朱偉英，猴銀行，霍寧寧，桑鋒鋒，張洪杰，高 洋，李言言，王 毅，陳德坤*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.陜西省富平縣動物疫病預(yù)防控制中心，陜西富平 711700)

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一株奶山羊偽結(jié)核棒狀桿菌的分離與鑒定

朱偉英1，猴銀行2，霍寧寧1，桑鋒鋒1，張洪杰1，高 洋1，李言言1，王 毅1，陳德坤1*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.陜西省富平縣動物疫病預(yù)防控制中心，陜西富平 711700)

為獲得陜西某羊場病羊膿包中的病原菌，以無菌采集的病羊頸部膿汁為材料，進行細菌分離培養(yǎng)，鑒定分離菌株的形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化特性，挑取分離菌株進行協(xié)同溶血試驗(cAMP)和16S rRNA 基因的PCR 擴增，并對序列進行分析，NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；用分離菌株分別接種Balb/c小鼠和奶山羊；藥敏試驗鑒定分離株的耐藥性。結(jié)果顯示，分離菌株的形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化特性與伯杰細菌鑒定手冊所述偽結(jié)核棒狀桿菌特性一致；測序顯示分離菌株與GenBank中已收錄偽結(jié)核棒狀桿菌相似性達97%以上；Balb/c小鼠致病性試驗和奶山羊動物回歸試驗表明分離株有強致病性；藥敏試驗表明分離菌株對紅霉素、環(huán)丙沙星、克拉霉素、強力霉素、四環(huán)素、頭孢唑啉、新霉素、氧氟沙星等多種抗生素敏感，對復(fù)方新諾明耐藥。

山羊；偽結(jié)核棒狀桿菌；分離；鑒定

偽結(jié)核棒狀桿菌(Corynebacteriumpseudotuberculosis,CP)是引起山羊和綿羊干酪性淋巴結(jié)炎(Caseous lymphadenitis,CLA)的病原菌，能使山羊、綿羊、駱駝、馬、牛和小鼠等多種動物致病[1-4]，以山羊體表或內(nèi)臟組織形成干酪性膿腫為主要特征[2,5]。該菌可致病羊消瘦、生產(chǎn)性能低下和繁殖功能障礙。由于發(fā)病遲緩，致死率低，故常常為人所忽視[5-6]；而常規(guī)外科處理復(fù)發(fā)率較高，且藥物治療效果不佳，因此很難徹底清除，是獸醫(yī)界公認的難以防治的動物傳染病之一[7-10]。

近期陜西某奶山羊養(yǎng)殖基地的一些泌乳羊于下頜部、肩胛部和腹股溝等處淋巴結(jié)鼓起較大膿包，羊群觸診發(fā)現(xiàn)呈堅硬感或波動感，甚至破潰流膿，疑似偽結(jié)核棒狀桿菌感染癥狀。為進一步確診該病，無菌采集病羊膿包中的膿汁進行細菌分離鑒定、動物致病性試驗和藥敏試驗，證明分離鑒定出一株山羊偽結(jié)核棒狀桿菌，為今后該養(yǎng)殖地區(qū)本病防控提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 陜西省某羊場疑似山羊偽結(jié)核病羊膿包的膿汁樣品。

1.1.2 菌株 馬紅球菌(Rhodococcusequi)，購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑TaqDNA聚合酶、dNTPs，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000、寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；生化鑒定管、藥敏紙片，杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品；酵母提取物、胰蛋白胨、瓊脂粉、異硫氰酸胍、二硫蘇糖醇、Na2EDTA、NaCl、二氧化硅、異丙醇、無水乙醇、結(jié)晶紫、碘化鉀、碘、番紅、溴化乙錠等為進口或者國產(chǎn)分析純；各種培養(yǎng)基及平板西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)實驗室自行配制。

1.1.4 試驗動物 Balb/c 小鼠4只，雌性，6周齡，購自第四軍醫(yī)大學(xué)；關(guān)中奶山羊1頭，雄性，8月齡，正常飼喂于西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 分離純化 無菌操作取適量膿汁稀釋液接種50 mL/L綿羊鮮血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24 h ～ 48 h，選取單個菌落，涂片、革蘭染色、鏡檢后，接種于鮮血瓊脂平板、普通瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板，37℃培養(yǎng)48 h觀察結(jié)果[11]；并分別接種LB培養(yǎng)基和10 mL/L犢牛血清LB培養(yǎng)基，37℃純化培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)特性，并涂片染色鏡檢[12]。

1.2.2 生化特性 取上述純化培養(yǎng)后菌落，常規(guī)方法接種一套生化反應(yīng)培養(yǎng)管，37℃培養(yǎng)24 h ～ 48 h 后觀察結(jié)果[13]。

1.2.3 協(xié)同溶血試驗 先接種R.equi單菌落于綿羊鮮血瓊脂平板，接種針滅菌后，垂直方向接種分離菌株單菌落使兩者呈T字分布，37℃培養(yǎng)24 h后觀察協(xié)同溶血現(xiàn)象，記錄試驗結(jié)果[14]。

1.2.4 分子生物學(xué)鑒定 參照文獻[10]設(shè)計的偽結(jié)核棒狀桿菌16S rRNA 基因設(shè)計引物如下，上游引物(P1)：5′-ACCGCACTTTAGTGTGTGTG-3′；下游引物(P2)：5′-TCTCTACGCCGATCTTGTAT-3′。 由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。二氧化硅法提取細菌基因組DNA進行PCR擴增[10]。PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，將陽性結(jié)果送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序，測序結(jié)果用NCBI Blast比對，NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進行遺傳進化分析[15]。

1.2.5 小白鼠致病性試驗 Balb/c小鼠隨機分成2組，每組3只，每只腹股溝皮下接種0.2 mL；試驗組接種1.8×108CFU/ mL菌液，對照組接種LB培養(yǎng)基；每日常規(guī)飼養(yǎng)觀察小鼠發(fā)病情況并記錄結(jié)果[1]。1.2.6 動物回歸試驗 關(guān)中奶山羊頸部皮下一側(cè)接種1.8×108CFU/mL 菌液2.0 mL，另一側(cè)接種LB培養(yǎng)基2.0 mL作為對照；每日常規(guī)飼養(yǎng)觀察山羊發(fā)病情況并記錄結(jié)果[12]。

1.2.7 藥敏試驗 常規(guī)紙片法對上述分離株進行藥敏試驗。參照美國CLSI標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)抑菌環(huán)直徑大小判定細菌對相應(yīng)抗菌藥物的敏感程度

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)及鏡檢

膿汁涂片鏡檢革蘭染色陽性，有時易脫色，多呈棒狀或球桿狀，無莢膜，無芽胞，不能運動；多單在、成雙或柵欄狀排列(圖1)。純培養(yǎng)物涂片中，多數(shù)為球狀，酷似葡萄球菌，少數(shù)為桿狀。

膿汁在鮮血瓊脂平板上初分離時，可見培養(yǎng)基表面呈密集的棉絮狀(圖2)。挑取單個菌落接種，在含血液、血清的培養(yǎng)基上生長良好；普通培養(yǎng)基上生長緩慢、貧瘠；麥康凱瓊脂上不生長。鮮血瓊脂平板24 h 可見針尖狀小菌落，隨后菌落逐漸增大；48 h 后菌落變成干燥、不透明、灰白色、同心圓狀、邊緣不齊、中央突出，周圍有狹窄β溶血環(huán)，傳代后溶血現(xiàn)象消失(圖3)。普通瓊脂平板48 h 可見灰白色、圓形、較干燥的小菌落(圖4)。菌落易推動、破碎，酒精燈火焰灼燒時有區(qū)別于其他菌株的噼啪聲。LB液體培養(yǎng)基24 h 微混，至48 h 表面形成白色菌膜，震蕩后菌膜破碎，管底存在顆粒狀、絮狀沉淀；加入血清可明顯加速沉淀物形成。分離株從菌落形態(tài)和染色特性上與山羊偽結(jié)核棒狀桿菌相似。

圖1 分離菌株革蘭染色100×

圖2 膿汁血平板照片

圖3 分離菌株(血板)

圖4 分離菌株(白板)

2.2 生化特性

分離株可發(fā)酵甘露糖、果糖、葡萄糖產(chǎn)酸，能夠水解七葉苷，分解尿素，與伯杰細菌鑒定手冊所述偽結(jié)核棒狀桿菌特性基本一致(表1)。

表1 生化試驗鑒定結(jié)果

注：“+”代表陽性；“-”代表陰性。

Note: "+" means positive ; "-" means negative.

2.3 協(xié)同溶血試驗

綿羊鮮血平板37℃培養(yǎng) 24 h 后，可見在兩者的T形相交部位顯著溶血現(xiàn)象(圖5)，說明兩者的相互作用可促進紅細胞溶解；這與山羊偽結(jié)核棒狀桿菌協(xié)同溶血特性存在相似性[14]。

1.馬紅球菌；2.分離菌株1.R.equi; 2.The isolate

2.4 分子生物學(xué)鑒定

PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示擴增片段約為800 bp左右，與預(yù)期的816 bp 相一致(圖6)。經(jīng)NCBI Blast分析，測序結(jié)果與GenBank中已收錄的偽結(jié)核棒狀桿菌參考株(登錄號CP013698.1)16srRNA序列同源性達97%以上，通過系統(tǒng)發(fā)育樹分析，分離株與偽結(jié)核棒狀桿菌親緣關(guān)系達97%(圖7)，進一步確定該分離株為偽結(jié)核棒狀桿菌。

2.5 小鼠致病性試驗

Balb/c小鼠人工感染7 d后試驗組接種部位皮下逐漸腫大至綠豆粒樣，繼而化膿破潰，并流出血清樣膿汁(圖8)，逐漸變?yōu)辄S綠色干酪樣黏稠膿汁，之后慢慢結(jié)痂并自行痊愈；對照組小鼠無肉眼可見病變。無菌采集病變部位膿液經(jīng)病原形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)特性和PCR 鑒定與原分離株一致；從而證實原分離菌株對Balb/c小鼠有致病性。

1.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；2.陰性對照；3.分離菌株1.DNA Marker DL 2 000；2.Negative control；3.Isolate

2.6 動物回歸試驗

奶山羊人工感染15 d后試驗組接種部位及附近逐漸出現(xiàn)鴿蛋大小的鼓起膿包，慢慢腫大至乒乓球到拳頭大小，由于瘙癢摩擦等機械作用逐漸化膿破潰，先流出血色膿液，繼而變黏稠，分泌淡黃綠色牙膏狀膿汁，接著破潰處形成瘺管或結(jié)痂慢慢愈合[16]；但由于應(yīng)激等因素，一段時間又在原處或周圍出現(xiàn)新發(fā)膿腫，如此反復(fù)遷延直至數(shù)月(圖9)[17]。未接菌對照無肉眼可見病變。由此證明該分離株可使奶山羊發(fā)病，產(chǎn)生相應(yīng)臨床癥狀和病理變化，對其有很強致病性。無菌采集膿液分離鑒定，結(jié)果與原分離菌株一致。依據(jù)科赫三原則，再次證實該分離菌株確為致病性偽結(jié)核棒狀桿菌。

2.7 藥敏試驗結(jié)果

藥敏試驗結(jié)果依照美國CLSI標(biāo)準(zhǔn)進行判定，結(jié)果顯示該分離株對環(huán)丙沙星、紅霉素、克拉霉素、強力霉素、四環(huán)素、頭孢唑啉、新霉素、氧氟沙星等多種抗生素敏感，對復(fù)方新諾明具有耐藥性(表2)[17]。

圖7 分離菌株16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

圖8 Balb/c小鼠致病性試驗

圖9 動物回歸試驗

表2 分離菌株藥敏試驗結(jié)果

注： “S”代表敏感；“R”代表耐藥。

Note："S" means sensitive；"R" means resistance.

3 討論

山羊偽結(jié)核棒狀桿菌是引起多種動物與人感染的一種人獸共患傳染病病原，多侵害皮下及淋巴結(jié)，形成局灶性膿腫，導(dǎo)致羊干酪性淋巴結(jié)炎[18-19]。該病存在于世界各地養(yǎng)的羊地區(qū)均，我國養(yǎng)羊大省內(nèi)蒙古、陜西、甘肅、新疆、云南、貴州等地都有該病報道。由于該病致死率不高，常常未能引起廣大養(yǎng)殖戶高度重視[7,20]。很多養(yǎng)殖場發(fā)病時，一般都不做任何處理等待其自行痊愈，嚴重時多用抗生素治療或是外科手術(shù)排膿處理，但往往治療效果不佳；破潰的膿汁易將病原擴散給周圍環(huán)境，導(dǎo)致本地區(qū)年年發(fā)病，繼而使該病的檢出率和發(fā)病率呈上升趨勢，嚴重影響?zhàn)B殖戶的經(jīng)濟效益；與此同時該病對人存在致病性，對食品公共衛(wèi)生安全生產(chǎn)帶來潛在的危害，因此對其防治不容忽視[21]。本研究根據(jù)分離菌形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化特性與《伯杰細菌鑒定手冊》描述的偽結(jié)核棒狀桿菌特征基本一致特性、協(xié)同溶血現(xiàn)象、分子生物學(xué)鑒定以及致病性，可確定該分離菌為偽結(jié)核棒狀桿菌。

研究人員曾先后研制偽結(jié)核棒狀桿菌菌苗，進行CLA 的免疫試驗，并且獲得了一定的效果，但仍不夠理想。究其原因主要是該病與結(jié)核病相似，難以產(chǎn)生有效免疫保護，需要細胞免疫和體液免疫協(xié)同發(fā)揮免疫效應(yīng)。由于臨床藥物防治羊偽結(jié)核棒狀桿菌不理想，目前也無有效防治該病的疫苗。因此，亟需制定出防治該病的有效方法。本研究將分離菌株接種Balb/c小鼠后與患病羊特性相一致的；因此，今后試驗中可應(yīng)用Balb/c小鼠作為動物模型，為研究該病提供一種更為經(jīng)濟、有效的手段。與此同時，我們將此分離株人工感染關(guān)中奶山羊進行動物回歸試驗證實其具有較強的致病性。后續(xù)試驗中，我們將此毒株為試驗菌株，研究偽結(jié)核棒狀桿菌的毒力基因及其作用機制，深入研究該病的發(fā)病機理、免疫機制、防治手段，并擬用物理、化學(xué)和分子生物學(xué)方法使其毒力致弱[9,22]，以期激發(fā)機體產(chǎn)生針對該菌的體液和細胞保護性免疫反應(yīng)而又不會致機體發(fā)病，達到防治該病[23]。

基于當(dāng)前該病的研究現(xiàn)狀，應(yīng)采取綜合性的預(yù)防措施以防治該病[2-3,7,16,20]。首先，嚴格禁止從有偽結(jié)核棒狀桿菌存在的羊群引種，新引進羊經(jīng)隔離飼養(yǎng)確定無病原體檢出時方可合群[24]；其次，一旦發(fā)現(xiàn)疑似病羊隔離飼養(yǎng)并及時治療發(fā)病羊，采取嚴格的消毒措施，妥善處理病羊排出物，避免病原體擴散[3]。若效果不佳應(yīng)及時淘汰病羊以凈化羊群[18]。同時，鼠類是偽結(jié)核棒狀桿菌的保存宿主，應(yīng)加強養(yǎng)殖場周邊的滅鼠工作。最后，應(yīng)做好該病的實時動態(tài)監(jiān)測，以防其暴發(fā)?？傊?，早預(yù)防、早發(fā)現(xiàn)、早治療、早淘汰，才能有效防止該病發(fā)生，以降低養(yǎng)殖戶們的經(jīng)濟損耗。

[1] Droppa-Almeida D,Vivas W L P,Silva K K O,et al.Recombinant CP40 fromCorynebacteriumpseudotuberculosisconfers protection in mice after challenge with a virulent strain[J].Vaccine,2016,34(8):1091-1096.

[2] 朱志雄，梁文娟.淺談山羊偽結(jié)核病的防治[J].廣西畜牧獸醫(yī),2015(01):32-46.

[3] 劉國財，潘君香，李曉杰，等.羊偽結(jié)核病的防治[J].獸醫(yī)導(dǎo)刊,2015(23):88-90.

[4] Araujo C L,Dias L M,Veras A A,et al.Whole-genome sequence ofCorynebacteriumpseudotuberculosis262 biovarequiisolated from cow milk[J].Genome Announc,2016,4(2):5718-5719.

[5] Abebe D,Sisay Tessema T.Determination ofCorynebacteriumpseudotuberculosisprevalence and antimicrobial susceptibility pattern of isolates from lymph nodes of sheep and goats at an organic export abattoir,Modjo,Ethiopia[J].Let Appl Microbiol,2015,61(5):469-476.

[6] Alves J T,Veras A A,Cavalcante A L,et al.Complete genome sequence ofCorynebacteriumpseudotuberculosisstrain PA01,isolated from sheep in Para,Brazil[J].Genome Announc,2016,4(2):7025-7026.

[7] 廖 雄，文正常，王 璇，等.山羊偽結(jié)核病的診斷與防治[J].中國畜禽種業(yè),2013(8):105-106.

[8] Latif N A,Abdullah F F,Othman A M,et al.Isolation and detection ofCorynebacteriumpseudotuberculosisin the reproductive organs and associated lymph nodes of non-pregnant does experimentally inoculated through intradermal route in chronic form[J].Vet World,2015,8(7):924-927.

[9] Almeida S,Tiwari S,Mariano D,et al.The genome anatomy ofCorynebacteriumpseudotuberculosisVD57 a highly virulent strain causing caseous lymphadenitis[J].Standards Genomic Sci,2016,11(1).

[10] 曾 澤，韋雷飛，黃秀君，等.一起山羊偽結(jié)核棒狀桿菌感染的診斷[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2014(3):131-133.

[11] 張夢思，李和賢，周作勇.四川達州地區(qū)山羊偽結(jié)核棒狀桿菌病的診斷及藥敏試驗[J].中國獸醫(yī)雜志,2015,51(12):54-56.

[12] 李文楊，劉 遠，張曉佩，等.福清山羊偽結(jié)核棒狀桿菌病的診治[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘,2014(11):102-103.

[13] 藍顯利，閉炳芬，陶 立，等.馬山縣黑山羊偽結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查與診治[J].廣西畜牧獸醫(yī),2015(2):82-84.

[14] Syame S M,Hakim A S,Hedia R H,et al.Characterization of virulence genes present inCorynebacteriumpseudotuberculosisisolated from buffaloes[J].Global Vet,2013,10(5):585-591.

[15] 蔡俊波，王愛玲，李海敏，等.陜南白山羊偽結(jié)核棒狀桿菌分離鑒定及滅活鋁膠疫苗研制[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2016(7):49-52.

[16] 張 勝.山羊偽結(jié)核棒狀桿菌病的診斷與治療[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘,2015(12):164.

[17] 李文楊，劉 遠，張曉佩，等.山羊偽結(jié)核棒狀桿菌的分離鑒定[J].中國草食動物科學(xué),2014,34(5):49-51.

[18] 馬正忠，毛航平.綿羊干酪性淋巴結(jié)炎的發(fā)生與防治[J].現(xiàn)代畜牧科技,2015(9):141.

[19] Jeber Z K H,Mohdjin Z,Jesse F F,et al.Influence ofCorynebacteriumpseudotuberculosisinfection on level of acute phase proteins in goats[J].BMC Vet Res,2016,12(1):1130-1138.

[20] 宋先利.山羊偽結(jié)核病的診治要點[J].中國畜牧獸醫(yī)文摘,2013(6):143-144.

[21] 劉永霞.探析羊偽結(jié)核病的防治[J].中國畜禽種業(yè),2015,11(9):109.

[22] Mariano D C B,Sousa T D J,Pereira F L,et al.Whole-genome optical mapping reveals a mis-assembly between two rRNA operons ofCorynebacteriumpseudotuberculosisstrain 1002[J].BMC Genomics,2016,17(1):5585-5591.

[23] Jorge K T O S,Santos T M,Tartaglia N R,et al.Putative virulence factors ofCorynebacteriumpseudotuberculosisFRC41:vaccine potential and protein expression[J].BMC Microbial Cell Factories,2016.doi: 10.1186/1471-2164-11-728.

[24] 侯萬天，劉界強.羊偽結(jié)核病的防治[J].畜牧與飼料科學(xué),2014,35(9):116-117.

Isolation and Identification ofCorynebacteriumpseudotuberculosisfrom Goats

ZHU Wei-ying,HOU Yin-hang,HUO Ning-ning,SANG Feng-feng,ZHANG Hong-jie,GAO Yang, LI Yan-yan,WANG Yi ,CHEN De-kun

(CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,China)

In order to search for the pathogenic bacteria of the abscess from a caprine farm in Shaanxi province,abscess from the infected goats was obtained sterilely for routine bacterial isolation and identification.The pathogen was identified asCorynebacteriumpseudotuberculosisbased on its morphology,culture characteristics,biochemical characteristics and synergistic hemolytic test.16S rRNA gene PCR results and sequence alignments indicated that 16S rRNA gene from the isolate shared 97% identity with theCorynebacteriumpseudotuberculosisin GenBank.Animal pathogenicity experiment in Balb/c mice and goats confirmed that the isolate was strongly pathogenic.The result of antimicrobial susceptibility test indicated that the strain was highly sensitive to erythromycin,ciprofloxacin,clarithromycin,doxycycline,tetracycline,cefazolin,neomycin and ofloxacin,but resistant to sulfamethoxazole.The results could provide a certain basis for prevention and treatment of the disease in the farm.

goat;Corynebacteriumpseudotuberculosis; isolation; identification

2016-09-14

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目(K3320215115)。

朱偉英(1990-)，女，陜西寶雞人，碩士研究生，主要從事分子病原學(xué)與免疫學(xué)研究。*通訊作者

S858.27

B

1007-5038(2017)05-0127-06