楊曉彬，周苗

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，廣州口腔病研究所，口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510140)

1 引 言

血管化是頜骨組織工程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。血管化能為支架內(nèi)部的種子細(xì)胞提供氧氣等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并及時(shí)排出代謝產(chǎn)物，還可將各種細(xì)胞成分運(yùn)送至支架內(nèi)參與新骨的生成，對(duì)修復(fù)大塊頜骨缺損極為重要。由于頜骨缺損常與口腔相通，容易污染，組織工程構(gòu)建物早期快速的血管化有助于提升其抗感染能力、存活率和修復(fù)缺損的成功率。目前促進(jìn)組織工程頜骨血管化的方法包括應(yīng)用血管內(nèi)皮細(xì)胞、復(fù)合促血管生長(zhǎng)因子、優(yōu)化支架的成分與外形及內(nèi)部結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、采用外科手段等[1]，本研究將以上促血管化手段分為體內(nèi)外兩類，分述如下。

2 體外手段

組織工程的經(jīng)典模式是構(gòu)建種子細(xì)胞-細(xì)胞因子-支架材料復(fù)合物，因此，體外構(gòu)建血管化主要圍繞著對(duì)這三者的調(diào)控所進(jìn)行。

2.1 優(yōu)化支架的成分、內(nèi)部結(jié)構(gòu)與外形

支架的成分、內(nèi)部結(jié)構(gòu)和外形與血管化密切相關(guān)，首先，采用不同成分結(jié)合的復(fù)合材料有利于突破單一成分性能的局限，因而獲得了更為廣泛的應(yīng)用，Yang等采用天然殼聚糖和β-TCP復(fù)合物修復(fù)比格犬節(jié)段骨缺損，觀察到比單一β-TCP更好的細(xì)胞黏附效果，也獲得更好的血管化[2]。除了支架本身對(duì)血管化構(gòu)成影響外，還可以復(fù)合一些元素、藥物等加快血管化進(jìn)程。Wu等將銅摻入到多孔生物玻璃支架里制備得到了可控釋放銅的生物支架，發(fā)現(xiàn)其能誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分泌缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor, HIF)-1α和 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，并最終獲得了更好血管化[3]。其次，在結(jié)構(gòu)上，支架的孔隙、孔隙率、連通徑與血管化密不可分。支架的孔隙和孔間連通徑為新生血管提供長(zhǎng)入空間，從而使種子細(xì)胞獲得營(yíng)養(yǎng)支持并使代謝廢物得以清除，F(xiàn)eng等研究發(fā)現(xiàn)孔徑在400 μm以下時(shí)會(huì)明顯限制新生血管的生長(zhǎng)[4]，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，保持孔間連通徑不變，增大孔徑只能增加長(zhǎng)入血管管徑大小，而保持孔徑大小不變，增大孔內(nèi)連通徑卻能同時(shí)增加長(zhǎng)入血管的管徑和數(shù)量[5]。孔隙率是支架另一個(gè)重要參數(shù)，較高的孔隙率有利于血管化，但同時(shí)也會(huì)降低支架的力學(xué)強(qiáng)度。另外，支架外形也影響其血管化，有研究表明，管狀結(jié)構(gòu)的支架比柱狀結(jié)構(gòu)的支架血管化效果更好[6]。近年來學(xué)者多采用這種管狀結(jié)構(gòu)支架或在支架上制備凹槽，結(jié)合血管束植入的方法獲得更好的血管化[7]。隨著三維打印技術(shù)的發(fā)展，支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)更加精密，外形也更具個(gè)性化[8]，并可模擬體內(nèi)血管通道微觀結(jié)構(gòu)預(yù)構(gòu)支架，引導(dǎo)血管更快長(zhǎng)入整個(gè)支架內(nèi)部的多孔結(jié)構(gòu)[9]。

2.2 應(yīng)用具有血管分化潛能的種子細(xì)胞

血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells, ECs)、內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial Progenitor cells, EPCs)和間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是目前常用的具有血管分化潛能的種子細(xì)胞。ECs是構(gòu)成血管壁的基礎(chǔ)，且和成骨細(xì)胞關(guān)系密切，在血管化過程中起著重要作用。EPCs是ECs的前體細(xì)胞，已有研究表明其可以在體外培養(yǎng)形成管狀結(jié)構(gòu)[10]，將ECs或EPCs與其他具有成骨功能的種子細(xì)胞共培養(yǎng)于三維多孔支架材料上是常見的血管化組織工程骨構(gòu)建方法，細(xì)胞間的相互作用可加快血管化，在體外預(yù)先形成毛細(xì)血管網(wǎng)絡(luò)，植入體內(nèi)后能與宿主血管吻合，從而保證了種子細(xì)胞的存活[11]。魏等將MSCs和EPCs共培養(yǎng)于支架上，證實(shí)在體內(nèi)、外條件下共培養(yǎng)組均表現(xiàn)出比單一培養(yǎng)組更強(qiáng)的促血管化能力[12]。也有學(xué)者將種子細(xì)胞培養(yǎng)于體外生物反應(yīng)器構(gòu)建組織工程血管獲得成功[13]。但由于缺乏真正的細(xì)胞外基質(zhì)，這些共培養(yǎng)的細(xì)胞附著性較差，且在支架上分布不均勻，細(xì)胞間相互接觸與作用較少，難以形成體內(nèi)細(xì)胞所應(yīng)有的微環(huán)境。近來，利用細(xì)胞膜片技術(shù)構(gòu)建血管化成為新的熱點(diǎn)，Ren等將ECs接種于未分化的MSCs膜片上構(gòu)建預(yù)血管化膜片，并與MSCs分化的細(xì)胞膜片復(fù)合，植入體內(nèi)后顯示體外構(gòu)建的血管網(wǎng)能夠與宿主血管快速吻合形成新的功能性血管網(wǎng)[14]。

2.3 添加促血管生長(zhǎng)因子

很多生長(zhǎng)因子具有促進(jìn)血管新生的能力，如VEGF、骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)、血小板衍生生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor, PDGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)等，目前認(rèn)為VEGF是血管形成的關(guān)鍵因子，學(xué)者們多采用緩釋VEGF的載體與種子細(xì)胞復(fù)合植于支架中，或利用基因工程技術(shù)將表達(dá)VEGF的基因片段轉(zhuǎn)染種子細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)VEGF的緩慢釋放。Murphy等采用緩釋VEGF的生物支架材料修復(fù)大鼠顱骨缺損，發(fā)現(xiàn)支架內(nèi)部形成了比單純使用支架的對(duì)照組更為致密的血管網(wǎng)絡(luò)[15]。BMP可以促使MSCs向骨或軟骨細(xì)胞分化，上調(diào)成骨細(xì)胞中的VEGF并與之協(xié)同作用促進(jìn)血管化[16]。PDGF可以刺激血管周細(xì)胞的活動(dòng)，促進(jìn)血管的成熟[17]。bFGF可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移到特定部位與平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等相結(jié)合，直接促進(jìn)血管生成[18]。但體內(nèi)血管生成往往是多因子共同作用的結(jié)果，學(xué)者們常采用多因子聯(lián)合來獲得更好的血管化效果；Li等對(duì)比了聯(lián)合應(yīng)用VEGF和PDGF因子的支架和單一復(fù)合VEGF其血管化速度，發(fā)現(xiàn)雙因子誘導(dǎo)模式可以使支架更快血管化[17]。Das等聯(lián)合應(yīng)用BMP-6和VEGF在修復(fù)大鼠下頜骨缺損實(shí)驗(yàn)中，也發(fā)現(xiàn)了雙因子聯(lián)合應(yīng)用比單獨(dú)應(yīng)用其中一種因子的成骨和成血管化效果更明顯[19]。Gothard等提出，聯(lián)合BMP-2、BMP-7、FGF、PDGF、VEGF 的生物材料是今后研究熱點(diǎn)[20]，然而如何經(jīng)濟(jì)、實(shí)用和操作簡(jiǎn)單地使用多個(gè)生長(zhǎng)因子來促進(jìn)血管化仍有待研究。

3 體內(nèi)手段

其基本方法是應(yīng)用外科手段，將組織工程構(gòu)建物植入體內(nèi)血管豐富的組織或?qū)⒀苁踩虢M織工程構(gòu)建物中，以誘導(dǎo)其早期快速血管化，根據(jù)新生血管形成部位和生長(zhǎng)方向的不同可分為外源型的組織包裹法和內(nèi)源型的血管束植入法，外源型的血管長(zhǎng)入及營(yíng)養(yǎng)方式由外周向中心進(jìn)行，內(nèi)源型則相反。

3.1 組織包裹法

將組織工程構(gòu)建物埋植于富含血管的組織床內(nèi)，使其被血管或干細(xì)胞豐富的組織包裹以促進(jìn)血管化[21]，其機(jī)制主要是創(chuàng)傷、炎癥和缺氧等因素激發(fā)組織再生途徑，誘導(dǎo)局部血管生長(zhǎng)因子等表達(dá)，促進(jìn)新生血管由外向內(nèi)生長(zhǎng)。Terheyden等在小型豬背闊肌中預(yù)制血管化的組織工程骨，將異位構(gòu)建的骨瓣轉(zhuǎn)移，成功修復(fù)下頜骨缺損[22-23]。Orringer將人骨提取的BMP和自體髂骨混合后植入肩胛下動(dòng)靜脈供血肌瓣中，4 個(gè)月游離預(yù)制骨瓣修復(fù)其大范圍頜骨缺損[24]。Warnke等將加入自體骨髓干細(xì)胞和重組人骨形成蛋白-7(rhBMP-7)的BioOss塊狀骨植入患者背闊肌內(nèi)構(gòu)建組織工程骨，7周后帶血管蒂轉(zhuǎn)移成功修復(fù)一口底癌患者大段下頜骨骨缺損[25]。Zhou等通過脫鈣同種異體骨、珊瑚羥基磷灰石復(fù)合rhBMP-2，外包個(gè)性化鈦網(wǎng)塑形，然后植入恒河猴背闊肌中異位預(yù)制個(gè)性化、血管化組織工程骨，13周后將其帶蒂移植，修復(fù)恒河猴下頜骨節(jié)段性缺損，觀察到預(yù)制組修復(fù)的下頜骨缺損，其成骨較原位植入rhBMP-2的對(duì)照組更好，骨連續(xù)性、體積和外形更佳[26]。這種通過預(yù)制后的組織工程骨能提早建立穩(wěn)定的血供，可增加肌骨瓣的抗感染能力，并可帶軟組織修復(fù)頜骨復(fù)合缺損，較原位植入的優(yōu)勢(shì)大大增加。

3.2 血管束植入法

是指通過植入血管束(vascular bundle,VB)或構(gòu)建動(dòng)靜脈環(huán)(arteriovenous loop,AVL)的方法在支架內(nèi)部預(yù)構(gòu)內(nèi)循環(huán)網(wǎng)絡(luò)[27]。VB是將體內(nèi)相鄰的兩條動(dòng)靜脈血管束直接穿過支架材料中間，而后血管束長(zhǎng)出大量毛細(xì)血管側(cè)支，從而形成豐富的血管網(wǎng)。研究證實(shí)VB植入的支架比無VB植入組血管化更好[7]。楊等將植入兔體內(nèi)的VB遠(yuǎn)端結(jié)扎，和血流通暢的VB未結(jié)扎組對(duì)比，發(fā)現(xiàn)兩組均能有效促進(jìn)組織工程骨血管化，但未結(jié)扎組的促血管作用比結(jié)扎組更好，說明VB十分具有臨床應(yīng)用價(jià)值，即使植入支架內(nèi)的血管發(fā)生栓塞也能發(fā)揮很好的促血管作用[28]。AVL則是將體內(nèi)相鄰的兩條動(dòng)靜脈近心端用顯微外科方法進(jìn)行端-端吻合術(shù)，形成動(dòng)靜脈短路環(huán)包繞支架。該方法最早由2006年Kneser等人首次運(yùn)用于骨組織工程，他們?cè)谥踩氪笫篌w內(nèi)的小牛骨支架中構(gòu)建AVL，經(jīng)組織學(xué)、血管造影、MRI和血管灌注等方法檢測(cè)均發(fā)現(xiàn)大量的新生血管[29]。后來國(guó)內(nèi)學(xué)者Dong等人運(yùn)用同樣的方法在新西蘭兔股動(dòng)靜脈構(gòu)建AVL，嵌入天然濱珊瑚塊中，外包聚四氟乙烯膜隔離，植入后發(fā)現(xiàn)支架材料表面及中心部位均形成了致密的血管網(wǎng)絡(luò)，且血管網(wǎng)密度也顯著高于單純植入支架材料的對(duì)照組[30]，進(jìn)一步研究表明，AVL誘導(dǎo)血管新生的能力比VB更強(qiáng)，原因在于兩者促血管新生的機(jī)制不同，AVL動(dòng)靜脈相互吻合，血流動(dòng)力學(xué)的改變促使大量毛細(xì)血管芽生并相互交聯(lián)形成豐富的血管網(wǎng)，而VB不存在此形式，血管生成效率偏低[31]。但從臨床應(yīng)用方面來看，AVL因手術(shù)操作復(fù)雜和成功率較低等缺點(diǎn)，仍需進(jìn)一步研究改進(jìn)。

3.3 展望

頜骨組織工程血管化研究取得了很多進(jìn)展，但仍存在明顯的不足，如多孔型支架材料雖然能促進(jìn)血管長(zhǎng)入，但同時(shí)也削弱其力學(xué)性能；種子細(xì)胞的優(yōu)選、多向分化和與支架的有效結(jié)合；促血管生長(zhǎng)因子的效果確定，但其劑量控制和緩釋技術(shù)仍不足；構(gòu)建動(dòng)靜脈環(huán)或植入血管束會(huì)增加手術(shù)時(shí)間和創(chuàng)傷。血管化是多因素共同作用的復(fù)雜生理過程，多策略聯(lián)合應(yīng)用仍將是未來頜骨組織工程血管化的重要方向。