劉青 韋芳 許迅

·基礎(chǔ)研究·

LC3在早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜的表達和意義

劉青＊韋芳 許迅

目的 探討微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(MAP1-LC3)在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的表達及其意義。方法 將24只雄性SD大鼠隨機分為3組：正常對照組(C組，n=8)，糖尿病組(D組，n=8)，非諾貝特干預(yù)組(F組，n=8)。利用10 g/L鏈脲佐星(STZ)建立糖尿病大鼠模型。成模后給予藥物干預(yù)，并在第4周末時取出大鼠眼球。將眼球置于中性甲醛固定后作免疫組織化學(xué)檢測，分離視網(wǎng)膜抽提蛋白，采用免疫印跡技術(shù)檢測視網(wǎng)膜組織中LC3蛋白的表達。采用TUNEL法測定4周時大鼠視網(wǎng)膜各層細胞凋亡情況。 結(jié)果 成功構(gòu)建糖尿病大鼠模型。蘇木素-伊紅(HE)染色顯示3組大鼠視網(wǎng)膜各層細胞無明顯改變。3組大鼠視網(wǎng)膜LC3蛋白均有表達，免疫組織化學(xué)和Western印跡法檢測結(jié)果一致。糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中有LC3蛋白的表達,且明顯高于正常對照組。LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值，C組明顯低于D組和F組(P<0.05)，F(xiàn)組高于D組(P<0.05)，說明非諾貝特干預(yù)后，F(xiàn)組LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化表達增加。免疫組織化學(xué)與Western印跡法結(jié)果一致。建模4周，僅D組見極少量細胞質(zhì)呈綠色的凋亡陽性細胞。結(jié)論 糖尿病大鼠視網(wǎng)膜自噬增加，非諾貝特能增強自噬，且未見明顯細胞凋亡。在糖尿病性視網(wǎng)膜病變中，自噬作為保護機制，早于細胞凋亡的發(fā)生。(中國眼耳鼻喉科雜志，2017，17：10-15)

糖尿病性視網(wǎng)膜病變 ；微管相關(guān)蛋白1輕鏈3；自噬；大鼠, Sprague-Dawley

糖尿病已成為一種全球性疾病。我國糖尿病患病率正在逐年增長。國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)預(yù)測，到2035年全球罹患糖尿病患者將增至5.92億人[1]。糖尿病性視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy, DR)是糖尿病最常見且嚴重的致盲性眼病。DR對視覺的威脅日益受到重視。通過復(fù)雜的分子機制，血-視網(wǎng)膜屏障的破壞，神經(jīng)細胞的退行性改變，糖尿病可引起微血管病變，其中包括DR、糖尿病腎臟病變(diabetic nephropathy，DN)及糖尿病神經(jīng)病變。在微血管系統(tǒng)出現(xiàn)病變前，已存在神經(jīng)組織的損傷。其病理特征包括神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)膠質(zhì)細胞活躍及內(nèi)層視網(wǎng)膜變薄[2-4]。臨床實踐也發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者在眼底出現(xiàn)微血管改變之前已有視功能的異常。目前認為，糖尿病引起視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的改變早于糖尿病視網(wǎng)膜微血管病變。因此，早期發(fā)現(xiàn)神經(jīng)細胞的病理改變并及早干預(yù)對于延緩DR的發(fā)展將有重要的臨床意義。

自噬是發(fā)生在真核細胞中由細胞初級溶酶體處理內(nèi)容性底物的重要生理過程，在維持細胞生存更新、物質(zhì)再利用和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中起到重要作用。自噬功能紊亂與糖尿病密切相關(guān)，其在機體維持正常血糖水平過程中發(fā)揮重要作用。饑餓情況下，血糖、游離脂肪酸等營養(yǎng)物質(zhì)水平下降均可誘導(dǎo)自噬激活，從而降解細胞內(nèi)大分子物質(zhì)，為機體提供所需營養(yǎng)素，調(diào)節(jié)血糖于正常范圍內(nèi)。在近年來的糖尿病及DN的相關(guān)研究中，自噬已成為熱點。多項研究結(jié)果提示，自噬在糖尿病微血管病變的發(fā)病過程中起重要作用。此外，自噬與腫瘤、DN和年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)等密切相關(guān)，而這些疾病的發(fā)病機制與DR有相似之處[5-8]。

微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，MAP1-LC3)蛋白是哺乳動物細胞中酵母ATG8基因的同源物，定位于自噬體和自噬體膜表面，參與自噬體形成，現(xiàn)作為自噬體的特異性標(biāo)記蛋白之一[9]。LC3的表達強度與自噬活性密切相關(guān)。但自噬是否存在DR中，目前報道較少。本研究觀察自噬相關(guān)蛋白LC3在正常大鼠、糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的表達情況，為臨床早期防治DR提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與分組 雄性SD大鼠(上海市中科院實驗動物中心)24只，體重140～160 g。所有動物購買后適應(yīng)喂養(yǎng)1周后用于實驗。代謝籠、標(biāo)準飼料喂養(yǎng)，自由進食和飲水，室溫18～22 ℃，相對濕度40%～70%，12 h光照，晝夜循環(huán)。

1.1.2 試劑 鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，Sigma公司)；LC3抗體(CST公司)；非諾貝特膠囊(Abbott公司)；DeadEndTM熒光測定TUNEL系統(tǒng)(Promege公司)。

1.1.3 動物模型的建立 所有動物禁食12 h，實驗前自尾靜脈取血，行血糖測定(羅氏活力型血糖儀，ACCU-CHEK Active)和體重檢測。采用隨機數(shù)字表法將大鼠隨機分為對照組(C組，n=8)，糖尿病組(D組，n=8)和糖尿病非諾貝特灌胃組(F組，n=8)。依據(jù)Hammes等[10]介紹的方法，用STZ誘發(fā)糖尿病。D組、F組大鼠腹腔注射新鮮配制的1%STZ溶液(Sigma公司，美國)，劑量為65 mg/kg，C組大鼠腹腔注射等體積的檸檬酸-枸櫞酸鈉緩沖液(pH=4.5，濃度為0.1 mol/L)。糖尿病大鼠模型確立的標(biāo)準：72 h后大鼠尾靜脈測得的血糖>16.7 mmol/L。成模次日開始至實驗結(jié)束，F(xiàn)組大鼠給予非諾貝特(35 mg/kg)灌胃，C、D組僅給予自來水灌胃。實驗期間，所有動物自由進食，不給予胰島素等降糖治療。不限水喂養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 樣品收集 灌胃后4周，稱各組大鼠體重和測血糖。腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，處死大鼠，取出眼球。摘取每只鼠的雙眼，將左眼球固定于10%甲醛溶液，制作石蠟組織病理學(xué)切片。視網(wǎng)膜組織用蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色和末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測；去除右眼球前節(jié)，在顯微鏡下鈍性分離其視網(wǎng)膜組織，置于液氮下冷凍，-80 ℃儲存，以備進行Western印跡法實驗。

1.2.2 大鼠視網(wǎng)膜病理學(xué)檢測 普通HE染色觀察3組大鼠灌胃后4周時視網(wǎng)膜各層變化。

1.2.3 大鼠視網(wǎng)膜LC3免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化、微波修復(fù)抗原，滴加稀釋的一抗(兔抗大鼠LC3抗體，CST公司)、羊抗兔二抗 ABC復(fù)合物及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑，蘇木素復(fù)染，脫水透明，甘油明膠封片。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為對照。先低倍鏡下觀察著染情況，再在高倍鏡下隨機選取10個視野，采用全自動圖像分析系統(tǒng)(Image-pro plus 6.0)分別計數(shù)其積分光密度(integral optical density，IOD)值，取其平均值進行分析。

1.2.4 大鼠視網(wǎng)膜Western免疫印跡法檢測LC3 用含1%蛋白酶抑制劑的RIPA細胞裂解液提取視網(wǎng)膜組織蛋白，NanoDrop測定；蛋白加樣后行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上；加5%脫脂牛奶在室溫下封閉1 h后，加LC3抗體(1∶1 000)和β-actin 抗體(1∶4 000)孵育，40 ℃過夜；加辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶500)，室溫下孵育2 h，ECL發(fā)光液顯色。

1.2.5 TUNEL 檢測凋亡 石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化后，按照TUNEL試劑盒說明書進行操作。用Triton○RX-100通透細胞；蛋白酶K通透組織切片，熒光素-12-dUTP標(biāo)記DNA斷裂鏈，SSC終止反應(yīng)后洗滌，在封片介質(zhì)中加入4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)核染料進行分析。熒光顯微鏡在藍色背景下DAPI染色，檢測定位凋亡細胞的綠色熒光(熒光素-12-dUTP)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 數(shù)據(jù)處理運用統(tǒng)計分析軟件SPSS 20.0統(tǒng)計軟件包，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準差表示；多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗;2組均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗;P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血糖 各組血糖情況詳見表1。建模3 d時，D、F組較C組血糖升高(t值分別為-13.11及-20.51，P<0.05)，說明建模成功。4周時，D組、F組較C組血糖高(t值分別為-29.41及-35.15，P<0.05)。

表1 實驗起點及終點各組大鼠血糖對比(mmol/L)

2.2 體重 4周時D組大鼠體重比C組明顯減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.61,P<0.05)。F組大鼠體重較C組減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=5.113,P<0.05)。D組和F組大鼠體重相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=1.331，P>0.05)(表2)。

表2 實驗起點及終點各組大鼠體重對比(g)

注：a示D、F組建模4周大鼠體重與建模3 d時相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

2.3 糖尿病大鼠視網(wǎng)膜HE染色 4周時，各組視網(wǎng)膜細胞排列基本整齊，形態(tài)學(xué)上未見明顯異常。各層視網(wǎng)膜厚度無明顯變化(圖1)。

圖1. 糖尿病大鼠視網(wǎng)膜HE染色(×400) 視網(wǎng)膜各層排列規(guī)則，細胞密集，形態(tài)正常。A. C組；B. D組；C. F組

2.4 各組大鼠LC3免疫組織化學(xué)結(jié)果 顯微鏡下觀察，LC3蛋白以細胞質(zhì)染為黃色至棕黃色為陽性細胞。3組大鼠視網(wǎng)膜節(jié)細胞層、內(nèi)核層、外核層均有表達(圖2)。3組 LC3陽性產(chǎn)物IOD值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=12.782，P=0.000)(圖3)。

圖2. 免疫組織化學(xué)檢測(×400) 各組大鼠視網(wǎng)膜LC3Ⅱ的表達情況。 A. C組；B. D組；C. F組

圖3. 免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示各組大鼠視網(wǎng)膜LC3的表達情況*示與C組、D組比較，P<0.05

2.5 Western印跡法結(jié)果 LC3Ⅰ總量，C組、D組高于F組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=23.767，P=0.003)；C組和D組LC3Ⅰ總量相當(dāng)(圖4)。

圖4. Western印跡法，各組大鼠LC3Ⅰ/actin的表達情況*示與C組、D組比較，P<0.05;#示與C組比較，P>0.05

LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值，C組明顯低于D組和F組(F=18.614,P=0.005)；F組表達略高于D組，說明非諾貝特干預(yù)后，F(xiàn)組LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化較C組增加(圖5)。

2.6 DeadEndTM熒光測定TUNEL系統(tǒng)檢測結(jié)果 建模4周，C、F組大鼠視網(wǎng)膜各層細胞熒光染色未見明顯凋亡。核呈藍色，D組能見極少量細胞質(zhì)綠色的凋亡陽性細胞(圖6)。

圖5. Western印跡法，各組大鼠LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表達情況*示與C組、D組比較，P<0.05

圖6. 3組大鼠視網(wǎng)膜細胞凋亡情況 A、D、G為DAPI，B、E、H為TUNEL，C、F、I為MERGE； TUNEL熒光染色(×200)，箭頭示凋亡細胞核

3 討論

DR的發(fā)病機制十分復(fù)雜，至今尚未完全闡明，可能包括各種細胞的病變、代謝途徑的病變及各種細胞因子的影響。近期自噬研究成為生物科學(xué)領(lǐng)域中的熱點。

過去一直認為，DR的基本病理改變是微血管病變；而最新研究表明，在DR早期，視網(wǎng)膜細胞已經(jīng)發(fā)生病理改變。有學(xué)者[11]認為，糖尿病引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)元和(或)神經(jīng)膠質(zhì)細胞的改變早于糖尿病視網(wǎng)膜微血管病變。Ning等[12]發(fā)現(xiàn)，在糖尿病早期，視網(wǎng)膜神經(jīng)元凋亡數(shù)目呈時間漸進性，提示糖尿病視網(wǎng)膜中的神經(jīng)病變可能發(fā)生在糖尿病微血管病變之前或在其早期階段。因此神經(jīng)細胞的退行性變化在早期DR的病理中起重要作用。

1963年，Christian de Duve在溶酶體國際會議上第1次提出了“自噬”概念，是指一些需降解的蛋白質(zhì)和細胞器等細胞質(zhì)成分被包裹,并最終運送至溶酶體降解的過程。近年研究顯示，自噬在糖尿病中扮演重要角色，推測細胞自噬可能與DR的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

LC3是一種自噬相關(guān)蛋白(Atg)，是酵母Atg8在哺乳動物的同源體，定位于自噬體的膜表面，參與自噬體的形成[13]。LC3有2個亞型：Ⅰ型和Ⅱ型。前LC3的羧基末端側(cè)翼區(qū)被Atg4蛋白酶切割后成為LC3Ⅰ，接著暴露其羧基末端甘氨酸殘基，然后磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine，PE)將其修飾變?yōu)長C3Ⅱ[14]。LC3被廣泛用于自噬的研究，與LC3Ⅰ相比，LC3Ⅱ定位于自噬體的膜上，因此對于評價自噬活性更為敏感。

活化的LC3與PE結(jié)合發(fā)生脂化，LC3由其胞質(zhì)可溶形式LC3Ⅰ成為膜結(jié)合的自噬小體相關(guān)形式LC3Ⅱ，引起自噬標(biāo)記物L(fēng)C3Ⅰ向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)化，通過檢測細胞內(nèi)LC3Ⅱ的變化可以判斷細胞內(nèi)的自噬狀態(tài)。LC3Ⅱ結(jié)合并始終位于胞內(nèi)自噬體的膜上，其含量與自噬體的數(shù)量成正比[13，15]。

Yao等[16]在高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激環(huán)境下發(fā)現(xiàn)了視網(wǎng)膜色素上皮(retina pigment epithelium,RPE)細胞中的自噬現(xiàn)象。說明高糖可以誘導(dǎo)視網(wǎng)膜細胞的自噬。

本研究通過建立糖尿病大鼠模型，4周后取大鼠視網(wǎng)膜，LC3免疫組織化學(xué)染色和Western印跡法檢測，發(fā)現(xiàn)3組大鼠視網(wǎng)膜均有LC3表達；建模4周，3組大鼠LC3在視網(wǎng)膜節(jié)細胞層、內(nèi)核層、外核層均有陽性表達；在F組大鼠中有強陽性表達。提示自噬存在于大鼠視網(wǎng)膜細胞中。LC3Ⅱ向LC3Ⅰ的轉(zhuǎn)化，D組和F組明顯高于C組(P<0.05)，提示自噬在早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的提高，LC3Ⅱ的積累可以解釋為自噬被激活[17]。自噬的提高是為了在細胞和組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用。推測糖尿病早期細胞自噬水平的提高，對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細胞的損傷修復(fù)和生命功能的維持有幫助。

糖尿病建模4周后，HE染色，3組大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)未見明顯變化;TUNEL法檢測早期視網(wǎng)膜細胞凋亡, 僅D組能見極少量凋亡陽性細胞核。說明早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜細胞已發(fā)生自噬改變，D組剛開始出現(xiàn)細胞凋亡;F組未見明顯細胞凋亡，推測非諾貝特對早期糖尿病大鼠視網(wǎng)膜有提高自噬的作用，使細胞凋亡延緩出現(xiàn)。

非諾貝特作為調(diào)脂藥物已被廣泛應(yīng)用在臨床上，它是第3代苯氧酸類衍生物，氯貝丁酯類降血脂藥，非諾貝酸是其血漿活性代謝產(chǎn)物，是一種過氧化物酶體增殖物激活受體-α(peroxisome proliferator-activated receptor-α，PPARα)，能顯著降低血液中的甘油三酯和總膽固醇，升高高密度脂蛋白膽固醇水平。非諾貝通過轉(zhuǎn)化成具有藥理活性的非諾貝酸，進而活化核轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮調(diào)脂作用[18]。

多項研究證實，PPAR在內(nèi)皮細胞中廣泛存在，非諾貝特可以激活內(nèi)皮中PPAR產(chǎn)生，抑制血管內(nèi)皮生長因子受體2以及新生血管形成；且PPAR與抗炎、抗氧化和神經(jīng)保護作用有關(guān)[19-21]。近年來對其非調(diào)脂作用的研究已成為熱點。

Miranda等[22]根據(jù)體外實驗推測，高糖、缺氧環(huán)境下，RPE細胞的自噬水平明顯下降；而加入非諾貝酸后，其自噬水平提高。本實驗通過建立早期糖尿病大鼠模型，非諾貝特灌胃干預(yù)，首次在動物實驗中觀察到糖尿病大鼠早期視網(wǎng)膜有LC3表達且上升，非諾貝特干預(yù)后LC3表達更高，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ轉(zhuǎn)化增加，提示糖尿病早期，視網(wǎng)膜自噬活性增強;加入非諾貝特后自噬活性更強，推測非諾貝特通過誘導(dǎo)自噬而對DR病理過程發(fā)揮延緩、抑制作用。

細胞死亡包括3種類型：壞死、凋亡和自噬性細胞死亡。凋亡即Ⅰ型程序性細胞死亡，具有依賴caspase參與，染色體濃聚，細胞皺縮，出現(xiàn)凋亡小體等特征[23]。目前普遍認為自噬是一種防御和應(yīng)激調(diào)控機制。細胞可以通過自噬，消除、降解，并消化受損、變性、衰老和失去功能的細胞、細胞器和變性蛋白質(zhì)及核酸等生物大分子，為細胞重建、再生和修復(fù)提供必需原料，實現(xiàn)細胞再循環(huán)、再利用。細胞自噬可以單獨通過細胞保護作用或自身破壞吞噬作用決定細胞生存和死亡，也能通過比較復(fù)雜的機制與細胞凋亡聯(lián)系起來,從而對細胞產(chǎn)生影響,清除細胞凋亡殘余物，防止組織損傷[24]。一般說來，凋亡是程序化細胞死亡，自噬是程序化細胞存活。但是自噬是把“雙刃劍”，過多或過少的自噬都將危害細胞生存。然而細胞自噬在DR中的作用及其與細胞凋亡相互作用的具體機制,以及提高細胞自噬和減少細胞凋亡是否有助DR微血管病變的改善值得進一步研究證實。

本實驗中，各組大鼠視網(wǎng)膜早期均未見明顯凋亡。但仍需延長病程時間，觀察凋亡和自噬是否存在緊密聯(lián)系。此外非諾貝特是通過何種機制調(diào)節(jié)自噬,從而改善視網(wǎng)膜細胞的穩(wěn)態(tài)？糖尿病視網(wǎng)膜自噬和凋亡的內(nèi)在關(guān)聯(lián)如何？將是未來研究重點。

[1] IDF. International Diabetes Federation-Diabetes Atlas[M].6th ed.2013:1-160.

[2] Simó R. Neurodegeneration as an early event in diabetic retinopathy[J]．Endocrinol Nutr,2011，58(5)：211-213．

[3] Villarroel M, Ciudin A, Hernández C, et al. Neurodegeneration：an early event of diabetic retinopathy[J].World J Diabetes，2010，1(2)：57-64．

[4] Antonetti DA，Klein R，Gardner TW. Diabetic retinopathy[J].N Engl J Med ,2012,366(13):1227-1239.

[5] Tanaka Y，Kume S，Kitada M，et al．Autophagy as a therapeutic target in diabetic nephropathy[J]．Exp Diabetes Res，2012，2012：628978．

[6] Brech A，Ahlquist T，Lothe RA．et al．Autophagy in tumour suppression and promotion[J]．Mol Oncol，2009，3(4)：366-375．

[7] Hoare M，Young AR，Narita M，et al．Autophagy in cancer：having your cake and eating it[J]．Semin Cancer Biol,2011，21(6)：397-404．

[8] Kaamiranta K．Autophagy—hot topic in AMD[J]．Acta Ophthalmol,2010,88(4):387-388．

[9] Tanida I，Ueno T，Kominami E．LC3 conjugation system in mammalian autophagy[J]．Int J Biochem Cell Biol，2004，36(12)：2503-2518．

[10] Hammes HP,Ali SS,Uhlmann M,et al. Aminoguanidine does not inhibit the initial phase of experimental diabetic retinopathy in rats[J].Diabetologia,1995,38(3):269-273.

[11] Parisi V，Uccioli L．Visual electrophysiological responses in persons with type 1 diabetes[J].Diabetes Metab Res Rev, 2001,17(1):12-18.

[12] Ning X，Baoyu Q，Yuzhen L, et al．Neuro--optic cell apoptosis and microangiopathy in KKAY mouse retina[J]．Int J Mol Med,2004，13(1)：87-92.

[13] Kabeya Y，Mizushima N，Ueno T，et al．LC3，a mammalian homologue of yeast Apg8p，is localized in autophagosome membranes after processing[J]．EMBO J,2000，19(21)：5720-5728．

[14] Kimura S，F(xiàn)ujita N，Noda T，et al．Monitoring autophagy in mammalian cultured cells through the dynamics of LC3[J]．Methods Enzymol，2009，452：1-12．

[15] Mizushima N．Methods for monitoring autophagy[J]．Int J Biochem Cell Biol，2004，36(12)：2491-2502．

[16] Yao J，Tao ZF，Li CP，et al．Regulation of autophagy by high glucose in human retinal pigment epithelium[J]．Cell Physiol Biochem，2014，33(1)：107-116．

[17] K1ionsky DJ，Abdalla FC，Abeliovich H, et al．Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy[J]．Autophagy，2012，8(4)：445-544．

[18] Treacy MP，Hurst TP．The case for intraocular delivery of PPAR agonists in the treatment of diabetic retinopathy[J]．BMC Ophthalmol，2012，12：46-50．

[19] Inoue l，Shino K，Noji S，et al．Expression of peroxisome proliferator—activated receptor alpha(PPAR alpha)in primary cultures of human vascular endothelial cells [J]．Biochem Biophys Res Commun，1998，246(2)：370-374．

[20] Chen XR, Besson VC, Palmier B, et al．Neurological recovery-promoting, anti-inflammatory, and anti-oxidative effects afforded by fenofibrate，a PPAR alpha agonist，in traumatic brain injury[J]．J Neurotrauma，2007，24(7)：1119-1131．

[21] Deplanque D, Gelé P, Pétrault O, et al．Peroxisome proliferator-actived receptor-alpha activation as a mechanism of preventive neuroprotection induced by chronic fenofibrate treatment[J]. J Neurosci，2003，23(15)：6264-6271．

[22] Miranda S, González-Rodrítquez, García-Ramírez M, et al．Beneficial effects of fenofibrate in retinal pigment epithelium by the modulation of stress and survival signaling under diabetic conditions[J]．J Cell Physiol,2012,227(6)：2352-2362.

[23] Lockshin RA，Zakeri Z. Apoptosis，autophagy，and more[J].Int J Biochem Cell Biol，2004，36(12)：2405-2419.

[24] Grossmayer GE, Munoz LE ,Gaipl US, et al. Removal of dying cells and systemic lupus erythematosus[J].Mod Rheumatol,2005,15(6): 383-390.

(本文編輯 諸靜英)

Expression and significance of LC3 in the retina of early stage diabetic rats

LIUQing＊,WEIFang,XUXun.

DepartmentofOphthalmology,ShanghaiGeneralHospital,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200080,China

XU Xun， Email：drxuxun@sjtu.edu.cn

Objective To explore the expression and significance of microtubule-associated protein 1 light chain 3 (MAP1-LC3) in the retina of early stage diabetic rats. Methods Twenty-four SD rats were randomly divided into the control group(Group C,n=8), streptozotocin(STZ) group (Group D,n=8) and STZ+fenofibrate group (Group F,n=8). At the end of the 4th week, all rats were sacrificed, and their eyeballs were harvested. The retinas were tested by hemotoxylin-eosin (HE) staining, the protein expression of LC3 were tested by Western blot and immunohistochemistry. Terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling (TUNEL) was performed to observe the apoptosis of retina cells in all rats. Results Diabetic rat model was successfully established. HE staining showed no obvious pathologic changes in retina among the three groups.Western blot test showed that the ratio of LC3Ⅱ/LC3Ⅰ in retina was significantly increased in Group D and Group F compared with Group C at the end of the 4th week(P<0.05). The immunohistochemical test of LC3 showed the consistent results as Western blot. Retina cells had no obvious apoptosis in all three groups.Conclusions Autophagy was increased in early stage diabetic rats. Fenofibrate increased autophagy in diabetic rats. A protective mechanism, autophagy, occurred before cell apoptosis in diabetic retinopathy. (Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2017,17:10-15)

Diabetic retinopathy; Microtubule-associated Protein 1 light chain 3; Autophagy; Rats, Sprague-Dawley

上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院眼科 上海 200080；＊上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院眼科 上海 200336

許迅(Email：drxuxun@sjtu.edu.cn)

為上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院在職研究生 上海 200080

10.14166/j.issn.1671-2420.2017.01.004

2016-01-29)