王凌志，柴紀嚴，劉旭東，劉文俊，趙金茹，王守巖，單德紅，張立德，王德山

β-內啡肽過度釋放參與脾氣虛納少和腹脹的形成?

王凌志，柴紀嚴，劉旭東，劉文俊，趙金茹，王守巖，單德紅，張立德，王德山△

納少與腹脹是脾氣虛證的常見癥狀，二者常常同時出現，其生物學機制目前尚不清楚?，F代醫(yī)學認為，進食行為主要受控于下丘腦的攝食中樞與飽中樞，二者相互拮抗，前者啟動進食行為，后者中斷進食。前阿黑皮素(proopiomelanocortin，POMC)神經元為厭食神經元，其合成分泌的 β－內啡肽(βendorphin，β－EP)能夠作用于攝食神經元，降低其興奮性，抑制食欲，中斷進食［1－2］。這些中樞信號傳至外周后，能夠影響腸神經系統(tǒng)分泌β－EP，進而通過抑制胃腸平滑肌興奮性和Cajal細胞等多條途徑降低胃腸動力［3－4］。飲食不節(jié)和過度疲勞是誘發(fā)脾氣虛證的常見病因，而這兩個因素也能誘發(fā)β－EP過度釋放［5－6］，因此推測β－EP過度釋放在脾氣虛納少與腹脹的發(fā)生中起重要作用。為證實此假說，特開展本實驗。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠20只，體質量(200±10)g，購于遼寧省本溪巿實驗動物中心(SCXK(遼)－2010－0001)，飼養(yǎng)于遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心(合格證號SYXK(遼)－2013－000－9)，室溫18～23℃，相對濕度45%～55%，自由飲水進食，適應性飼養(yǎng)1周后開始實驗。

1.1.2 試劑 β－EP檢測試劑盒和兔抗大鼠β－EPμ受體多克隆抗體購于北京博奧森生物技術有限公司(中國)，羊抗兔IgG、S－P超敏試劑盒和DAB均購于福州邁新生物技術開發(fā)有限公司(中國)。

1.1.3 儀器 BIO－RAD iMark酶標儀(美國伯樂公司)，BI－2000圖像分析系統(tǒng)(中國成都泰盟科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和模型復制及評價 大鼠按隨機數字表法分為對照組和脾氣虛組(模型組)各10只。對照組不造模，模型組按文獻方法［7－8］復制大鼠脾氣虛模型并評價，即在15 d內先飽食1 d再禁食2 d，共5個循環(huán)，同時每日水溫35～37℃游泳至力竭;評價標準:大鼠出現消瘦、食少、神疲乏力、毛色枯槁無光澤等。

1.2.2 大鼠“納少”評價 主要檢測24 h進食/水量，即大鼠單只放入代謝籠24 h后，測量投食/水量和剩余食/水量，二者差值即為其24 h進食/水量。

1.2.3 大鼠“腹脹”評價 采用炭末推進法檢測胃殘留率和小腸推進率。大鼠禁食不禁水24 h后，給予10%炭粉混懸液(5%活性炭和10%阿拉伯膠)灌胃(1 mL/100 g)，30 min后10%水合氯醛麻醉大鼠(0.35 mL/100 g)，打開腹腔分別取胃與小腸，量取胃內炭末量與總灌胃量相比為胃殘留率;量取小腸內炭粉前端至幽門距離，與幽門至小腸末端距離之比為小腸推進率。

1.2.4 組織β－EP水平檢測 取麻醉大鼠的下丘腦、胃和幽門下1～2 cm小腸，制備組織勻漿，凍存?zhèn)溆?。采用ELISA方法，嚴格按試劑盒說明書操作，檢測上述組織β－EP水平。

1.2.5 μ受體表達 采用免疫組化法。取麻醉大鼠的全腦、胃和小腸4%多聚甲醛固定后，制備石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水，雙氧水封閉，PBS洗3 min ×3次，檸檬酸緩沖液(0.01 mol/L，pH6.0)，微波爐中高火3 min，低火維持15 min，冷卻至室溫后PBS 洗3 min×3次;滴加血清封閉液，37℃水浴30 min，棄血清，滴加兔抗大鼠μ受體多克隆抗體(1∶300) 4.0℃過夜，37℃水浴2 h;PBS洗3 min×3次，滴加羊抗兔IgG，37℃水浴30 min;PBS洗3 min×3次，DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇二甲苯脫水，中性樹膠封片。陰性對照采用抗體稀釋液代替一抗，步驟同上。μ受體表達呈棕黃色，位于細胞膜上，采用BI－2000圖像分析系統(tǒng)分析其平均光密度(MOD)。

1.2.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數據以均數±標準差(±s)表示，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

實驗過程中無動物死亡及脫失情況發(fā)生。對照組大鼠體格健壯，飲食正常，反應敏捷，被毛緊密有光澤;模型組大鼠則明顯消瘦食少，神疲乏力，反應遲鈍，被毛蓬起無光澤，達到模型評價標準。

2.2 大鼠“納少”和“腹脹”情況

表1顯示，與對照組比較，模型組進食量和進水量顯著減少(P＜0.05，P＜0.01)，表明該組大鼠出現“納少”;胃殘留率雖有下降但不明顯，小腸推進率顯著下降(P＜0.01)，提示該組大鼠存在“腹脹”現象。

2.3 大鼠相關組織β－EP水平和μ受體表達

表2顯示，模型組大鼠下丘腦、胃和小腸組織的β－EP水平和μ受體表達均顯著高于對照組(P＜0.05，P＜0.01)。

表1 大鼠“納少”和“腹脹”評價(±s)

表1 大鼠“納少”和“腹脹”評價(±s)

注:與對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

表2 2組大鼠相關組織β-EP水平及μ受體表達(±s)

表2 2組大鼠相關組織β-EP水平及μ受體表達(±s)

注:與對照組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

3 討論

中醫(yī)認為脾主運化，為氣血生化之源，實際上認為脾主導機體的能量攝入，是維持能量穩(wěn)態(tài)的重要因素。從神經生理學的角度來說，能量穩(wěn)態(tài)主要受控于下丘腦的攝食神經元和厭食神經元［9］。POMC神經元為厭食神經元，能夠合成釋放β－EP抑制攝食神經元，降低食欲，減少食物攝取。腸神經系統(tǒng)受下丘腦影響，除合成釋放經典的神經遞質外，還能夠通過釋放β－EP，直接或間接地抑制胃腸電活動，減少乙酰膽堿分泌，增強環(huán)形肌張力，減弱縱行肌收縮力，引起胃腸運動停滯［4］。因此，β－EP可以在中樞和胃腸道兩個方面影響進食行為。

研究發(fā)現，禁食和運動能夠誘發(fā)β－EP過度釋放。自愿堅持5 d以上禁食的患者，其血漿β－EP顯著上升［5］，體育鍛煉或高強度運動也能促進β－EP釋放［6－10］。由于禁食和疲勞也是引起脾氣虛的常見病因，本實驗就采用這兩種因素成功復制了大鼠的脾氣虛模型，特別是大鼠進食水量明顯減少，表明其出現“納少”的類人癥狀。此外，本實驗還觀察到該組大鼠的胃殘留率變小，小腸推進率顯著下降，提示大鼠還存在“腹脹”現象，即脾氣虛大鼠同時出現“納少”和“腹脹”現象。由于高水平的β－EP能夠抑制食欲，減慢胃腸運動，因此推測其參與了脾氣虛納少和腹脹的形成。

首先在下丘腦方面，本實驗檢測到模型組大鼠下丘腦β－EP水平和μ受體表達均顯著升高，提示脾氣虛狀態(tài)下POMC神經元功能亢進，β－EP被大量合成釋放，結合其高表達的受體后能夠強化對攝食神經元的抑制。研究發(fā)現，β－EP能夠直接激活K+通道，促進K+外流，使攝食神經元超極化，降低其興奮性，還可以抑制攝食神經元胞內cAMP合成，削弱其合成釋放相關的促食欲成分［11］。由此推測脾氣虛時，下丘腦的厭食神經元興奮，進食神經元抑制，引起食欲下降。其次，本實驗觀察到，模型組大鼠的胃腸組織中β－EP及μ受體表達水平也顯著升高，推測脾氣虛時腸神經系統(tǒng)中β－EP能神經元功能增強，大量釋放β－EP，與高表達的μ受體結合后可以抑制胃腸電活動，干擾胃腸動力，導致食物推進障礙，出現腹脹。因此本研究認為，β－EP過度釋放參與了脾氣虛納少和腹脹的形成。

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(遼寧中醫(yī)藥大學，沈陽 110847)

目的:研究β－內啡肽(β－endorphin，β－EP)與脾氣虛納少和腹脹的關系。方法:20只雄性SD大鼠按隨機數字表法分為對照組和脾氣虛模型組(模型組)，每組10只;代謝籠檢測大鼠24 h進食/水量，炭末法評估胃殘留率和小腸推進率，ELISA法檢測下丘腦、胃和小腸組織β－EP含量，免疫組化法檢測下丘腦、胃和小腸組織中μ受體表達。結果:模型組大鼠的進食/水量顯著下降，小腸推進率明顯下降，下丘腦、胃和小腸組織中β－EP水平和μ受體表達顯著增加。結論:β－EP過度釋放參與了脾氣虛納少和腹脹的形成。

脾氣虛;β－內啡肽;納少;腹脹;μ受體

Over-relasing of β-endorphin Involves in the Formation of Both the Poor Appetite and Abdominal Distension in Spleen Qi Deficiency

WANG Ling－zhi，CHAI Ji－yan，LIU Xu－dong，LIU Wen－jun，ZHAO Jin－ru，
WANG Shou－yan，SHAN De－h(huán)ong，ZHANG Li－de，WANG De－shan△
(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Liaoning Shenyang 110847，China)

Objective:To study the relation of β－endorphin(β－EP)in the formation of both the poor appetite and abdominal distension in spleen qi deficiency.Methods:20 male SD rats were randomly divided into the control and spleen qi deficiency group(model group)，10 rats each group;metabolic cages were used to detect rat food and water intakes per day;carbon propulsion rate were applied to check the stomach residual rate and small intestine(SI)propelling rate (SIPR);ELISA and immohistochemistry were separately used to measure β－EP concentrations and μ receptor expressions in hypothalamic，stomach and SI tissues.Results:compared with those in the control，model rats significantly showed less food and water intake，reduced SIPR，and enhanced β－EP concentrations and μ receptor expressions of in the hypothalamic，stomach and SI tissues.Conclusion:the overrelease of β－EP involves in the formation of both the poor appetite and abdominal distension in spleen qi deficiency.

Spleen qi deficiency;β－EP;Poor appetite;Abdominal distension;μreceptor

R2－031

B

1006－3250(2017)02－0184－03

2016－07－25

國家重點基礎研究發(fā)展計劃(973計劃) (2013CB531702)－“脾主運化、統(tǒng)血”等脾藏象理論研究

王凌志(1977－)，男，遼寧沈陽人，副教授，醫(yī)學碩士，從事中醫(yī)防治心身疾病的臨床與研究。

△通訊作者:王德山(1951－)，男，遼寧大連人，教授，醫(yī)學碩士，從事中醫(yī)藥調控消化吸收的機制研究，Tel:13889217511，E－mail:wwddss5768@163.com。