、浸提溫度60 ℃、提取時間1.0 h的條件下,蛋白提取率最高達89.18%。且蘿藦果殼蛋白具有體外抗氧化能力。蘿藦果殼蛋白清除DPPH·和·OH的IC50分別為4.19、3.30 mg/mL。由方差分析可知,在影響蘿藦果殼蛋白提取率的四個因素中,以料液比的影響最大。所以在提取過程中應(yīng)保證果殼粉與溶劑充分接觸,以避免因接觸不完全,導(dǎo)致的蛋白溶出不充分,可以采用不斷攪拌的方法促進溶出。提取液pH對蘿藦果殼蛋白提取率也有較大影響。通過堿性條件變化來影響蛋白解離程度,從而影響蛋白提取率。此外,強堿條件引起蛋白變性也是需要考慮的因素。

對蘿藦果殼蛋白抗氧化活性進行評價,以VC為陽性對照。測定其清除DPPH·、·OH的能力和還原能力。結(jié)果表明,在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi),蘿藦果殼蛋白具有一定的抗氧化能力,但弱于VC。

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Optimization of extraction process of protein fromMetaplexisJaponicaMakinonutshell and evaluation of its antioxidative activity

LI Min1,GUO Bin2,*,HAN Guan-ying2,CUI Zan2

(1.School of Pharmaceutical Sciences,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000,China; 2.The NO.1 Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000,China)

The theory of alkali extraction and acid precipitation was employed to optimize the extraction conditions of protein fromMetastasisJaponicaMakinonutshell(MJNP),and protein extraction rate as index,by means of the single factor experiments and orthogonal experiment. The results showed that the optimum conditions were as follows:ratio of solid to liquid of 1∶20(g/mL),solution pH11.5,temperature of 60 ℃ and extraction time of 1.0 h,and the average extraction yield was 89.18%. Antioxidant experiments were primarily evaluated,under the condition of the optimized process,the protein had the scavenging capacity against DPPH· and ·OH with the scavenging rate of 79.45%(8 mg/mL)and 55.35%(8 mg/mL),the IC50value of DPPH·,and ·OH was 4.19 mg/mL and 3.30 mg/mL,respectively. Moreover,the protein extracted fromMetastasisJaponicaMakinonutshell possessed weaker reducing power than VC.

MetaplexisJaponicaMakinonutshell;protein;orthogonal array design;antioxidant activity

2016-10-19

李敏(1992-)，女，碩士，研究方向：植物蛋白類物質(zhì)的研究，E-mail：18841618468@163.com。

*通訊作者:郭斌(1969-)，男，博士，教授，研究方向：海洋藥物資源的開發(fā)研究，E-mail：jyguobin@126.com。

遼寧省科技廳科技攻關(guān)計劃(2013225305)。

TS201.2

B

1002-0306(2017)07-0166-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.024