孟祥玉，佟盼盼，馮二凱，陳立志*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林長春 130122；2.吉林特研生物技術(shù)有限責(zé)任公司，吉林長春 130122 )

?

壞死梭桿菌研究進(jìn)展

孟祥玉1,2，佟盼盼1,2，馮二凱1,2，陳立志1,2*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林長春 130122；2.吉林特研生物技術(shù)有限責(zé)任公司，吉林長春 130122 )

壞死梭桿菌(Fusobacteriumnecrophorum，F(xiàn)n)是一種嚴(yán)格厭氧的革蘭陰性多形態(tài)桿菌，其致病因子包括內(nèi)毒素、白細(xì)胞毒素、血小板凝集因子、血凝素和溶血素等，其中主要的致病因子是白細(xì)胞毒素。由壞死梭桿菌引起的疾病在不同國家和地區(qū)均有發(fā)生，鹿、羊等反芻動(dòng)物感染壞死梭桿菌時(shí)表現(xiàn)為跛行，關(guān)節(jié)腫大，肝膿腫和腐蹄病，豬、馬等動(dòng)物感染壞死梭桿菌時(shí)主要表現(xiàn)為跛行，嚴(yán)重時(shí)繼發(fā)其他細(xì)菌感染，對養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失；人類感染該細(xì)菌時(shí)表現(xiàn)為急性咽炎綜合征(Lemierre's syndrome)。論文通過對國內(nèi)外壞死梭桿菌及其疫苗研究和新型佐劑的開發(fā)進(jìn)行綜述，以期為該細(xì)菌疫苗的研制提供參考。

壞死梭桿菌；腐蹄病；疫苗

壞死梭桿菌(Fusobacteriumnecrophorum，F(xiàn)n)是一種嚴(yán)格厭氧的革蘭陰性多形態(tài)桿菌，在新鮮病灶和幼齡培養(yǎng)物中多呈長絲狀，在固體培養(yǎng)基和老齡培養(yǎng)物中多為球狀或短桿狀。因此，顯微鏡下通常可以觀察到有長絲和短桿兩種形態(tài)[1]。壞死梭桿菌能夠產(chǎn)生多種致病因子，如內(nèi)毒素、白細(xì)胞毒素、蛋白水解酶類、血凝素和溶血素等[2]。由于壞死梭桿菌白細(xì)胞毒素的產(chǎn)量與導(dǎo)致動(dòng)物產(chǎn)生膿腫的能力有關(guān)，因此，普遍認(rèn)為白細(xì)胞毒素是壞死梭桿菌的主要毒力因子。壞死梭桿菌廣泛存在于動(dòng)物和人的口腔、胃腸道和泌尿生殖道中，經(jīng)常引起動(dòng)物的壞死性病變，是肝膿腫、腐蹄病、壞死性喉炎(犢牛白喉)和牛其他壞死性疾病的主要病原菌。臨床上，壞死灶常局限于肢蹄部，嚴(yán)重的可在唇部、面部、消化道、生殖道、肝臟、肺臟見到壞死灶，其中肝膿腫多發(fā)生在育肥牛，而腐蹄病多發(fā)生在肉牛和奶牛，這兩種疾病給牛的健康養(yǎng)殖造成了嚴(yán)重的損失。壞死梭桿菌也是人類急性咽炎綜合征(Lemierre's syndrome)的重要病原菌，人感染該菌時(shí)多表現(xiàn)為咽炎和血液感染以及頸靜脈血栓[3-5]，研究發(fā)現(xiàn)，壞死梭桿菌不僅會(huì)引起人的扁桃體炎，還會(huì)引起人的肺臟膿腫結(jié)節(jié)，神經(jīng)影像檢測顯示在大腦中有多處膿腫和硬膜下積膿，并且在顱內(nèi)吸收的膿腫液中可以檢測到該菌[6]。

根據(jù)不同來源的壞死梭桿菌在固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)差異，將其分為4種亞型，即A型、B型、AB型和C型。其中，C型壞死梭桿菌沒有致病性，稱為偽壞死梭桿菌，后來研究發(fā)現(xiàn)，該菌與變形梭桿菌同源；AB型壞死梭桿菌同時(shí)具有A型和B型壞死梭桿菌的生物學(xué)特性，通過16S RNA序列分析發(fā)現(xiàn)，AB型與B型的親緣關(guān)系更近；A型壞死梭桿菌常見于牛、羊、鹿等動(dòng)物的腐蹄病和肝膿腫病灶，具有血凝活性和溶血活性；B型壞死梭桿菌常見于反芻動(dòng)物瘤胃內(nèi)容物和人的急性咽炎綜合征，血凝活性較弱。Shinjo等[7]比較了該菌的形態(tài)學(xué)特征和生化特性，結(jié)合細(xì)菌基因組GC含量和同源性，將A型和B型壞死梭桿菌重新命名為Fusobacteriumnecrophorumsubsp.necrophorum(Fnn亞種)和Fusobacteriumnecrophorumsubsp.funduliforme(Fnf亞種)。

1 壞死梭桿菌的毒力因子

壞死梭桿菌引發(fā)感染性疾病涉及到多種毒力因子的作用，包括白細(xì)胞毒素、內(nèi)毒素、溶血素、血凝素、黏附素、血小板凝集因子、外膜蛋白、皮膚壞死毒素、細(xì)胞壁溶膠原等成分以及幾種胞外酶，如DNase和朊酶類。這些毒力因子在細(xì)菌黏附宿主細(xì)胞侵入機(jī)體、逃避機(jī)體天然免疫防御以及形成感染等方面起著重要的作用。

研究發(fā)現(xiàn)，壞死梭桿菌的外膜蛋白(OMP)具有介導(dǎo)黏附牛腎上腺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能，并且Fnn和Fnf兩個(gè)亞種的菌株都存在這種外膜蛋白[8]，由此可以推斷，OMP可能是細(xì)菌侵入細(xì)胞的主要蛋白。研究人員通過提取純化其他革蘭陰性菌的OMP進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)和ELISA檢測抗體，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有一定的免疫原性，可以引起動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生抗體，結(jié)果為選擇壞死梭桿菌抗原制備疫苗提供了參考。

內(nèi)毒素是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種脂多糖成分，對宿主有很強(qiáng)的毒性，如給小鼠腹腔注射很快可以引起其死亡；給兔皮內(nèi)注射，可引起局部皮膚壞死和紅斑；內(nèi)毒素可引起宿主發(fā)熱、微循環(huán)障礙、內(nèi)毒素休克及彌漫性血管內(nèi)凝血等疾病，而且內(nèi)毒素穩(wěn)定耐熱、抗原性弱。Baker B等[9]用小鼠巨噬細(xì)胞進(jìn)行的研究表明，超低劑量的內(nèi)毒素會(huì)引起慢性炎癥，同時(shí)還可以引起蛋白的泛素化和線粒體融合蛋白1的降解，導(dǎo)致發(fā)動(dòng)蛋白1的去磷酸化和激活細(xì)胞程序性死亡，所以內(nèi)毒素在壞死梭桿菌的致病過程中發(fā)揮了重要的作用。Garcia等[10]用甲醛滅活的壞死梭桿菌外毒素和少量內(nèi)毒素制成疫苗免疫牛，使牛的肝膿腫發(fā)病率降低了37%。但由于內(nèi)毒素的毒性強(qiáng)，單獨(dú)作為抗原制備疫苗可能會(huì)對機(jī)體造成較大的副作用，可以考慮用少許內(nèi)毒素作為佐劑，用于提高疫苗的免疫效果。

白細(xì)胞毒素是一種蛋白毒素，天然的白細(xì)胞毒素是胞外蛋白，分泌量少，但是其致病性很強(qiáng)，可以明確標(biāo)記白細(xì)胞表面的相關(guān)受體并與之結(jié)合，引起白細(xì)胞中毒、凋亡、造成動(dòng)物機(jī)體的免疫力下降，形成腐蹄?。贿€可以和溶酶體外膜的受體蛋白結(jié)合引起白細(xì)胞毒素和該抗原內(nèi)化入溶酶體中，引起溶酶體內(nèi)容物釋放的中斷，并且白細(xì)胞毒素會(huì)作為第一個(gè)細(xì)菌毒素定位到溶酶體引起其功能的喪失。當(dāng)壞死梭桿菌分泌的白細(xì)胞毒素進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞之后，會(huì)引起機(jī)體免疫功能下降，細(xì)菌再次分泌其他毒素后，機(jī)體無法產(chǎn)生足夠的免疫力抵抗細(xì)菌，同時(shí)也增加了其他細(xì)菌感染動(dòng)物機(jī)體的幾率，容易造成混合感染，又由于機(jī)體溶酶體，如清除外來有害物質(zhì)和受損細(xì)胞結(jié)構(gòu)、降解營養(yǎng)成分、合成代謝等的部分功能喪失，細(xì)胞還可能因?yàn)闋I養(yǎng)物質(zhì)不足導(dǎo)致功能性衰竭，最終引起細(xì)胞壞死。由于白細(xì)胞毒素的產(chǎn)量和肝膿腫嚴(yán)重性有關(guān)，其一直以來都被研究人員認(rèn)為是壞死梭桿菌的主要致病因子。試驗(yàn)證明，接種含有白細(xì)胞毒素的細(xì)菌培養(yǎng)基濾出液可以明顯降低牛腐蹄病的發(fā)病率[11-12]；Saginala S等[13]通過對壞死梭桿菌白細(xì)胞毒素苗敏感性試驗(yàn)效果的觀察，發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞毒素苗免疫有劑量依賴性，利用1 mL、2 mL和5 mL細(xì)菌培養(yǎng)基上清液制備疫苗免疫肉用牛，結(jié)果顯示，1 mL上清液疫苗的保護(hù)率為60%，2 mL與5 mL上清液疫苗的保護(hù)率相同均為80%，因此可以得出結(jié)論，隨著劑量的增加，其免疫效果越來越好，但是最高劑量為2 mL，而其中白細(xì)胞毒素的濃度并未測定；Narayannan S K等[14-15]研制出白細(xì)胞毒素基因工程疫苗，用原核表達(dá)的方法將白細(xì)胞毒素的5種多肽鏈(BSBSE,SX,GAS,SH和FINAL)進(jìn)行表達(dá)與重組，并與佐劑乳化制成不同成分疫苗，同時(shí)與滅活菌體苗和滅活菌體培養(yǎng)基苗對照，發(fā)現(xiàn)重組的白細(xì)胞毒素疫苗免疫效果明顯好于兩對照組，并且含有BSBSE和SH肽鏈片段的疫苗產(chǎn)生的免疫保護(hù)效果最好。

2 壞死梭桿菌感染的發(fā)病情況

壞死梭桿菌廣泛地存在于自然界之中，由于其感染的部位和途徑不同，因此可引發(fā)不同癥狀的疾病。國內(nèi)學(xué)者報(bào)道，感染壞死梭桿菌的動(dòng)物有發(fā)生肝臟、肺臟膿腫的病例[16-17]。新疆、內(nèi)蒙、西藏、青海、甘肅、四川、黑龍江、吉林、湖北、云南等省份均存在腐蹄病[18]；北美地區(qū)也有大角羊患腐蹄病的報(bào)道，并且已通過PCR方法對確診[19]；研究人員對印度喀什米爾草原患蹄叉腐爛的養(yǎng)殖綿羊采樣，壞死梭桿菌可以分泌特異的白細(xì)胞毒素，因此利用特異性引物可以進(jìn)行PCR反應(yīng)，得到白細(xì)胞毒素LktA特異性片段和16S rRNA方法進(jìn)行菌種鑒定，確診有壞死梭桿菌感染[20]。最初報(bào)道該細(xì)菌感染綿羊、山羊、牛，偶爾感染馬[21]，之后又有報(bào)道豬也有感染壞死梭桿菌的，并出現(xiàn)跛行的癥狀[22]。

3 壞死梭桿菌疫苗研究及面臨的問題

目前，國內(nèi)還沒有商品化的壞死梭桿菌疫苗，有研究人員已經(jīng)開始進(jìn)行壞死梭桿菌疫苗的研制，王克堅(jiān)等[23]研制的鹿源壞死梭桿菌菌體裂解疫苗對鹿有一定的保護(hù)效果。前文中提到，國外研究人員利用白細(xì)胞毒素、外毒素以及內(nèi)毒素等不同成分制備疫苗，均獲得一定進(jìn)展，但是利用含有內(nèi)毒素等成分制備的疫苗可能對動(dòng)物體產(chǎn)生較大的副作用，因此，制備亞單位疫苗具有很大的應(yīng)用價(jià)值。但是在亞單位疫苗制作過程中仍然面臨很多亟待解決的問題：白細(xì)胞毒素作為外分泌蛋白是最主要的致病因子，其分泌量非常低，在離心收集菌體時(shí)很容易丟失；多種致病因子屬于外分泌蛋白或細(xì)胞壁成分，在獲取胞內(nèi)蛋白的過程中丟失，因此，抗原性物質(zhì)量少甚至沒有；選擇可用的最佳佐劑與合適的抗原；壞死梭桿菌引起的疾病屬于慢性感染性細(xì)菌病，在建立穩(wěn)定的動(dòng)物感染模型時(shí)半數(shù)致死量、最低發(fā)病劑量的測定；由于大部分自然感染該菌的病例中多數(shù)屬于混合感染，并且壞死梭桿菌有不同的亞種，因此，在制備亞單位疫苗的時(shí)候還要考慮到交叉免疫的問題。綜上所述，在壞死梭桿菌疫苗的研制過程中仍面臨諸多問題和挑戰(zhàn)。

4 前景及展望

據(jù)統(tǒng)計(jì)，1957年至2015年，我國共批準(zhǔn)103個(gè)獸用細(xì)菌類疫苗，主要為常規(guī)的家畜家禽用疫苗，而大家畜、特種動(dòng)物等用的疫苗非常缺乏。隨著養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，牛、羊等產(chǎn)業(yè)逐漸龐大，同時(shí)，鹿茸作為一種藥用價(jià)值很高的藥物，越來越受到研究人員的認(rèn)可，鹿產(chǎn)業(yè)逐漸興盛起來，因此，壞死梭桿菌亞單位疫苗研制的前景十分廣闊。通過國內(nèi)外學(xué)者對該細(xì)菌的不同毒力因子的研究，為疫苗制備時(shí)抗原的選擇指明了方向。一些國外研制成功的疫苗，如外毒素和內(nèi)毒素疫苗，白細(xì)胞毒素基因工程疫苗等成功的實(shí)例為國內(nèi)研究人員制備壞死梭桿菌疫苗提供了可靠的研究依據(jù)。隨著近幾年新型疫苗佐劑的發(fā)現(xiàn)，如二氧化硅、維生素A和維生素E以及兒茶素中的黃酮類等，為研制出保護(hù)效果更好的壞死梭桿菌疫苗奠定了基礎(chǔ)。

[1] 陸承平. 獸醫(yī)微生物學(xué)[M].中國農(nóng)業(yè)出版社，2001：297-298.

[2] 王克堅(jiān)，張洪英，陳立志等. 致病性鹿源壞死梭桿菌分離鑒定[J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2000，22(2)：84-87.

[4] Alfreijat M. A case of Lemierre's Syndrome with a brief literature review[J].J Infect Public Health.2016,9(5):681-3.

[5] Riordan T. Human infection withFusobacteriumnecrophorum(necrobacillosis), with a focus on Lemierre's syndrome[J].Clin Microbiol Rev，2007,20(4):622-659.

[6] Haddad N, Morris T, Dhillon R, et al. Unusual neurological presentation ofFusobacteriumnecrophorumdisease[J].BMJ Case Rep，2016,12:2016.

[7] Shinjo T, Fujisawa T, Mitsuoka T. Proposal two subspecies ofFusobacteriumnecrophorum(Flügge) Moore and Holdeman:Fusobacteriumnecrophorumsubsp.necrophorumsubsp. nov., nom. rev.(ex Flügge 1886),andFusobacteriumnecrophorumsubsp.funduliformesubsp. nov., nom. rev. (ex Hallé 1898)[J].Int J Syst Bacteriol，1991,41(3):395-397.

[8] Kumar A, Menon S, Nagaraja T G, et al. Identification of an outer membrane protein ofFusobacteriumnecrophorumsubsp.necrophorumthat binds with high affinity to bovine endothelial cells[J].Vet Microbiol，2015,176(1-2): 196 -201.

[9] Baker B, Maitra U, Geng S, et al. Molecular and cellular mechanisms responsible for cellular stress and low-grade inflammation induced by a super-low dose of endotoxin[J].J Biol Chem，2014,289(23):16262-16269.

[10] Nagaraja T G, Narayanan S K, Stewart G C, et al.Fusobacteriumnecrophoruminfections in animals: Pathogenesis and pathogenic mechanisms[J].Anaerobe，2005,11(4):239-246.

[11] Takeuchi S, Nakajima Y, Ueda H,et al. Hepatic abscess formation in cattle inoculated withFusobacteriumnecrophorum[J].Nihon Juigaku Zasshi，1984,46(3):339-344.

[12] Tan Z L, Nagaraja T G, Chengappa M M.Fusobacteriumnecrophoruminfections: Virulence factors, pathogenic mechanism and control measures[J].Vet Res Commun，1996，20(2):113-140.

[13] Saginala S, Nagaraja T G, Lechtenberg K F. Effect ofFusobacteriumnecrophorumleukotoxoid vaccine on susceptibility to experimentally induced liver abscesses in cattle[J].J Anim Sci，1997，75(4):1160-1166.

[14] Narayanan S K, Nagaraja T G, Chengappa M M, et al. Cloning sequencing and expression of leukotoxin gene fromFusobacteriumnecrophorum[J].Infect Immun，2001,69(9):5447-5455.

[15] Narayanan S K, Chengappa M M, Stewart G C, et al. Immunogenicity and protective effects truncated recombinant leukotoxin proteins ofFusobacteriumnecrophorumin mice [J].Vet Microbiol，2003,93(4):335-347.

[16] 劉明華，周 艷. 羔羊肝膿腫防治[J].四川畜牧獸醫(yī)，2006(8)：57.

[17] 宋氏斌，王 濤，于洪澤.羔羊壞死桿菌病的診治[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2006(9)：45.

[18] 馬利青，李 劍，宋忠武，等. 青海省牛羊“腐蹄病”發(fā)生特點(diǎn)及其綜合防治[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志，2016，46(1)：41-45.

[19] Shanthalingam S, Narayanan S, Batra SA, et al.Fusobacteriumnecrophorumin North American Bighorn sheep (oviscanadensis) pneumonia[J].J Wildl Dis，2016,52(3):616-620.

[20] Farooq S, Wani S A, Hassan M N, et al. The detection of dichelobacter nodosus, andFusobacteriumnecrophorum, from ovine footrot in Kashmir, India[J].Anaerobe，2015,35(Pt B):41-3.

[21] Bennett G N, Hickford J G. Ovine footrot: new approaches to an old disease[J]. Vet Microbiol,2011,24:148(1):1-7.

[22] Zhou H, Dobbinson S, Hickford J G.Fusobacteriumnecrophorumvariants present on the hooves of lame pigs[J].Vet Microbiol,2010,141(3-4):390.

[23] 王克堅(jiān)，劉曉穎，陳立志，等. 鹿源壞死梭桿菌毒力菌株FN(AB)94抗原的免疫原性[J].中國獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2002，22(5)：468-469.

Progress onFusobacteriumnecrophorum

MENG Xiang-yu1,2,TONG Pan-pan1,2,FENG Er-kai1,2,CHEN Li-zhi1,2

(1.InstituteofSpecialEconomicAnimalandPlantSciences,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Changchun，Jilin，130122,China；2.JilinSpecialResearchBiologicalTechnologyCo.，LTD.，Changchun，Jilin，130122，China)

Fusobacteriumnecrophorumis a kind of anaerobic Gram negative pleomorphic rod bacteria. Virulence factors were introduced inFusobacteriumnecrophorumincluding endotoxin, leukotoxin, platelet aggregation factor, hemagglutinin, and hemolysin. However, leukotoxin is considered to be the major virulence factor. Diseases caused byFusobacteriumnecrophorumbroke out in different areas of different countries, the ruminants,deer and sheep, show lameness, arthrocele, liver abscess and "footrot disease"when infected withFusobacteriumnecrophorum,while animals,swine and horses show lameness due to infection ofFusobacteriumnecrophorumand become susceptible to other bacterial pathogens, causing huge losses to the animal husbandry; while human infected with the bacteria show acute pharyngitis syndrome (Lemierre's syndrome). In this review,we collected data to summarize characteristics ofFusobacteriumnecrophorumand bacterial vaccines as well as new development of new adjuvants to provide theories from both home and abroad for the bacterial vaccine development.

Fusobacteriumnecrophorum; footrot disease; vaccine

2016-10-20

吉林省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(20150204073NY)

孟祥玉(1991-)，男，河北滄州人，碩士研究生，主要從事壞死梭桿菌亞單位疫苗研究。 *通訊作者

S855.12

A

1007-5038(2017)05-0086-04