柳 夢,鄭 操,田 華,付 杰,陳 濤,何東平,*

(1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖北武漢 430023; 2.中國科學(xué)院武漢病毒研究所,湖北武漢 430071)

皮狀絲孢酵母產(chǎn)油脂的研究

柳 夢1,鄭 操1,田 華1,付 杰1,陳 濤2,何東平1,*

(1.武漢輕工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,湖北武漢 430023; 2.中國科學(xué)院武漢病毒研究所,湖北武漢 430071)

本文對皮狀絲孢酵母的生長發(fā)育和油脂合成進行了研究,監(jiān)測和分析了酵母菌生長發(fā)育、油脂合成和脂肪酸成分及數(shù)量,檢測了形態(tài)、OD值、糖氮代謝、pH、生物量、油脂含量和脂肪酸組分。結(jié)果表明:皮狀絲孢酵母生長80 h左右時鏡檢測得菌細胞體內(nèi)含油脂情況與80 h左右時實際提油獲得的油脂量相一致,其油脂產(chǎn)量為3.66 g/L,含油率約為39.20%。皮狀絲孢酵母生長0～6 h為適應(yīng)期,此時糖氮的消耗明顯,細胞數(shù)量緩慢增加;6～25 h為對數(shù)期,氮消耗非常顯著,細胞數(shù)量急劇增加,細胞變大;25～120 h為穩(wěn)定期,糖的消耗明顯,消耗速度顯然大于氮的消耗,細胞內(nèi)開始慢慢積累油脂;之后為衰退期,氮的消耗基本趨于平穩(wěn)。皮狀絲孢酵母所產(chǎn)脂肪酸主要以C16、C18為主,此類脂肪酸適于進行脂交換制備生物柴油。

皮狀絲孢酵母,脂肪酸成分分析,糖氮代謝

能源安全問題在國際上一直是個被高度重視的問題。隨著石油資源逐漸減少以及石油燃燒產(chǎn)生的廢氣對環(huán)境生態(tài)的巨大影響,而帶來的霧霾、二氧化碳增多使全球變暖等問題,促進了各國科學(xué)家企業(yè)家尋求新的能源,其中包括風(fēng)能、日光能和生物柴油[1-2]。

生物柴油是一種由甘油三酯與乙醇通過甲基化得到的生物燃料,具有含硫物質(zhì)和含芳香性物質(zhì)量低、燃燒性能優(yōu)良及生物可降解性等優(yōu)點[3-4]。含有甘油三酯的油脂包括大豆油、棕櫚油、菜籽油、烏桕油、襐籽油等植物油脂和豬油、牛油、羊油等動物油脂以及餐飲廢棄油脂(地溝油)等[5]。

目前,用植物油脂和動物油脂來制備生物柴油已不能完全滿足人們生活生產(chǎn)的需求,因此對微生物油脂這一新油脂資源的開發(fā)和研究越來越受到人們的關(guān)注[6-9]。微生物油脂又稱單細胞油脂,是由細菌、酵母菌、絲狀真菌和海洋微藻等微生物產(chǎn)生的油脂。它們利用碳源(糖)、氮源(蛋白質(zhì))以及微量元素(鈉、鐵等)等營養(yǎng)物質(zhì),在一定的條件下生長發(fā)育產(chǎn)生大量的菌(藻)體,同時進行合成油脂而積累于細胞內(nèi)。然后收集菌(藻)體,提取油脂。微生物油脂是含有甘油三酯的脂肪酸,包括棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸(GLA、ALA)、花生四烯酸(ARA)和二十二碳六烯酸(DHA)等,其中一部分可作為人體的營養(yǎng)因子如ARA、DHA等,一部分可作為生物柴油的原料如棕櫚酸、硬脂酸等。目前,主要集中在酵母菌和微藻產(chǎn)生油脂的研究[10-11]。皮狀絲孢酵母(Trichosporoncutaneum)是一株高產(chǎn)油脂的菌株,其生長發(fā)育不受場地、季節(jié)等限制,發(fā)酵周期短[12-14],且所產(chǎn)脂肪酸成分與植物油脂脂肪酸成分相似,能為企業(yè)節(jié)約生產(chǎn)成本。

目前,國內(nèi)外對皮狀絲孢酵母產(chǎn)油脂的研究較少。本文選取皮狀絲孢酵母作為研究對象,并對其生長發(fā)育和油脂的合成進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

皮狀絲孢酵母(Trichosporoncutaneum) 編號GIM2.68,廣東省微生物菌種保藏中心;種子培養(yǎng)基組成(g/L) 蛋白胨5、葡萄糖10、酵母粉3、麥芽提取物3;發(fā)酵培養(yǎng)基組成(g/L) 蛋白胨15、葡萄糖80、酵母粉3、麥芽提取物3、金屬離子混合物0.01,維生素混合物0.03。

葡萄糖(分析純)，氫氧化鉀 天津市博迪化工股份有限公司;酵母粉 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;麥芽提取物、正己烷(色譜級)、乙醚、石油醚、鹽酸、甘油、50%三氯化硼 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;蒸餾水,甲醇 天津市東麗區(qū)泰蘭德化學(xué)試劑有限公司;無水乙醇 天津凱通化學(xué)試劑有限公司。

SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司;YM75立式壓力蒸汽滅菌器 上海三申醫(yī)療器械有限公司;RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;TDL-5-A臺式低速離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠;AUY120電子天平 島津國際貿(mào)易(上海)有限公司;HYQ-150S全溫搖床 武漢匯誠生物科技有限公司;XSP-BM-2CA生物顯微鏡 上海上光新光學(xué)科學(xué)有限公司;GZX-9070MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱、SPX-150C恒溫恒濕箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;BCD-197VCZ 冰箱 河南新飛電器有限公司;XB-K-25血球計數(shù)板 鹽城市榮康玻璃儀器有限公司;安捷倫7890A-5975C氣質(zhì)色譜儀 安捷倫科技(中國)有限公司;色譜柱:SP-2560(100 m×25 μm×0.2 μm);紫外可見分光光度計 上海美譜達UV-3100PC)。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化 將凍干的菌粉用液體培養(yǎng)基制成懸浮液,吸取懸浮液100 μL涂布與平板上。涂布完畢將平板置于恒溫培養(yǎng)箱,在(28±2) ℃培養(yǎng)17 h轉(zhuǎn)接到另一個平板上,依次傳五代,獲得菌種。

1.2.2 種子培養(yǎng) 從活化好的平板中挑取較大的單菌落接種到含有5 mL液體培養(yǎng)基的安瓿瓶中,置于搖床中固定好,在(28±2) ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)17 h,取樣檢查。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng) 將培養(yǎng)處于對數(shù)期的菌種子液接種于發(fā)酵搖瓶中,在(28±2) ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)120 h,每隔24 h取樣。用40倍高倍物鏡觀察皮狀絲孢酵母發(fā)酵過程中生長形態(tài)的變化,并拍照片。

1.2.4 生長曲線測定 從種子液培養(yǎng)開始,每2 h從搖瓶中取100 μL菌液到96微孔板中,在紫外分光光度計600 nm波長下測定菌液的吸光度,并作好記錄。菌液的吸光度可代表菌體的生長情況。

1.2.5 發(fā)酵過程中糖、氮代謝的測定 糖含量的測定采用蒽酮-硫酸法測定總糖[15],氮含量的測定采用凱氏定氮法[16]。

1.2.6 發(fā)酵過程中pH的測定 從加入發(fā)酵瓶開始,每隔5 h測一次取少量發(fā)酵液用pH計測發(fā)酵液的pH,并做好記錄。

1.2.7 生物量的測定 分別取70、80、90、100、110、120 h的發(fā)酵液1 L于燒杯中,分別標記為1、2、3、4、5、6,在4000 r/min下離心,洗滌三次。收集菌泥置于稱量好(記作M1,單位為g)的燒杯中,35 ℃干燥至恒重,稱取重量(記作M2,單位為g)。

生物量的計算公式:

式(1)

1.2.8 油脂的提取 將1.2.7中菌粉按照每克8 mL鹽酸(6 mol)的比例加入鹽酸,振蕩混勻室溫靜置1 h后,沸水浴中加熱8 min,立即放入-20 ℃冰箱中冷凍30 min。此操作重復(fù)五次。用高倍顯微鏡涂片檢測是否破壁完全。若破壁不完全,則繼續(xù)重復(fù)上述操作直至破壁完全[17]。細胞破壁完全后,將菌液倒入分液漏斗中,按照20 mL/g無水乙醇、24 mL/g已醚、24 mL/g石油醚的順序往分液漏斗中添加。搖勻靜置一段時間后取上清液放在稱量好重量(記作M3,單位為g)的旋蒸瓶中,60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),直至有機溶劑全部蒸發(fā)完畢旋蒸瓶內(nèi)重量達到恒重,稱取重量(記作M4,單位為g)。

油脂產(chǎn)量及含油率的計算公式:

油脂重量(g)=M4-M3

式(2)

式(3)

式(4)

1.2.9 脂肪酸成分測定

1.2.9.1 樣品前處理 在樣品中加入0.5 mol/L氫氧化鉀-甲醇溶液1 mL,在60 ℃水浴鍋內(nèi)加熱30 min,加熱過程中不斷振蕩。然后50%三氟化硼-甲醇溶液1 mL,在60 ℃水浴鍋內(nèi)邊振蕩邊加熱30 min。加熱完畢后加入5 mL正己烷混勻,靜置后取上清液過濾,過濾好后注入進樣瓶中,待測。

1.2.9.2 檢測條件 升溫程序:140 ℃保持1 min,以5 ℃/min升溫至190 ℃,然后3 ℃/min升溫至220 ℃保持2 min。載氣(N2)流速25 mL/min,壓力2.4 kPa,進樣量1.8 μL,不分流[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 皮狀絲孢酵母油脂積累

圖1顯示了皮狀絲孢酵母四個不同時期顯微鏡下的形態(tài),在72 h顯微鏡的圖片上細胞較小,邊緣清晰,胞內(nèi)油脂含量較少,胞內(nèi)色澤清亮透明;在80 h的時候酵母胞內(nèi)綠色最深且色澤明亮,細胞也最大,胞內(nèi)油脂聚集最多;從90、108 h的顯微鏡圖片中發(fā)現(xiàn)酵母細胞沒有增多,胞內(nèi)油脂含量逐漸減少,細胞色澤變暗,由于酵母菌生長到一定階段的時候出現(xiàn)衰老及培養(yǎng)中產(chǎn)生的一些溶解胞壁的酶,致使細胞壁出現(xiàn)溶解現(xiàn)象,所以出現(xiàn)了培養(yǎng)時間越長就會出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。因此,認為發(fā)酵至80 h時細胞完整及胞內(nèi)油脂含量較高,終止發(fā)酵。

圖1 皮狀絲孢酵母油脂積累顯微圖片(40倍)Fig.1 Oil accumulation micrograph of T. cutaneum

2.2 皮狀絲孢酵母的生長曲線

從圖2可知,皮狀絲孢酵母在種子培養(yǎng)基中直接發(fā)酵和在利用種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中的發(fā)酵的生長曲線相似。0～6 h,生長緩慢,是皮狀絲孢酵母的發(fā)酵適應(yīng)期;6～25 h時,曲線呈上升趨勢,此期間為皮狀絲孢酵母的生長對數(shù)期;從25～65 h,菌體生長緩慢,生長曲線平穩(wěn)增加,此期間為皮狀絲孢酵母的穩(wěn)定期;從65 h后,種子培養(yǎng)基直接發(fā)酵的菌體不再增加,生長曲線不再變化;而用種子液轉(zhuǎn)接的發(fā)酵培養(yǎng)液中菌體還在繼續(xù)緩慢增長;到120 h以后,菌體數(shù)量逐漸減少,說明皮狀絲孢酵母到了衰退期。本實驗的結(jié)果說明了皮狀絲孢酵母有無種子轉(zhuǎn)接的生長情況基本一致,這就為進行工業(yè)化一步法發(fā)酵生產(chǎn)提供了依據(jù)。

圖2 皮狀絲孢酵母生長曲線圖Fig.2 The growth curve of T. cutaneum

2.3 糖氮代謝及pH的變化

從圖3可以看出,隨著發(fā)酵時間的延長,發(fā)酵液中pH在逐漸下降,到了第80 h之后,pH緩慢趨于穩(wěn)定,在3.5之間徘徊,說明皮狀絲孢酵母在發(fā)酵過程中產(chǎn)酸,發(fā)酵時需要實時調(diào)節(jié)pH穩(wěn)定至中性。從圖4、圖5中可以看到,在對數(shù)期時,培養(yǎng)基中糖的濃度下降速度較低,而氮的濃度下降速度較快,說明細胞增長速度較快,耗氮速度快。到了穩(wěn)定期時,發(fā)酵液中氮的濃度基本趨于穩(wěn)定,說明菌體生長緩慢,基本不再消耗氮源,發(fā)酵液中糖的濃度下降明顯,說明油脂在細胞內(nèi)不斷合成。在發(fā)酵到90 h以后,發(fā)酵液中糖與氮的濃度基本沒有變化,發(fā)酵液中還有一部分的糖和氮剩余。由于油脂的產(chǎn)生需要糖來轉(zhuǎn)化,培養(yǎng)基中糖的初始含量過高,也會影響氮的消耗,反之也會互相影響,最后導(dǎo)致微生物的生長和產(chǎn)油受到制約,所以后期優(yōu)化培養(yǎng)基成分時,可以適當(dāng)調(diào)整培養(yǎng)基中糖氮的比例來促進皮狀絲孢酵母的產(chǎn)油量和糖氮利用。

圖3 不同時期發(fā)酵液pHFig.3 pH of fermentation broth during different periods

圖4 不同時期發(fā)酵液中糖濃度Fig.4 Sugar concentrations of fermentation broth during different periods

2.4 生物量及油脂產(chǎn)量

由圖6可知,當(dāng)皮狀絲孢酵母發(fā)酵80 h時,含油量達到最高,含油量為3.66 g/L,得油率為39.20%。發(fā)酵90 h左右時得油率大幅度下降,所以皮狀絲孢酵母最佳的發(fā)酵時間約為80 h左右。

表1 皮狀絲孢酵母胞內(nèi)油脂各組分質(zhì)量分數(shù)Table 1 The content percentages of each fatty acid component in total lipid of T. cutaneum

2.5 皮狀絲孢酵母胞內(nèi)油脂脂肪酸組分測定

圖5 不同時期發(fā)酵液中氮濃度Fig.5 Nitrogen concentrations of fermentation broth during different periods

圖6 不同時期生物量和油脂產(chǎn)量 Fig.6 Biomass and oil productions during different periods

由總離子流圖(圖7)和表1可知,飽和脂肪酸占97%,棕櫚酸含量最高占53.2%,其次為油酸占24.1%,不飽和脂肪酸的含量較低,這些脂肪酸成分與作為生物柴油原料的植物油料作物的脂肪酸成分相似。因此,皮狀絲孢酵母的胞內(nèi)油脂可作為制備生物柴油的原料。

圖7 皮狀絲孢酵母胞內(nèi)油脂脂肪酸的總離子流圖Fig.7 Typical total ion chromatogram of total lipid of T. cutaneum

3 結(jié)論與討論

皮狀絲孢酵母為產(chǎn)油脂酵母,其含油量為3.66 g/L,含油率為39.20%,最佳的發(fā)酵時間為80 h。皮狀絲孢酵母發(fā)酵至對數(shù)期時氮消耗較快,發(fā)酵至穩(wěn)定期時糖消耗較快,并且在種子培養(yǎng)基中直接發(fā)酵和從種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵,兩者的生長曲線比較相似,表明皮狀絲孢酵母可以進行一步法發(fā)酵;皮狀絲孢酵母在發(fā)酵過程中pH從6下降至3.5左右,表明其在發(fā)酵過程中產(chǎn)酸。

實驗數(shù)據(jù)還表明,皮狀絲孢酵母的脂肪酸組成與植物油脂的脂肪酸組成相似,所產(chǎn)油脂的脂肪酸主要為飽和脂肪酸,如C16、C18,而這類脂肪酸又易于進行脂交換反應(yīng),可在甲酯化后獲得硬脂酸甲酯、亞油酸甲酯,所以皮狀絲孢酵母的胞內(nèi)油脂可作為制備生物柴油的原料[19-24]。

[1]李為民,鄭曉林,徐春明,等.固體堿法制備生物柴油及其性能[J].化工學(xué)報,2005,56(4):711-716.

[2]劉金勝,藺建民,張建榮,等.新型酚酰胺抗氧劑AO-BIO的合成及在生物柴油中的應(yīng)用[J].石油學(xué)報(石油加工),2013,29(3):404-408.

[3]吳偉光,仇煥廣,徐志剛,等.生物柴油發(fā)展現(xiàn)狀、影響與展望[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報,2009,25(3):298-302.

[4]胡芳華,殷福珊.產(chǎn)油酵母菌——可再生油脂的潛在資源[J].日用化學(xué)品科學(xué),2009,32(4):12-13.

[5]岳金方,左春麗,黃琴,等.地溝油制備生物柴油的研究進展[J].廣州化工,2010,38(12):84-85,130.

[6]里偉,杜偉,李永紅,等.生物酶法轉(zhuǎn)化酵母油脂合成生物柴油[J].過程工程學(xué)報,2007,7(1):137-140.

[7]Jia S S,Min J,Zhang F Q,et al. Study on single cell oil from inulin fermented byTrichosporoncutaneum[J]. Science & Technology of Food Industry,2012,33(15):174-177.

[8]Chen X F,Huang C,Xiong L,et al. Microbial oil production from corncob acid hydrolysate byTrichosporoncutaneum[J]. Biotechnology Letters,2012,34(6):1025-1028.

[9]Pirozzi D,Ausiello A,Yousuf A,et al. Exploitation of oleaginous yeasts for the production of microbial oils from agricultural biomass[J]. Chemical Engineering Transactions,2014,37(5):11-28.

[10]Shen J J,Fu-Chao L I,Yang Q L,et al. Fermentation of Spartina anglica acid hydrolysate byTrichosporoncutaneumfor microbial lipid production[J]. Marine Sciences,2007,31(8):38-41.

[11]汪倫記,糾敏,吉艷青,等.菊芋提取液的皮狀絲孢酵母發(fā)酵產(chǎn)油脂實驗研究[J].中國糧油學(xué)報,2014,29(9):52-56,64.

[12]陳韜,陳雪芳,楊小燕,等.阿魏酸對皮狀絲孢酵母細胞生長與油脂積累影響的研究[J].廣東化工,2013,(7):30-31.

[13]胡翠敏,王倩,龔志偉,等.皮狀絲孢酵母同步利用葡萄糖/木糖的糖轉(zhuǎn)運動力學(xué)[J].生物加工過程,2014,(1):18-22.

[14]賈閃閃,糾敏,張峰齊，等.皮狀絲孢酵母菌發(fā)酵菊粉產(chǎn)油脂的研究[J].食品工業(yè)科技,2012,33(15):174-177.

[15]魏苑,張盛貴.蒽酮-硫酸法測定枸杞多糖含量的研究[J].食品工業(yè)科技,2011,(3):399-401.

[16]鄭賢光,辛若竹.全自動凱氏定氮儀測定化肥中的含氮量[J].化學(xué)分析計量,2014,(5):41-43.

[17]易弋,容元平,程謙偉,等.不同破壁方法提取酵母菌總RNA的比較[J].食品科學(xué),2011,32(11):161-164.

[18]王美珠,范琳,葉蕊芳,等.皮狀絲孢酵母的高溫馴化及細胞膜脂肪酸組成的測定[J].中國油脂,2014,(5):48-52.

[19]賈閃閃,糾敏,汪倫記,等.皮狀絲孢酵母發(fā)酵菊粉產(chǎn)油脂培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].中國釀造,2012,31(5):63-67.

[20]Yuan J,Ai Z,Zhang Z,et al.Microbial oil production by Trichosporon cutaneum B3 using cassava starch[J]. Chinese Journal of Biotechnology,2011,27(3):453-460.

[21]沈珺珺,李富超,楊慶利,等.皮狀絲孢酵母利用大米草水解液發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂[J].海洋科學(xué),2007,31(8):38-41.

[22]李新社,易自力,陸步詩,等.復(fù)合誘變皮狀絲孢酵母選育高產(chǎn)油脂菌株[J].中國油脂,2010,35(7):31-34.

[23]Kang J,Liu Y,Li M,et al. Fermentation by Trichosporon cutaneum IFFI01367 for bio-oil production from corn straw hydrolysate[J]. Journal of Pure & Applied Microbiology,2014,8(3):2031-2038.

[24]Kolomiets E I,Romanovskaya T V,Zdor N A. Physiological requirements ofTrichosporoncutaneumgrown on hydrolysed lignin.[J]. Mikrobiologicheskiiǐ Zhurnal,1990,5(5):34-36.

Study on production of oils fromTrichosporoncutaneum

LIU Meng1,ZHENG Cao1,TIAN Hua1,FU Jie1,CHEN Tao2,HE Dong-ping1,*

(1.College of Food Science and Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China; 2.Wuhan Institute of Virus,Chinese Academy of Sciences,Wuhan 430071,China)

This study focused on the growth development and oil synthesis ofTrichosporoncutaneum. The morphology ofT.cutaneum,OD value,sugar and nitrogen concentrations,pH,oil content and the profile of the total fatty acid were individually measured and analyzed. The study demonstrated that the quantity of extracted oils fromT.cutaneumwas well agreed with its intracellular oils at 80 h,at this time the production and content of oil were 3.66 g/L and 39.20%,respectively. Meanwhile,results showed that the time from 0 h to 6 h was the lag phase,at which the consumptions of sugar and nitrogen were obvious,and the cell numbers was increased slowly. From 6 h to 25 h,the concentrations of sugar and nitrogen were rapidly decreased,and the cell numbers was largely increased,thus this period represented the logarithmic phase. From 25 h to 120 h,the consumption rate of sugar was higher than that of nitrogen,and the intracellular oils were gradually accumulated at this period,which named stationary phase. Thereafter,cells entered into decline phase,at which the concentrations of sugar and nitrogen were maintained constantly at low levels. More importantly,long chain saturated fatty acids were the most mainly fatty acid in total lipid ofT.cutaneum,giving a new source for the preparation of biodiesel.

Trichosporoncutaneum;analysis of the fatty acid composition;metabolism of sugar and nitrogen

2016-09-09

柳夢(1994-)，女，碩士研究生，研究方向：微生物油脂，E-mail：13720325344@163.com。

*通訊作者:何東平(1957-)，男，博士，教授，研究方向：糧食、油脂及植物蛋白，E-mail：hedp123456@163.com。

TS201.3

A

1002-0306(2017)07-0150-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.016