張書辰，祝戎飛，楊　林，張　威，李文靜，黃　南，項(xiàng)　寧，汪　茵，胡林濤，王曉龍

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院過敏反應(yīng)科,武漢430030)

ChinJAllergyClinImmunol，2017，11(2)：149- 155

雞蛋過敏是嬰幼兒和兒童最常見的一種食物過敏現(xiàn)象[1]。雞蛋過敏在臨床上有多重表現(xiàn)，可累及口腔(黏膜)、皮膚、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、血管。嚴(yán)重速發(fā)型反應(yīng)可引起過敏性休克，導(dǎo)致患者死亡。而因過敏導(dǎo)致的遲發(fā)型癥狀影響兒童營養(yǎng)吸收，導(dǎo)致患兒生長發(fā)育遲緩[2]。我國對720例特異性的兒童食物過敏發(fā)生率的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn), 雞蛋過敏皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)(skin prick test，SPT)陽性69例(9.58%), 最后確診42例(5.83%), 占食物過敏第1位[3]。在臨床觀察中，2/3的雞蛋過敏癥兒童在5～6歲癥狀可減輕或消失, 但1/3的患兒可持續(xù)出現(xiàn)過敏癥狀。雞蛋過敏兒童經(jīng)過一段時(shí)期的無雞蛋飲食后再予口服激發(fā), 發(fā)現(xiàn)部分兒童可耐受, 另一部分兒童仍持續(xù)過敏[4]。雞蛋蛋白豐富，而主要致敏蛋白在蛋清中，目前發(fā)現(xiàn)23種糖蛋白，但能與人血清免疫球蛋白(immunoglobulin E，IgE)結(jié)合并引起過敏反應(yīng)的主要有4種[5- 9]，分別是卵白蛋白(相對分子質(zhì)量45 000，約占蛋清總蛋白54%)[10]、卵類黏蛋白(相對分子質(zhì)量28 000，約占蛋清總蛋白11%)[11]、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白(相對分子質(zhì)量為80 000，約占蛋清總蛋白12%)[12]和溶菌酶(相對分子質(zhì)量14 000，約占蛋清總蛋白3.4%)[13]。目前檢驗(yàn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”UniCap檢測血液中特異性IgE不能有效區(qū)分過敏兒童是否能進(jìn)展為雞蛋耐受。本試驗(yàn)通過檢測組分蛋白和雞蛋過敏患者血清中特異性IgE結(jié)合情況，分析各蛋白組分對雞蛋過敏的臨床診斷價(jià)值。

材料與方法

構(gòu)建質(zhì)粒

查詢天然四種雞蛋清蛋白設(shè)計(jì)Gal d 1～4四種雞蛋清蛋白的堿基序列，交由上海Invitrogen公司進(jìn)行化學(xué)合成，將合成好的序列克隆入pEGFP-N1載體，并測序驗(yàn)證重組克隆插入片段的序列信息，保留含有正確目的序列的質(zhì)粒。

構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：將Cos- 7細(xì)胞轉(zhuǎn)染陰性對照質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)lipofectamine 2000和質(zhì)粒DNA的比例為2.5∶1時(shí)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果最佳，帶目的基因的質(zhì)粒均選用此濃度進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

靶細(xì)胞抗生素劑量篩選：構(gòu)建的質(zhì)粒帶有G418(Geneticin,遺傳霉素)抗性，根據(jù)抗生素的劑量范圍和Cos- 7細(xì)胞的篩選信息，將細(xì)胞培養(yǎng)基中G418設(shè)定100、200、300、400、500、600 mg/L共6個(gè)濃度梯度，根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)至第3天和第7天時(shí)細(xì)胞存活數(shù)量，將Cos- 7細(xì)胞G418的篩選劑量定為400 mg/L。

質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Cos- 7細(xì)胞及混合克隆Cos- 7細(xì)胞穩(wěn)定系篩選：將含有目的基因的質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Cos- 7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后消化細(xì)胞并傳代，待細(xì)胞貼壁后加入前期篩選出的抗生素劑量G418 400 mg/L。持續(xù)觀察細(xì)胞的篩選情況，每3天換1次含有抗生素的完全培養(yǎng)基，持續(xù)篩選2～3周。擴(kuò)增并凍存細(xì)胞，并對細(xì)胞進(jìn)行基因和蛋白水平的檢測。

目的蛋白的擴(kuò)增、純化及鑒定

復(fù)蘇并擴(kuò)增含有目的基因的Cos- 7細(xì)胞，待細(xì)胞長滿后，收集細(xì)胞的蛋白樣品。采用 Ni2+柱親和層析的方法純化各重組蛋白，將純化后的蛋白定量后用Western blot方法驗(yàn)證目的蛋白，四種蛋白抗體均來源于AbboMax公司(美國)。

患兒血清及資料的收集

本實(shí)驗(yàn)所用血清均來源于有雞蛋過敏史的患兒，且經(jīng)CAP變應(yīng)原檢測法測定雞蛋特異性IgE>0.35 kU/L。收集的血清凍存于-80 ℃冰箱備ELISA檢測用。資料的收集包括患兒性別、年齡、雞蛋特異性IgE數(shù)值(UniCap)、過敏原SPT(北京協(xié)和新華聯(lián))結(jié)果。

ELISA法測定雞蛋過敏患者血清中卵白蛋白、卵類黏蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白和溶菌酶的蛋白含量

將各目的蛋白按5、10、20和50 mg/L的濃度梯度包被96孔板，待檢測血清用1∶1稀釋，根據(jù)在450 nm處測得光密度值(optical density，OD)450 nm，發(fā)現(xiàn)卵白蛋白和卵類黏蛋白在10 mg/L時(shí)包被量達(dá)到飽和，轉(zhuǎn)鐵蛋白和溶菌酶蛋白在20 mg/L時(shí)包被量達(dá)到飽和。目的蛋白根據(jù)各自不同的最佳包被濃度在4 ℃包被過夜，第2天加入待測血清(1∶1稀釋)孵育90 min，之后加入生物素化抗體工作液孵育60 min，再加入酶結(jié)合物稀釋液孵育30 min，以上每個(gè)步驟結(jié)束之后用TBST洗5次，孵育溫度為37 ℃。最后加入顯色液并適時(shí)終止，用酶標(biāo)儀測量OD450 nm。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)　　果

目的基因表達(dá)檢測和重組蛋白鑒定

提取各穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞樣品總RNA，通過realtime-PCR法檢測各細(xì)胞樣品中目的基因和內(nèi)參基因的表達(dá)量。發(fā)現(xiàn)根據(jù)四種天然雞蛋清蛋白設(shè)計(jì)的引物，目的基因得到有效擴(kuò)增。隨后，將用穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系培養(yǎng)獲得卵白蛋白、卵類黏蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和溶菌酶四種蛋白純化，并將純化后的蛋白進(jìn)行Western blot檢測其表達(dá)情況。由于每個(gè)目的蛋白均融合了相對分子質(zhì)量約28 000的綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)，所以檢測到的目的蛋白相對分子質(zhì)量均偏大。用特異性抗體檢測到的重組卵白蛋白相對分子質(zhì)量約73 000，重組卵轉(zhuǎn)鐵蛋白相對分子質(zhì)量約108 000，重組卵類黏蛋白相對分子質(zhì)量約56 000，重組溶菌酶相對分子質(zhì)量約42 000，構(gòu)建的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系能產(chǎn)生特異性的卵白蛋白、卵類黏蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和溶菌酶(圖1)。

納入受試者的基本資料

共納入60例雞蛋過敏的患兒，平均年齡為4.3(0.8～7.5)歲。根據(jù)患兒血清蛋白ELSA檢測結(jié)果，發(fā)現(xiàn)雞蛋特異性IgE含量>10 kU/L的患兒在四種雞蛋蛋白抗體中主要以卵白蛋白抗體為主，而雞蛋特異性IgE含量<10 kU/L的患兒以卵類黏蛋白抗體為主。因此，根據(jù)雞蛋特異性IgE含量將患兒分為兩組，雞蛋特異性IgE>10 kU/L組(22例)和雞蛋特異性IgE <10 kU/L組(38例)，兩組在年齡和性別比上差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雞蛋特異性IgE >10 kU/L組的患兒雞蛋過敏原點(diǎn)刺陽性率明顯高于雞蛋特異性IgE <10 kU/L組(表1)。

圖1重組蛋白表達(dá)

A:Western blot驗(yàn)證純化后的重組卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和重組卵白蛋白的表達(dá); B:驗(yàn)證純化后的重組卵類黏蛋白和重組溶菌酶的表達(dá)

Fig1Expression of recombinant protein

A:Expression validated by Western blot of recombinant egg transferrin and recombinant ovalbumin after purification; B:Expression validated by Western-Blot of recombinant egg leptin and recombinant lysozyme after purification

Mr:相對分子質(zhì)量

表1　納入受試者的基本資料Table 1　Basic information of patients

血清蛋白檢測結(jié)果

對60例雞蛋過敏患兒血清中的卵白蛋白、卵類黏蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和溶菌酶四種抗體進(jìn)行ELISA檢測，發(fā)現(xiàn)4種重組蛋白均能與特異性IgE發(fā)生反應(yīng)，重組蛋白具有免疫活性。四種蛋白所測 OD450 nm的平均值分別為卵白蛋白0.567、卵類黏蛋白0.81、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白0.154和溶菌酶0.096(圖2)，在雞蛋過敏中，卵類黏蛋白和卵白蛋白為過敏原的主要成分。

卵白蛋白和卵類黏蛋白與血清雞蛋特異性IgE的關(guān)系

在檢測的60例雞蛋過敏血清中，25例(41.6%)患兒血清中以卵白蛋白抗體為主，34例(56.6%)患兒血清中以卵類黏蛋白抗體為主，1例以轉(zhuǎn)鐵蛋白抗體為主。將4種雞蛋組分蛋白OD450 nm的數(shù)值與雞蛋特異性IgE含量進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)血清卵白蛋白抗體含量與雞蛋特異性IgE的值呈顯著正相關(guān)關(guān)系(p=0.808 4,P<0.000 1)，而這種相關(guān)性在其余三種組分蛋白中不明顯(圖3)。隨后又將雞蛋特異性IgE含量與卵白蛋白和卵類黏蛋白OD450 nm的數(shù)值進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)血清雞蛋特異性IgE>10 kU/L的患兒，其血清IgE的值與血清卵白蛋白抗體含量(OD450 nm的數(shù)值)呈明顯正相關(guān)關(guān)系(p=0.630 9,P=0.002 2), 雞蛋特異性IgE<10 kU/L的患兒，其血清IgE的值與血清卵類黏蛋白抗體含量呈明顯正相關(guān)關(guān)系(p=0.756 0,P<0.000 1)(圖4)。

討　　論

目前由于雞蛋過敏的患者并無特殊的診療方案，傳統(tǒng)臨床采用的天然變應(yīng)原粗提取液由于純度不夠，雜質(zhì)較多，往往會(huì)導(dǎo)致假陽性結(jié)果，而粗提取液中的雜質(zhì)不明，亦可導(dǎo)致患者出現(xiàn)局部和全身的不良反應(yīng)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致休克甚至死亡[14]。而今，在實(shí)驗(yàn)室中嘗試開發(fā)提取高純的重組過敏原對過敏原的標(biāo)準(zhǔn)化進(jìn)程有著十分重要的價(jià)值，并為控制脫敏治療中的風(fēng)險(xiǎn)有非常重要的意義[15]?，F(xiàn)試驗(yàn)結(jié)果表明，通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)可人工合成的重組蛋白完全可由實(shí)驗(yàn)室人工備制[16]，而其蛋白活性均可達(dá)到臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

SPT在過敏原的粗篩過程中有一定價(jià)值，它減小了過敏原體內(nèi)檢測引起不良癥狀的風(fēng)險(xiǎn)[17]。但是由于皮膚組織的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，其特異度和敏感度不高，往往在臨床運(yùn)用中引起結(jié)果判讀的偏差。通過測得患者血清特異性IgE和點(diǎn)刺結(jié)果相對比，雞蛋特異性IgE>10 kU/L組的患兒雞蛋過敏原點(diǎn)刺陽性率明顯高于<10 kU/L組(P=0.000 3)，發(fā)現(xiàn)高血清IgE患者在SPT中，更容易出現(xiàn)陽性結(jié)果，而低IgE的雞蛋蛋白對SPT的敏感性較低，這導(dǎo)致臨床檢查中，往往可能因?yàn)殡u蛋點(diǎn)刺結(jié)果為陰性而被臨床醫(yī)師忽視。由此可見，對于雞蛋過敏原的檢測，SPT和血清學(xué)特異性IgE檢測都是必不可少的[18]。

圖3血清卵白蛋白、卵類黏蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白、溶菌酶抗體含量(用OD450 nm表示)與雞蛋特異性IgE的相關(guān)性

Fig3Correlations between egg-specific IgE and ovalbumin, ovo mucin, egg transferrin, lysozyme in serum (expressed in D450 nm)

圖4血清卵白蛋白抗體含量與雞蛋特異性IgE<10 kU/L(A)和>10 kU/L(B)時(shí)的相關(guān)性；血清卵類黏蛋白抗體含量與雞蛋特異性IgE<10 kU/L(C)和>10 kU/L(D)的相關(guān)性

Fig4Correlation between ovalbumin antibody and egg specific IgE<10 kU/L(A) and egg specific IgE>10 kU/L(B); Correlation between ovo mucin antibody and egg specific IgE<10 kU/L(C) and egg specific IgE>10 kU/L(D)

現(xiàn)公認(rèn)的蛋清中過敏原主要有四類，卵類黏蛋白、卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和溶菌酶。而通過此實(shí)驗(yàn)表明，在本科室受測人群中，以卵類黏蛋白和卵白蛋白居多，分別占56.6%和41.6%，筆者認(rèn)為這兩個(gè)組分蛋白為4個(gè)蛋清組分蛋白中的主要致敏原。而把結(jié)果進(jìn)一步分組發(fā)現(xiàn)，雞蛋特異性IgE含量高(>10 kU/L)的患兒血清中卵白蛋白抗體含量較高，而特異性IgE<10 kU/L的患兒血清中卵類黏蛋白抗體含量高。結(jié)合上述點(diǎn)刺結(jié)果分析(雞蛋特異性IgE>10 kU/L較易顯現(xiàn)皮膚點(diǎn)刺陽性結(jié)果)，點(diǎn)刺中陽性結(jié)果的發(fā)生可能主要為卵白蛋白引起。但由于涉及安全及倫理問題，目前尚無法使用卵白蛋白或其他組分蛋白直接對患者行皮膚試驗(yàn)，無法對各類組分蛋白在點(diǎn)刺液中的組成比例而影響皮膚的刺激性造成假陽性結(jié)果進(jìn)行評估[19]。所以，也無法評價(jià)各類組分蛋白的含量在皮膚試驗(yàn)中的具體作用。因此，對于雞蛋過敏以及各類食物過敏，目前仍需按照國際指南標(biāo)準(zhǔn)，以食物激發(fā)試驗(yàn)作為食物過敏的診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”[20- 21]。

雖然目前所測人群較少，不能完全代表湖北省或華中地區(qū)雞蛋過敏人群的組分蛋白種類，但對進(jìn)一步臨床科研提供方向，為今后食物過敏的診斷，乃至食物的脫敏治療[22- 23]提供部分依據(jù)。

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