王 爽，何生虎，孫 鵬，郭亞男，曹思婷，張 鑫

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021)

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黃連顆粒劑與水煎劑的主要成分和抑菌效果對(duì)比研究

王 爽，何生虎*，孫 鵬，郭亞男，曹思婷，張 鑫

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏銀川 750021)

為了對(duì)比黃連顆粒劑與水煎劑主要成分和抑菌效果，采用高效液相色譜法(HPLC)和薄層色譜法(TLC)對(duì)黃連對(duì)照藥材、黃連飲片水煎劑與黃連顆粒劑中鹽酸小檗堿等主要成分進(jìn)行含量測(cè)定并比較，并進(jìn)行了體外抑菌試驗(yàn)比較。結(jié)果表明，黃連顆粒劑與水煎劑所含有效成分基本一致，特征圖譜在相同時(shí)間出現(xiàn)相似的峰，屬于鹽酸小檗堿特征峰；黃連煎劑和黃連顆粒劑的抑菌圈大小相似。說(shuō)明在臨床治療中黃連顆粒劑可以代替黃連飲片應(yīng)用。

黃連顆粒劑；鹽酸小檗堿；黃連水煎劑；高效液相色譜法；薄層色譜法

黃連(味連RhizomaCoptischinensisFranch)為常用中藥,具有清熱燥濕、瀉火解毒之功效[1]，其主要活性成分為原小檗堿型生物堿。黃連的藥用方法自古至今多為生用，亦有根據(jù)中醫(yī)臨床辨證用藥的需要，將其炮制后入藥的記載。其中，生黃連苦寒之性偏勝，善清心火；經(jīng)反制即以熱制寒，藥性偏溫；經(jīng)從制即寒者益寒，可去肝膽之火[2]。為探討黃連顆粒劑和黃連飲片之間的區(qū)別，從薄層色譜(TLC)、高效液相色譜(HPLC)和體外抑菌試驗(yàn)等進(jìn)行研究，旨在為黃連顆粒劑的臨床使用提供研究基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥物 黃連對(duì)照藥材(三角葉黃連)(批號(hào)：120913-201310)、鹽酸小檗堿對(duì)照品(批號(hào)：110713-201212)，中國(guó)食品藥品檢定研究院；黃連顆粒劑(批號(hào)：6031892，0.5 g包裝相當(dāng)于飲片3 g)，廣東一方制藥有限公司；黃連飲片(批號(hào)：150501)，毫州金勺堂中藥飲片有限公司。

1.1.2 主要試劑 乙醇，甲醇，環(huán)己烷，乙酸乙酯，異丙醇，三乙胺，濃氨水，乙腈，磷酸二氫鉀，十二烷基硫酸鈉，鹽酸等。

1.1.3 菌種與培養(yǎng)基 菌種：金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門(mén)菌和鏈球菌，均由寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存。

培養(yǎng)基：MH瓊脂(批號(hào)：HB6231)，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 儀器、耗材與軟件 1200高效液相色譜儀，透明短螺紋廣口進(jìn)樣瓶(容量：2 mL)，美國(guó)Agilent公司；KQ-300VDB型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；BS210型電子天平，深圳市深美儀器有限公司；CAMAG薄層成像系統(tǒng)，瑞士卡瑪公司；硅膠G(100 mm×200 mm，批號(hào)：112926-00-8)，青島海洋化工特種硅膠有限公司；毛細(xì)管(4 μL)，北京先驅(qū)威鋒技術(shù)開(kāi)發(fā)公司；Cat#65-1001涂布器，BIOLGIX Cell Spreader ；中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2008版，中國(guó)軟件與技術(shù)服務(wù)股份有限公司研發(fā)。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

1.2.1.1 水提法 取50 g黃連飲片，粉碎至40目，將粉碎后的黃連放入藥材重量10倍量的水中煎煮1.5 h，然后將所有提取溶液混合之后4 000 r/min的條件下離心6 min，取上清液?jiǎn)螌訛V紙真空抽濾，抽濾后的液體留下備用，將離心后剩下的藥渣再次煎煮，第2次、第3次時(shí)間縮短為1 h，過(guò)程與第1次相同，最后將3次濾過(guò)的藥液合并，提取液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，最后制成1∶1的中藥流浸膏[3]，所得流浸膏每1 mL相當(dāng)于1 g原藥材，放入4℃冰箱保存。

1.2.1.2 顆粒劑的制備 取黃連顆粒劑1包(0.5 g包裝)，溶于3 mL超純水中，即得相對(duì)于黃連飲片濃度1 g/mL的溶液。

1.2.2 TLC法

1.2.2.1 供試品溶液的制備 取黃連飲片水煎劑和黃連顆粒劑0.25 g，加甲醇25 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 取黃連對(duì)照藥材0.25 g，同供試品溶液的制備方法制成對(duì)照藥材溶液。取小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

1.2.2.3 TLC檢查 吸取已制備的黃連顆粒劑供試品溶液、對(duì)照藥材溶液和小檗堿對(duì)照品溶液各1 μL，分別點(diǎn)于同一高效硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺(3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1)為展開(kāi)劑，置用濃氨試液預(yù)飽和20 min的展開(kāi)缸內(nèi)，展開(kāi)，取出，晾干，置365 nm紫外光燈下檢視。

1.2.3 HPLC法

1.2.3.1 色譜條件 按高效液相色譜法[4]，色譜柱：Agilent Extend-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫：35℃，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液(50∶50)(每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH4.0)為流動(dòng)相，流速：1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：345 nm，進(jìn)樣量：10 μL。

1.2.3.2 供試品溶液的制備 取黃連飲片水煎劑和黃連顆粒劑粉末0.2 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸(100∶1)的混合液50 mL，密塞后稱定重量，超聲(250 W，40 kHz)處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量。搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.2.3.3 對(duì)照藥材溶液的制備 取黃連對(duì)照藥材1 g，同1.2.3.2中的方法制成對(duì)照藥材溶液。

1.2.3.4 對(duì)照品溶液的制備 取鹽酸小檗堿對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含90.5 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。

1.2.3.5 方法學(xué)考察 ①標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：精密量取適量的小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品溶液置于容量瓶中，用甲醇配成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，使?jié)舛确謩e為0.001、0.010、0.020、0.050、0.100、1.000 mg/mL，按1.2.3.1項(xiàng)色譜條件分別進(jìn)樣10 μL測(cè)定。②穩(wěn)定性考察：在避光條件下，精密吸取黃連顆粒劑、煎劑供試品溶液各6份，進(jìn)樣量10 μL，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣。③精密度考察：精密吸取小檗堿對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)峰面積。④重復(fù)性考察：精密吸取黃連顆粒劑、水煎劑，同供試品溶液的制備方法平行制備6份供試品溶液，按1.2.3.1色譜條件分別進(jìn)樣檢測(cè)分析。

1.2.3.6 HPLC特征圖譜 同上法制備黃連顆粒劑、水煎劑和對(duì)照藥材溶液，按1.2.3.1色譜條件測(cè)定特征圖譜。

1.2.3.7 小檗堿含量測(cè)定 同上法制備黃連顆粒劑、水煎劑和對(duì)照藥材各3份，按1.2.3.1色譜條件測(cè)定。

1.2.3.8 指紋圖譜相似度匹配 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2008版》進(jìn)行相似度檢測(cè)。打開(kāi)軟件，將黃連顆粒劑、水煎劑和對(duì)照藥材溶液HPLC特征圖譜導(dǎo)入其中，把對(duì)照藥材溶液HPLC特征圖譜設(shè)定為參照?qǐng)D譜后，與黃連顆粒劑、水煎劑HPLC特征圖譜進(jìn)行自動(dòng)匹配，利用相似度計(jì)算功能對(duì)顆粒劑和水煎劑進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。

1.2.4 體外抑菌試驗(yàn)

1.2.4.1 菌液制備 將菌種接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)24 h后，采用平板傾注法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)并將菌液濃度稀釋為105CFU/mL的含菌量。

1.2.4.2 MH瓊脂培養(yǎng)基制備 將培養(yǎng)基裝在三角瓶中，121℃高壓滅菌15 min。無(wú)菌條件下，溫度控制在45℃時(shí)倒入平皿中。鏈球菌使用加50 mL/L綿羊血的MH瓊脂。

1.2.4.3 黃連顆粒劑及煎劑體外抑菌試驗(yàn) 取稀釋好的菌液100 μL，用涂布器均勻涂在MH瓊脂板上，在室溫下干燥3 min～5 min。采用牛津杯法，進(jìn)行抑菌試驗(yàn)[5]。將培養(yǎng)基平均分為5個(gè)區(qū)域，用無(wú)菌鑷子將無(wú)菌牛津杯放在固定位置，并輕輕加壓，使不銹鋼小管和培養(yǎng)基表面接觸時(shí)不產(chǎn)生空隙。最后在牛津杯中加入100 μL(1 g/mL)藥液，將培養(yǎng)皿小心移入培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌環(huán)直徑。設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)組，并設(shè)陽(yáng)性、空白對(duì)照。

1.2.4.4 結(jié)果判定 抑菌效果判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌直徑d≥20 mm為極敏，20 mm>d≥15 mm高敏；15 mm>d≥10 mm為中敏，10 mm>d>8 mm為低敏，d≤8 mm無(wú)抑菌效果。

2 結(jié)果

2.1 TLC法

黃連顆粒劑在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯4個(gè)以上相同顏色的熒光斑點(diǎn)，對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)(圖1)。

2.2 HPLC法

2.2.1 方法學(xué)考察

2.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以標(biāo)準(zhǔn)品溶液的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(y)為縱坐標(biāo)，制備小檗堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=2.056×105x+16.63，r=0.999 8(n=6)。結(jié)果表明，小檗堿的質(zhì)量濃度在0.001 mg/mL～1.000 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系(保留時(shí)間)。

1.黃連顆粒劑; 2.黃連對(duì)照藥材; 3.小檗堿

2.2.1.2 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h時(shí)進(jìn)樣10 μL。小檗堿的峰面積RSD(n=6)均<0.15%，表明供試品溶液中小檗堿在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.1.3 精密度考察 精度吸取對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次小檗堿的峰面積RSD(n=6)為0.95%，表明本方法精密度良好。

2.2.1.4 重復(fù)性考察 取同一批號(hào)樣品，按供試品溶液制備方法制備6份，分別進(jìn)樣測(cè)定，小檗堿的峰面積RSD(n=6)均<0.18%，說(shuō)明本方法重復(fù)性良好。

2.2.2 HPLC特征圖譜

S1.黃連顆粒劑HPLC總離子流圖; S2.黃連煎劑HPLC總離子流圖; S3.黃連對(duì)照藥材HPLC總離子流圖

2.2.3 鹽酸小檗堿含量 由表1可知：黃連顆粒劑和煎劑與鹽酸小檗堿對(duì)照藥材中鹽酸小檗堿的平均值含量差距較大，其中顆粒劑的鹽酸小檗堿含量與煎劑差不多。顆粒劑中的鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)差最小，說(shuō)明顆粒劑這組數(shù)據(jù)的差異性不顯著，其次是黃連水煎劑，數(shù)據(jù)差異性最顯著的是對(duì)照藥材。

表1 鹽酸小檗堿含量

2.2.4 相似度比較 黃連顆粒劑、黃連煎劑與對(duì)照藥材的相似度分別為 99.4%和99.5%，相似性較好。

2.2.5 體外抑菌結(jié)果 觀察抑菌圈大小并記錄結(jié)果(表2)。由表2可知，黃連顆粒劑、黃連水煎劑和黃連對(duì)照藥材對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抑菌效果是極敏，黃連顆粒劑和黃連水煎劑對(duì)沙門(mén)菌、鏈球菌的抑菌效果是中敏，黃連對(duì)照藥材對(duì)沙門(mén)菌的抑菌效果是高敏，對(duì)鏈球菌的抑菌效果是中敏。

3 討論

從TLC的結(jié)果中可以看出黃連顆粒劑和黃連飲片擁有幾個(gè)相同的斑點(diǎn)，而且與鹽酸小檗堿對(duì)照品有相同的光斑，說(shuō)明黃連顆粒劑和黃連飲片中所含物質(zhì)大部分相同，且均含有鹽酸小檗堿。對(duì)主要有效物質(zhì)鹽酸小檗堿進(jìn)行了比較，3種黃連待測(cè)品和鹽酸小檗堿對(duì)照品的特征圖譜都在15 min～16 min之間出現(xiàn)了明顯的峰，對(duì)鹽酸小檗堿的含量進(jìn)行計(jì)算，說(shuō)明黃連顆粒劑和黃連飲片中鹽酸小檗堿所占比例也相差不大，雖然與黃連標(biāo)準(zhǔn)品有一些差距，可能是由于黃連標(biāo)志品純度比較高。通過(guò)相似度軟件的比較，可以看出顆粒劑與黃連飲片煎劑的相似度也很高。

圖3 小檗堿對(duì)照品HPLC總離子流圖

表2 黃連顆粒劑和煎劑體外抑菌結(jié)果

常見(jiàn)細(xì)菌對(duì)黃連顆粒劑、黃連飲片和黃連對(duì)照藥材體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，黃連顆粒劑和黃連飲片的抑菌圈大小一致，略差于黃連對(duì)照品。本試驗(yàn)中黃連飲片采用了簡(jiǎn)單的水煎法提取，可能對(duì)有效成分造成一些損失，煎劑提取時(shí)過(guò)濾次數(shù)相對(duì)較少，“雜質(zhì)”相對(duì)較多，而中藥的抗菌作用除與所含特異性成分有關(guān)外，“雜質(zhì)”等非特異性成分還往往影響病原微生物的生長(zhǎng)[6]。

總之，黃連顆粒劑和黃連飲片煎劑化學(xué)組成接近，主要成分鹽酸小檗堿的含量也相似，均可用于臨床，而且中藥顆粒劑有方便攜帶，便于儲(chǔ)存和服用，中藥顆粒劑的質(zhì)量也較穩(wěn)定[7]，可應(yīng)用于動(dòng)物臨床疾病的治療。

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Comparison of Main Components and Antibacterial Effects ofRhizomaCoptischinensisand Decoction

WANG Shuang,HE Sheng-hu,SUN Peng,GUO Ya-nan,CAO Si-ting,ZHANG Xin

(CollegeofAgriculture,NingxiaUniversity,Yinchuan,Ningxia,750021,China)

In order to compare the main components and bacteriostatic effects of Rhizoma Coptidis granules and decoction, the HPLC and TLC method were used to measure and compare theCoptischinensisgranules and elixation, the main components of berberine hydrochloridemCoptis, decoction ofCoptisand other granules were determined and compared, antibacterial effectsinvitrowere also compared. The results showed thatRhizomaCoptidisgranules and decoction of effective ingredients contained in the basic agreement, the characteristic spectrum of similar peak at the same time, berberine hydrochloride belongs to the characteristic peak; similar inhibitory circle ofCoptisdecoction andRhizomaCoptidisgranules. The results showed thatCoptischinensisgranules could be used instead of coptis chinensis elixation in clinical treatment.

RhizomaCoptidisgranule;berberine hydrochloride;RhizomaCoptidisdecoction;HPLC;TLC

2016-09-29

王 爽(1993- )，女，寧夏銀川人，碩士研究生，主要從事獸藥臨床診斷和中獸藥醫(yī)藥研究。*通訊作者

S853.7

A

1007-5038(2017)05-0069-05