蘇 靖，李興廣，李衛(wèi)紅，胡艷紅，馬家寶，張 賽，胡京紅，王淑艷，姜昭妍

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

三七總皂苷對(duì)擬缺血損傷腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞PLA2G4A表達(dá)及其下游產(chǎn)物的影響?

蘇 靖，李興廣△，李衛(wèi)紅△，胡艷紅，馬家寶，張 賽，胡京紅，王淑艷，姜昭妍

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

目的:觀察三七總皂苷(panax notoginseng saponins，PNS)對(duì)擬缺血損傷腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿型磷脂酶 A2IVA (phospholipase A2 group IVA，PLA2G4A)表達(dá)及其功能的影響。方法:培養(yǎng)大鼠原代腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，氧糖剝奪法制備擬缺血模型，用三七總皂苷及PLA2G4A抑制劑進(jìn)行干預(yù)，通過RT－PCR和Western blotting法檢測(cè)各組PLA2G4A基因及蛋白表達(dá)水平，ELISA法檢測(cè)各組花生四烯酸(arachidonic acid，AA)、20－羥二十烷四烯酸(20－h(huán)ydroxyeicosatetraenoic acid，20－HETE)、血栓素A2 (thromboxanea2，TXA2)/前列環(huán)素(prostaglandin I2，PGI2)表達(dá)水平。結(jié)果:三七總皂苷可顯著下調(diào)PLA2G4A的基因和蛋白表達(dá)，對(duì)AA、20－HETE、TXA2/PGI2也有下調(diào)作用。結(jié)論:三七總皂苷可以下調(diào)擬缺血損傷腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞PLA2G4A及其下游產(chǎn)物的表達(dá)，這可能是三七總皂苷在腦缺血損傷中發(fā)揮化瘀通絡(luò)作用的機(jī)制之一。

三七總皂苷;腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞;PLA2G4A;AA;20－HETE

傳統(tǒng)中藥三七具有化瘀通絡(luò)的功效，臨床廣泛應(yīng)用于缺血性中風(fēng)的治療。三七總皂苷(panax notoginseng saponins，PNS)是三七的主要有效組分，研究顯示可以有效改善缺血性腦梗死腦血流狀態(tài)，并減少梗死灶體積［1］。本課題組前期通過基因芯片技術(shù)篩選，發(fā)現(xiàn)PNS對(duì)擬缺血損傷的腦微血管內(nèi)皮細(xì) 胞 (brain microvascular endothelialcells，BMECs)胞漿型磷脂酶 A2IVA(phospholipase A2 group IVA，PLA2G4A)mRNA具有顯著下調(diào)效果。因此本研究在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，觀察了 PNS對(duì)BMECs的PLA2G4A基因和蛋白表達(dá)的影響，并以PLA2G4A抑制劑為對(duì)照，觀察PNS對(duì)PLA2G4A下游產(chǎn)物花生四烯酸(arachidonic acid，AA)、20－羥二十烷四烯酸(20－h(huán)ydroxyeicosatetraenoic acid，20－HETE)、血栓素A2(thromboxaneA2，TXA2)/前列環(huán)素(prostaglandin I2，PGI2)的調(diào)節(jié)作用，以期揭示PNS在腦缺血中發(fā)揮化瘀通絡(luò)作用的分子機(jī)制。

1 方法

1.1 大鼠原代BMECs培養(yǎng)

按本課題組已建立的方法進(jìn)行原代BMECs培養(yǎng)［2］，用SD大鼠幼鼠(斯貝福公司)進(jìn)行取材，將幼鼠鍘頭后取出大腦皮質(zhì)，研磨并用200目濾膜過濾，刮取濾膜上的濾出物，離心沖洗后得到原代BMECs細(xì)胞種于培養(yǎng)瓶中，傳至第三代純度達(dá)90%以上時(shí)使用。

1.2 氧糖剝奪法(oxygen－glucose－deprived，OGD)制備擬缺血損傷模型

按本課題組已建立的方法制備BMECs擬缺血損傷模型［3］，向第三代BMECs中加入無糖Kerb’s液，后置于氣體成分為94%N2、5%CO2、1%O2的三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。

1.3 PLA2G4A抑制劑濃度篩選

PLA2G4A抑制劑選用Pyrrophenone(Cayman)，其可特異抑制PLA2G4A活性并下調(diào)下游產(chǎn)物花生四烯酸的(Arachidonic Acid，AA)生成［4］。實(shí)驗(yàn)設(shè)置1、2、4、8、16、32、64 μg/ml 7個(gè)濃度，每個(gè)濃度設(shè)8個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置模型組與空白組。將第三代BMEC均勻接種于24孔板，貼壁面積達(dá)90%以上使用。OGD造模前2 h給藥，造模結(jié)束后用ELISA法測(cè)各組AA含量，計(jì)算出Pyrrophenone對(duì)AA的半數(shù)抑制量為12.86 μg/ml。

1.4 分組與處理

首先將培養(yǎng)至第三代的BMECs分為正常組、模型組、PNS組3組。正常組不做處理，其余2組按上述方法造模。PNS組造模前2 h給予22 μg/ml PNS(前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)PNS最佳濃度為22 μg/ml［5］)，觀察PNS對(duì)擬缺血BMECs PLA2G4A mRNA及蛋白表達(dá)的影響，以驗(yàn)證基因芯片結(jié)果。然后利用PLA2G4A抑制劑Pyrrophenon做對(duì)照，觀察PNS對(duì)PLA2G4A下游的影響。將內(nèi)皮細(xì)胞分為正常組、模型組、Pyrrophenon組、PNS組4組。Pyrrophenon組在造模前2 h按照12.86 μg/ml濃度加入 Pyrrophenone，PNS組加藥情況同上。

1.5 RT－PCR法檢測(cè)PLA2G4A mRNA表達(dá)量

3組細(xì)胞處理結(jié)束后用Trizol提取總RNA，通過cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Scientific)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，之后擴(kuò)增后在PCR檢測(cè)儀上測(cè)定PLA2G4A的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果用2－△△ct法表示。PCR引物如下，PLA2G4AF端:TTTGGGAGTTTCTGG CTCAC，R 端 TCTTCATTCTCGGTGCCTTT;內(nèi) 參 F端: TATCGGCAATGCCTCTTGAATG，R端:AGCACT GTTGGCATAGAGG。

1.6 Western Blotting檢測(cè)PLA2G4A蛋白表達(dá)

圖1 各組細(xì)胞PLA2G4A mRNA表達(dá)量

圖2 各組細(xì)胞PLA2G4A蛋白表達(dá)量

3組細(xì)胞處理結(jié)束后，使用裂解液收集細(xì)胞，用超聲細(xì)胞破碎機(jī)破碎后4℃離心處理并收集上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。配聚丙烯酞胺膠后蛋白上樣電泳并轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶封閉1 h，洗膜后加入1∶1000稀釋的PLA2G4A山羊一抗(Sigma)4℃過夜，次日洗膜后加入1∶5000稀釋的兔抗山羊二抗(Sigma)孵育顯色并照相，使用ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析。

1.7 ELISA法測(cè)定AA、20－HETE、TXA2/PGI2表達(dá)

按照elisa試劑盒(Abcam)說明書加入細(xì)胞裂解液后離心提取上清，提取樣本后測(cè)定各組AA、20－HETE、TXA2、PGI2濃度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均差±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉ±s)表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞PLA2G4A mRNA表達(dá)

圖1顯示，與正常組比較，模型組PLA2G4mRNA表達(dá)明顯上升(P＜0.01);與模型組比較;PNS組PLA2G4A mRNA的表達(dá)明顯下降(P ＜0.01)。

2.2 各組BMECs PLA2G4A蛋白表達(dá)

圖2顯示，與正常組比較，模型組PLA2G4A蛋白表達(dá)量明顯增加(P＜0.01);與模型組比較，PNS 組PLA2G4A蛋白表達(dá)明顯降低(P＜0.01)。

2.3 Elisa法測(cè)BMECs的AA含量

圖3顯示，與正常組比較，模型組AA表達(dá)量明顯增加(P＜0.01);與模型組比較，PNS組AA表達(dá)明顯降低(P＜0.01)。

2.4 各組BMECs的TXA2/PGI2變化

圖4顯示，與正常組比較，模型組TXA2/PGI2比例增高(P＜0.05);與模型組比較，PNS組及抑制劑組TXA2/PGI2比例降低(P＜0.05)

2.5 各組BMECs的20－HETE含量

圖5顯示，與正常組比較，模型組20－HETE表達(dá)明顯增高(P＜0.01);與模型組比較，PNS組及抑制劑組20－HETE表達(dá)明顯降低(P＜0.01)

圖3 各組細(xì)胞AA蛋白表達(dá)量

圖4 各組細(xì)胞TXA2/PGI2

圖5 各組細(xì)胞20-HETE表達(dá)量

3 討論

PLA2G4A是胞漿型磷脂酶 A2的最主要亞型［6］，也是催化包膜磷脂水解生成AA的關(guān)鍵蛋白［7］。隨著研究深入，其在腫瘤、炎癥等領(lǐng)域的作用相繼被發(fā)現(xiàn)［8－9］，但該蛋白在腦微血管內(nèi)皮的研究卻鮮有報(bào)道。

本課題組通過基因芯片篩查發(fā)現(xiàn)，BMECs經(jīng)OGD造模后，PLA2G4A mRNA表達(dá)升高。因此本實(shí)驗(yàn)采用PCR、Western bolting法測(cè)定PLA2G4A的基因蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示該蛋白在造模后表達(dá)上調(diào)，提示其可能參與缺血后的病理進(jìn)程。再以ELISA法檢測(cè)其下游產(chǎn)物 AA、20－HETE、TXA2/ PGI2的表達(dá)情況

AA是細(xì)胞膜被PLA2G4A分解后的產(chǎn)物，在腦缺血時(shí)過表達(dá)，其下游代謝產(chǎn)物廣泛參與凝血、炎癥等多種病理進(jìn)程。20－HETE是AA的代謝產(chǎn)物，具有強(qiáng)烈收縮血管作用，Marija Renic等發(fā)現(xiàn)抑制20－HETE表達(dá)可改善梗死后腦血流狀態(tài)并減少梗死灶體積［10］。TXA2/PGI2是一對(duì)呈拮抗作用的AA代謝產(chǎn)物，分別具有促/抗凝血作用，其比例影響著血小板的黏附性，該比例使血小板黏附性增強(qiáng)，血液黏度增大。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，OGD造模后 BMECs中PLA2G4A基因、蛋白及其下游產(chǎn)物AA、20－HETE、TXA2、PGI2均過表達(dá)，提示PLA2G4A基因的高表達(dá)可能導(dǎo)致PLA2G4A蛋白的合成增加，加速胞膜水解生成AA。AA含量升高進(jìn)一步導(dǎo)致其下游產(chǎn)物20－HETE、TXA2、PGI2過表達(dá)。20－HETE過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致血管痙攣收縮，引起血管管徑狹窄形狀迂曲，增加血流阻力降低血液流速;TXA2/PGI2比例升高會(huì)使血小板黏附性增強(qiáng)，增加血液黏度，以上變化最終導(dǎo)致血液流動(dòng)性變差，血液黏度變大，使腦缺血時(shí)腦血管內(nèi)凝血及血栓形成率上升，也提示PLA2G4A的過表達(dá)可能是導(dǎo)致腦缺血后血管痙攣及血液高凝狀態(tài)的內(nèi)在機(jī)制之一。實(shí)驗(yàn)中，PNS則表現(xiàn)出下調(diào)PLA2G4A基因、蛋白及其下游產(chǎn)物AA、20－HETE、 TXA2/PGI2的作用，提示PNS對(duì)該通路的下調(diào)作用可能可以發(fā)揮緩解血管痙攣、降低血液黏度的效果，這可能是PNS在腦缺血治療中發(fā)揮化瘀通絡(luò)作用的機(jī)制之一。

［1］韓淑燕，李海霞，文宗曜，等.三七總皂苷對(duì)急性血瘀大鼠血液流變學(xué)的改善作用［J］.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2009，3:183－187.

［2］李衛(wèi)紅，李澎濤，華茜，等.不同內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)皮層神經(jīng)元線粒體功能的影響及通絡(luò)救腦注射液的保護(hù)作用［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2007，2:131－134.

［3］朱元，李澎濤，李衛(wèi)紅，等.不同狀態(tài)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞血腦屏障特征性酶的影響［J］.世界科學(xué)技術(shù):中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2012，2:1393－1398.

［4］N FLAMAND，S PICARD，L LEMIEUX，et al.Effects of pyrrophenone，an inhibitor of groupIV Aphospholipase A2，on eicosanoid and PAF biosynthesis n human neutrophils［J］.British Journal of Pharmacology，2006，149:385－392.

［5］郭曉謹(jǐn)，李興廣，李衛(wèi)紅，等.三七、梔子組分配伍對(duì)擬缺血損傷腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2014，2:215－216.

［6］ AKHLAQ A.FAROOQUI，WEI－YIONG，LLOYD A.Horrocks. Inhibitors of Brain Phospholipase A2 Activity:Their Neuropharmacological Effects and Therapeutic Importance for the Treatment of Neurologic Disorders［J］.Pharmacol Rev，2006，58:591－620.

［7］ YOSHIHIRO KITA，TAKAYO OHTO，NAONORI UOZUMI，et al.Biochemicalproperties and pathophysiologicalroles of cytosolic phospholipase A2s［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1761(11):1317－22.

［8］RISTO KERKEL?，et al.Cytosolic phospholipaseA2α protects against ischemia/reperfusion injury in the heart［J］.Clin Transl Sci，2011，4(4):236－242.

［9］ LINKOUS AG，YAZLOVITSKAYA EM，HALLAHAN DE. Cytosolic phospholipase A2 and lysophospholipids in tumor angiogenesis［J］.Natl Cancer Inst，2010，102(18):1398－1412.

［10］ MARIJA RENIC，JUDITH A KLAUS，TOMOHIRO OMURA. Effect of 20－HETE inhibition on infarct volume and cerebral blood flow after transient middle cerebral artery occlusion［J］.Cereb Blood Flow MeTab，2009，29(3):629.

The Effects of PNS on the PLA2G4A And it’s Downstream Products in Mimic Ischemic Brain Microvascular Endothelial Cells

SU Jing，LI Xing－guang△，LI Wei－h(huán)ong△，HU Yan－h(huán)ong，MA Jia－bao，ZHANG Sai，HU Jing－h(huán)ong，WANG Shu－yan，KANG So－yeon
(Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China)

Objective to evaluate the effects of Panax Notoginseng Saponins(PNS)on the PLA2G4A in Mimic ischemia brain microvascular endothelial cells(BMECs).Methods:primary rat BMECs were used and mimic cerebral ischemia in vitro was established by oxygen－glucose－deprived(OGD)method.OGD－induced BMECs were treated with PNS and Pyrrophenone(PLA2G4A inhibitor)respectively.The expression of PLA2G4A in mRNA and protein were detected by RT－PCR and Western blot methods.The expression of AA 20－HETE TXA2/PGI2 were detected by Elisa method.Results: both mRNA and protein expression of PLA2G4A in OGD－induced BMECs were down－regulated by PNS.AA 20－HETE TXA2/PGI2 were also decreased in administration group.Conclusion:PNS can down regulate the expression and function of PLA2G4A，which may be the internal mechanism of PNS’s Anticoagulant effect in cerebral ischemia.

Panax Notoginseng Saponins;brain microvascular endothelial cells;PLA2G4A;AA;20－HETE

R285.5

B

1006－3250(2017)02－0196－03

2016－07－19

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81273885)

蘇 靖(1989－)，男，在讀碩士，從事中藥藥理的臨床與研究。

△

李興廣，男，教授，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，Tel:13621008162，E－mail:lixingguan@hotmail.com;李衛(wèi)紅，女，副教授，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，Tel:010－64286982，E－mail:liweihong.403@163.com。