呂運(yùn)霞, 李楠，王亞迪，王雪靜，楊金鳳，

胡同樂,王樹桐，王亞南, 曹克強(qiáng)

利用內(nèi)標(biāo)為基礎(chǔ)的蘋果銹果類病毒RT-PCR檢測技術(shù)

呂運(yùn)霞, 李楠，王亞迪，王雪靜，楊金鳳，

胡同樂,王樹桐，王亞南, 曹克強(qiáng)

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，河北 保定071001)

為開發(fā)準(zhǔn)確、靈敏的蘋果銹果類病毒(Apple scar skin viroid，ASSVd)RT-PCR檢測方法，以田間染病蘋果組織為試材，提取高質(zhì)量總RNA為模板，在常規(guī)RT-PCR檢測體系中引入蘋果線粒體nad5基因作為內(nèi)標(biāo)基因，對RT-PCR反應(yīng)體系和程序進(jìn)行優(yōu)化，并測定其靈敏度和穩(wěn)定性，最后利用優(yōu)化的檢測體系確定蘋果果實著色期最佳檢測部位。結(jié)果表明：以RNA提取改良法提取總RNA為模板合成cDNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，優(yōu)化后的PCR體系(25 μL)中cDNA模板2 μL、ASSVd(20 pmol/μL)正反向引物各1.0 μL，nad5(20 pmol/μL)正反向引物各0.1 μL；擴(kuò)增程序中退火溫度為60.9℃，循環(huán)次數(shù)為35次；檢測靈敏度為37.5 ng新鮮樣本；果實著色期，染病植株的幼嫩葉片、1 a生枝的韌皮部和木質(zhì)部、果實及部分種子樣本均能檢測到病毒，最佳檢測部位為幼嫩韌皮部。研究結(jié)果可以為ASSVd高效、快速、準(zhǔn)確的檢測提供可靠方法，并為田間病害診斷及無毒苗木繁育提供依據(jù)和借鑒。

蘋果銹果類病毒；RT-PCR；nad5；分布部位

蘋果銹果病又稱“花臉病”，是蘋果(MaluspumilaMill.)生產(chǎn)中毀滅性的類病毒病害之一[1]。蘋果銹果病的病原為蘋果銹果類病毒(Apple skin scar viroid，ASSVd)屬于馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)紡錘塊莖類病毒科馬鈴薯紡錘塊莖類病毒屬(Pospiviroid)，一般具有330個左右的核苷酸。近年來，伴隨老果園高接換優(yōu)，蘋果銹果病發(fā)病率逐年升高。同時，一部分新發(fā)展蘋果園病情也相當(dāng)嚴(yán)重[2]。

由于類病毒是裸露 RNA 分子, 沒有蛋白質(zhì)外殼，所以蘋果銹果病毒不能用血清學(xué)方法檢測，而指示植物檢測法周期長，并且癥狀表現(xiàn)受環(huán)境條件影響較大，準(zhǔn)確度低[3]。近年來，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)的發(fā)明和應(yīng)用為果樹病毒的檢測提供了有力的依據(jù)[4]。Shamloul利用RT-PCR技術(shù)在梨樹(PyruscommunisL. ,P.amygdaliformisL.)上發(fā)現(xiàn)了ASSVd的新變種[5]；趙英和牛建新利用RT-PCR技術(shù)首次在我國杏樹(ArmeniacavulgarisLam.)、桃樹[Amygdaluspersica(L.)Batsch.]、梨樹上檢測到了ASSVd[6-8]；Yazarlou利用RT-PCR技術(shù)首次報道了伊朗蘋果樹和梨樹上ASSVd的分子變異[9]；郝璐等利用RT-PCR技術(shù)首次對侵染小蘋果的ASSVd進(jìn)行了分離鑒定[10]。郭超等利用RT-PCR技術(shù)明確了蘋果銹果類病毒在八棱海棠(MalusrobustaRehd.)種子中的分布及氫氧化鈉脫毒效果分析[11]。但尚未見利用內(nèi)標(biāo)為基礎(chǔ)的ASSVd RT-PCR檢測技術(shù)的相關(guān)報道。為此，以感染ASSVd的田間蘋果樹的幼嫩組織為試材，在常規(guī)RT-PCR檢測體系中引入蘋果線粒體nad5作為內(nèi)標(biāo)基因，對其共擴(kuò)增體系及程序進(jìn)行優(yōu)化，以期避免假陰性檢測結(jié)果的發(fā)生，并對優(yōu)化體系田間樣本的檢測靈敏度和穩(wěn)定性進(jìn)行測定；同時，采用優(yōu)化好的體系，對果實著色期幼嫩葉片、韌皮部、木質(zhì)部、果肉和種子進(jìn)行檢測，確定蘋果果實著色期ASSVd最佳檢測部位，以便為ASSVd的有效檢測提供技術(shù)手段。

1 材料和方法

1.1 材料

于2014年5—7月在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)蘋果實驗園，采集顯癥蘋果幼嫩枝條，作為RT-PCR體系建立及優(yōu)化的材料；于2014年11月在保定市曲陽縣苗圃，采集蘋果幼嫩枝條，作為驗證檢測體系可靠性的材料；于2014年9—10月在保定市順平縣南神南，采集顯癥蘋果樹幼嫩組織，作為確定果實著色期最佳檢測部位的材料。

1.2 主要試劑

植物總RNA提取試劑購自于天根生化科技(北京)有限公司；M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、RNA稀釋液、DNA Marker、dNTPs、大腸桿菌DH5α為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；DEPC、瓊脂糖購自于生工生物工程(上海)股份有限公司；2×Es Taq MasterMix購自于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司； 其他化學(xué)試劑購自于保定市萬科實驗儀器貿(mào)易有限公司。

1.3 引物

參閱GenBank中已經(jīng)發(fā)表的ASSVd序列，選擇保守性區(qū)域自行設(shè)計ASSVd特異性引物， 所用軟件為Vector NTI version 10.3(Informax，F(xiàn)rederick，MD，USA)。蘋果內(nèi)源基因參照Menzel的報道[12]，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列信息如表1所示。

表1 ASSVd RT-PCR檢測引物Table 1 Primers used for RT-PCR detection of ASSVd

注：a序列位置參考序列的NCBI登錄號分別為：ASSVd(X17696)，nad5(D37958)。

1.4 蘋果組織總RNA的提取

采用RNA提取改良法[13]，取100 mg植物組織，在液氮中充分研磨，加0.5 mL RNAplant 提取液進(jìn)行提取，最后加入20.00 μL DEPC水充分溶解RNA沉淀，-70.0℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 內(nèi)標(biāo)nad5基因與ASSVd共擴(kuò)增RT-PCR檢測體系的優(yōu)化

以總RNA為模板，按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶說明書合成cDNA第1鏈，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。自行設(shè)計PCR體系及程序如下：PCR反應(yīng)體系為25.00 μL，包括2×Es Taq MasterMix 12.50 μL、ASSVd(20 pmol/μL)和nad5(20 pmol/μL)正反向引物各0.50 μL、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3.00 μL，最后用ddH2O補(bǔ)至25.00 μL。PCR反應(yīng)程序為94.0℃預(yù)變性2 min；94.0℃變性1 min，59.0℃退火1 min，72.0℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72.0℃延伸10 min，4.0℃保存。

以上述反應(yīng)體系為基礎(chǔ)，體系的優(yōu)化分別按照ASSVd(20 pmol/μL)和nad5(20 pmol/μL)引物比例(1∶1，1∶2，1∶5，1∶10，1∶15，1∶20)、cDNA模板用量(4.00 μL，3.00 μL，2.00 μL，1.00 μL，0.50 μL，0.25 μL)、ASSVd(20 pmol/μL)用量(4.00 μL，3.00 μL，2.00 μL，1.00 μL，0.50 μL，0.25 μL)進(jìn)行逐一優(yōu)化；程序的優(yōu)化包括退火溫度(70.0℃，68.9℃，67.1℃，64.4℃，60.9℃，58.5℃，56.4℃，55.0℃)和循環(huán)次數(shù)(25，30，35，40，45)的優(yōu)化。

1.6 內(nèi)標(biāo)nad5基因與ASSVd共擴(kuò)增RT-PCR檢測體系靈敏度的測定

將染病植株的總RNA用RNA稀釋液進(jìn)行系列稀釋，稀釋比例分別為1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000、1∶100 000、1∶1 000 000、1∶10 000 000，然后進(jìn)行RT-PCR檢測，根據(jù)擴(kuò)增效果，確定優(yōu)化體系的檢測靈敏度。

1.7 內(nèi)標(biāo)nad5基因與ASSVd共擴(kuò)增RT-PCR檢測體系可靠性的驗證

利用優(yōu)化的RT-PCR檢測體系，對曲陽果園124株田間樣品進(jìn)行檢測，采用常規(guī)RT-PCR體系進(jìn)行驗證[2]。比較2種方法的檢測結(jié)果，驗證本研究內(nèi)標(biāo)nad5基因與ASSVd共擴(kuò)增RT-PCR檢測體系檢測的準(zhǔn)確性。

1.8 序列測定與電泳分析

PCR產(chǎn)物的電泳分析： 1×TAE電泳緩沖液，1.5%瓊脂糖凝膠，上樣量8.00 μL，100 V穩(wěn)壓電泳40 min，EB染色后觀察結(jié)果。目的片段的克隆測序：PCR產(chǎn)物切膠回收，純化后與載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，通過藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定陽性克隆[14]，委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序，測序結(jié)果與GenBank中序列進(jìn)行同源性分析，確定序列的準(zhǔn)確性。

1.9 RT-PCR最佳檢測組織的確定

為了明確果實著色期ASSVd在蘋果樹1 a生枝條及果實中的分布情況及最佳檢測部位，對田間處于果實著色期的10株果樹1 a生枝條葉片、韌皮部、木質(zhì)部、果肉和種子進(jìn)行了RNA提取和RT-PCR檢測，觀察擴(kuò)增效果，確定果實著色期帶毒部位及最佳檢測部位。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)標(biāo)nad5基因與ASSVd共擴(kuò)增RT-PCR檢測體系的建立

對染病植株進(jìn)行nad5基因、ASSVd基因單獨擴(kuò)增和共擴(kuò)增，結(jié)果如圖1所示。

圖1 內(nèi)標(biāo)為基礎(chǔ)的ASSVd RT-PCR體系的建立

Fig.1 Establishment of ASSVd RT-PCR system based on internal standard

注：M：DL2 000；1, 2: 染病植株nad5單獨擴(kuò)增；3, 4：染病植株ASSVd單獨擴(kuò)增；5, 6：染病植株nad5和ASSVd共同擴(kuò)增。

由圖1可知，nad5基因單獨擴(kuò)增得到181 bp目的條帶，ASSVd基因單獨擴(kuò)增得到325 bp目的條帶，nad5基因和ASSVd基因共擴(kuò)增同時得到181 bp和325 bp目的條帶，表明nad5和ASSVd共同擴(kuò)增的有效性。

2.2 內(nèi)標(biāo)nad5基因與ASSVd共擴(kuò)增RT-PCR檢測體系的優(yōu)化

以選用的ASSVd和nad5為引物，按照RT-PCR基本體系和程序?qū)σ锱浔?、cDNA模板、引物用量、退火溫度、循環(huán)次數(shù)進(jìn)行逐一優(yōu)化。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后觀察擴(kuò)增效果，確定RT-PCR共擴(kuò)增最佳體系及程序組合。結(jié)果如圖2所示。

圖2 內(nèi)標(biāo)為基礎(chǔ)的ASSVd RT-PCR體系的優(yōu)化Fig.2 Optimization of ASSVd RT-PCR system based on internal control

注：M：DL2 000；A：ASSVd：nad5引物比例，(泳道1—7為1∶1，1∶2，1∶5，1∶10，1∶15，1∶20)；B：cDNA模板(泳道1—6為4.00 μL，3.00 μL，2.00 μL，1.00 μL，0.50 μL，0.25 μL)；C：ASSVd引物用量(泳道1—6為4.00 μL，3.00 μL，2.00 μL，1.00 μL，0.50 μL，0.25 μL)；D：退火溫度(泳道1—8為70.0℃，68.9 ℃，67.1 ℃，64.4℃，60.9 ℃，58.5 ℃，56.4 ℃，55.0℃)；E：不同循環(huán)次數(shù)(泳道1—5為25，30，35，40，45)

由圖2可知，最終確定的體系為25 μL的PCR體系：含cDNA模板2.00 μL、ASSVd(20 pmol/μL)正反向引物各1.00 μL，nad5(20 pmol/μL)正反向引物各0.10 μL，ddH2O 8.30 μL，2×Es Taq MasterMix 12.50 μL；最終優(yōu)化的程序為：94.0℃預(yù)變性2 min；94.0℃變性45 s，60.9℃退火45 s，72.0℃延伸30 s，共35個循環(huán)；最后72.0℃延伸10 min。

2.3 內(nèi)標(biāo)nad5基因與ASSVd共擴(kuò)增RT-PCR檢測體系靈敏度的確定

將染病植株幼嫩韌皮部提取的總RNA用RNA稀釋液進(jìn)行系列稀釋，然后以稀釋后的RNA為模板，進(jìn)行RT-PCR檢測，測定體系的靈敏度，結(jié)果如圖3所示。

圖3 ASSVd RT-PCR靈敏度的測定

Fig.3 Assay of the detection sensitivity of RT-PCR for ASSVd

注：M：DL 2 000；1：未被稀釋的染病植株總RNA提取液；2—8：以RNA稀釋液系列稀釋染病植株總RNA提取液1∶10，1∶100，1∶1 000，

1∶10 000，1∶100 000，1∶1 000 000，1∶10 000 000；9—10：RNA稀釋液。

由圖3可知，作為陰性對照的RNA稀釋液沒有擴(kuò)增出病毒特異性條帶，而以總RNA為模板10 000倍稀釋液仍有325 bp和181 bp左右的條帶出現(xiàn)。經(jīng)過折算，RT-PCR共擴(kuò)增體系的靈敏度達(dá)到能夠檢測37.5 ng新鮮植物組織中的ASSVd。

2.4 內(nèi)標(biāo)nad5基因與ASSVd共擴(kuò)增RT-PCR檢測體系可靠性的驗證

利用內(nèi)標(biāo)nad5基因與ASSVd共擴(kuò)增RT-PCR檢測體系和利用常規(guī)RT-PCR檢測體系對保定市曲陽縣124株樣品進(jìn)行檢測，部分檢測結(jié)果如圖4所示。本研究檢測體系檢測出30株帶毒，參考的常規(guī)檢測體系檢測出28株帶毒，說明本研究檢測體系有效控制了假陰性的發(fā)生,證明了本研究RT-PCR體系對田間樣本檢測的準(zhǔn)確性和可靠性。

圖4 曲陽部分樣品ASSVd RT-PCR檢測結(jié)果

Fig.4 ASSVd RT-PCR detection result of Quyang sample

注： M：DL2 000；1—10：QY-1，QY-2，QY-3，QY-4，QY-5，QY-6，QY-7，QY-8，QY-9，QY-10；11：陽性對照；12：健康植株對照。上為本研究檢測體系，下為參考檢測體系。

2.5 PCR產(chǎn)物的克隆與測序

對RT-PCR特異條帶進(jìn)行回收、克隆和測序，獲得與目的片段大小相符的序列，經(jīng)過序列比對，ASSVd與GenBank中X71599株系親緣關(guān)系最近，相似性為99%；nad5與GenBank中GU585873.1株系親緣關(guān)系最近，相似性為99%，結(jié)果進(jìn)一步驗證了檢測結(jié)果的可靠性。

2.6 果實著色期ASSVd最佳檢測組織部位的確定

對果實著色期田間1 a生枝條不同部位進(jìn)行了RNA提取和RT-PCR檢測，結(jié)果如圖5所示。

圖5 9—10月份蘋果各組織部位ASSVd RT-PCR檢測結(jié)果

Fig.5 Detection of ASSVd in different parts of apple in September and October by RT-PCR

注：M： DL2 000；1：葉片，2：韌皮部，3：木質(zhì)部，4：果實，5：陰性對照 。

由圖5可知，10株果樹1 a生枝條葉片、韌皮部、木質(zhì)部和果實均成功擴(kuò)增出了ASSVd目的條帶，且結(jié)果穩(wěn)定，其中韌皮部條帶亮度最高，為最佳檢測部位。通過對種子帶毒情況檢測發(fā)現(xiàn)，10個樣本中僅7個樣本擴(kuò)增出了目的條帶，不宜作為檢測部位。

3 結(jié)論與討論

試驗利用自行設(shè)計的引物，在常規(guī)RT-PCR檢測體系基礎(chǔ)上引入線粒體nad5基因為內(nèi)標(biāo)，確定適宜的引物濃度組合為ASSVd引物20 pmol/μL，nad5內(nèi)標(biāo)引物2 pmol/μL，采用優(yōu)化后的內(nèi)標(biāo)nad5基因與ASSVd共擴(kuò)增RT-PCR檢測體系進(jìn)行檢測，檢測體系靈敏度達(dá)到10 000×總RNA模板稀釋液，不低于常規(guī)RT-PCR檢測體系靈敏度[16]。測序結(jié)果表明，ASSVd與GenBank中X71599株系親緣關(guān)系最近，相似性為99%；nad5與GenBank中GU585873.1株系親緣關(guān)系最近，相似性為99%。同時，通過對果實著色期不同部位進(jìn)行檢測，最終確定1 a生枝條的韌皮部為蘋果植株ASSVd最佳檢測部位。

曾有多種內(nèi)標(biāo)被報道,但是沒有一種可區(qū)分RNA與DNA模板,因此在RT-PCR前必須完全消除DNA[15]。nad5基因是蘋果線粒體DNA的NADH脫氫酶亞基5基因，利用此基因為RT-PCR的內(nèi)標(biāo)不論是健康樣或帶毒樣，當(dāng)RNA完整且可擴(kuò)增時，nad5均能成功被擴(kuò)增出，且不受DNA存在與否的影響。當(dāng)存在DNA污染、RNA處于抑制狀態(tài)或降解時，nad5則不能被擴(kuò)增出。以nad5為內(nèi)標(biāo)可減少假陰性出現(xiàn)，使檢測結(jié)果更加可靠[15]。

在田間樣本檢測中，不同的檢測部位影響著檢測的準(zhǔn)確性。帶有休眠芽的1 a生枝條枝皮組織可以作為果樹病毒周年檢測的材料[11]，檢測果樹1 a生枝條葉片、韌皮部、木質(zhì)部和果實都能擴(kuò)增出ASSVd的目的條帶，因韌皮部條帶亮度相對較高，從而確定為最佳檢測部位，并且樹皮為檢測材料可以使檢測不受季節(jié)限制。

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(編輯 潘秀華)

Internal reference gene-based RT-PCR assay for the detection of apple scar skin viroid

LV Yunxia，LI Nan，WANG Yadi，WANG Xuejing，YANG Jinfeng，HU Tongle，WANG Shutong，WANG Yanan，CAO Keqiang

(CollegeofPlantProtection,HebeiAgriculturalUniversity,Baoding071001,China)

In order to develop an accurate and sensitive method to detect apple scar skin viroid(ASSVd), a RT-PCR assay based on internal standard was developed. The total RNA with high quality was extracted from diseased apple branch. The primers of ASSVd and apple mitochondria genenad5 were added to the assay and the RT-PCR detection method was optimized. In fruit coloring period, the optimal detection tissue was also determined. The total RNA was extracted by improved RNA-extraction method and cDNA was synthesed. Our results showed that the optimized reaction system contained cDNA template 2 μL, the forward and reverse primers of ASSVd(20 pmol/μL) both for 1.0 μL, and the forward and reverse primer ofnad5(20 pmol/μL) both for 0.1 μL. The PCR annealing temperature was 60.9℃ and the cycle was 35. The sensitivity of the optimized RT-PCR method could reach as less as 37.5 ng fresh sample. The tissues, including young leaves, phloem, xylem, fruit and part of seed could be used to detect ASSVd in fruit coloring period, and the young phloem was the best test tissue in this special period. The method provided a reliable way for efficient, rapid and accurate detection of ASSVd and lay a foundation for disease diagnosis and detoxification seedling breeding.

Apple scar skin viroid; RT-PCR;nad5; distribution sites

1007-4961(2017)01-0051-06

10.13320/j.cnki.hjfor.2017.0010

2016-10-25；

2016-12-23

國家蘋果現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-28)；河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項目“蘋果褪綠葉斑病毒運(yùn)動相關(guān)寄主因子研究”(YQ2014023)；河北省青年拔尖人才計劃。

呂運(yùn)霞(1990-)，女，河北邯鄲人，在讀碩士研究生，研究方向為植物病害流行與綜合防治。 李楠(1994-)，女，河北衡水人，在讀碩士研究生，研究方向為植物病害流行與綜合防治。 呂運(yùn)霞與李楠為同等貢獻(xiàn)作者。

曹克強(qiáng)(1963-)，男，河北容城人，博士，教授，從事植物病害流行與綜合防治研究。

S 432.4

A