馬 超，張 青，沈定榮，王元祥，彭 樂，孟保英，提運幸，丁以群

·臨床研究·

自體冷血停搏液對未成熟心肌保護作用與磷酸化蛋白激酶的相關(guān)性研究

馬 超，張 青，沈定榮，王元祥，彭 樂，孟保英，提運幸，丁以群

目的 探討自體冷血停搏液對未成熟心肌保護作用與磷酸化蛋白激酶B(P－AKT)抗凋亡機制的相關(guān)性。方法

自體冷血停搏液;嬰兒;未成熟心肌;先天性心臟病;蛋白激酶B/AKT

體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass，CPB)心臟直視術(shù)矯治畸形是糾正先天性心臟病患兒發(fā)育異常與挽救生命的主要手段，但嬰兒的心肌為未成熟心肌，與成熟心肌在組織結(jié)構(gòu)、興奮收縮耦聯(lián)系統(tǒng)及對缺血缺氧的耐受方面較成熟心肌有差異［1］，在心內(nèi)直視術(shù)中更容易受到損傷［2］。心臟停搏液灌注技術(shù)是心內(nèi)直視手術(shù)中一項極其重要的對抗心肌細胞缺血后再灌注損傷的保護措施［3］，但目前并沒有根據(jù)未成熟心肌的特點研究出適合的灌注液，嬰兒使用的是與成年患者基本相似的心肌保護液，對嬰兒的心肌保護效果不理想。為研制出適合于未成熟心肌保護的停搏液配方，本中心取自患兒自身動脈血自行制備成冷自體血心臟停搏液(cold autologous blood cardioplegia，CABC)臨床應(yīng)用多年，取得較好的心肌保護效果［4－5］，但至目前為止，沒有對CABC與非自體冷血停搏液(NCABC)在未成熟心肌損傷中的調(diào)控作用及其機制進行深入的臨床研究。PI3K/AKT信號通路具有“抗凋亡途徑”之稱，PAKT即為介導(dǎo)該途徑的關(guān)鍵分子，本研究即通過兩種不同含血停搏液的應(yīng)用，觀察各自對未成熟心肌保護作用與磷酸化AKT的相關(guān)性，為CABC在未成熟心肌保護應(yīng)用方面提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2012年10月至2015年6月在深圳市兒童醫(yī)院心血管中心行CPB術(shù)的先天性心臟病患兒(年齡為12個月以下)82例，排除肝腎功能異常、腫瘤等合并癥，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，按照是否使用CABC原則分為兩組:NCABC組(A組，n=33)和CABC組(B組，n=49)，兩組基本資料(見表1)。兩組患兒均經(jīng)氣管插管行靜脈復(fù)合全身麻醉，由同一組醫(yī)生和CPB灌注師在中低溫(25～30℃)下完成心內(nèi)直視手術(shù)。

1.2 方法

1.2.1 心臟停搏液的配制方法 A組:經(jīng)氧合器將預(yù)充后的氧合血與晶體按4∶1比例混合配制成含血停搏液;B組:按血液:晶體為4∶1的比例在轉(zhuǎn)機前經(jīng)主動脈根部快速抽取血液，保持主動脈收縮壓大于等于50 mm Hg，CABC制備后經(jīng)主動脈插管補充血容量以維持循環(huán)穩(wěn)定，兩種停搏液K+濃度均為20 mmol/L，浸入冰屑液制成4℃冷停搏液備用。

1.2.2 灌注方法 兩組停搏液的灌注方法均為:升主動脈阻斷后，4℃停搏液的由主動脈根部灌入，首次劑量30 ml/kg，最初保持灌注壓40 mm Hg左右，快速灌注至心肌電活動靜止后減慢速度，降低灌注壓至30mm Hg，維持6min;間隔30min重復(fù)一次灌注，第二次劑量減半。

1.2.3 心肌取材及保存方法 分別在主動脈阻斷前和主動脈開放30 min時取右心耳30 mg左右，迅速稱重后將組織塊平放于錫紙小盒，加OCT包埋劑浸沒組織，放人盛有液氮的小杯內(nèi)，20 s后組織即迅速冰結(jié)成塊，置入－80℃冰箱貯存?zhèn)溆米霰鶅銮衅?/p>

1.2.4 心肌細胞凋亡情況及心肌組織P－AKT蛋白檢測方法 心肌細胞凋亡情況由TUNEL法檢測:切片5μm厚，割5片取一片，共取5片，嚴格按照說明書操作，最后在顯微鏡下觀察，凋亡的心肌細胞呈棕褐色或棕黃色，每張切片隨機選取6個高倍視野(× 400倍)，分別記錄凋亡心肌細胞數(shù)和心肌細胞總數(shù)，以凋亡心肌細胞數(shù)占心肌細胞總數(shù)的百分比作為凋亡指數(shù)(apoptotic index，AI)。AI=凋亡細胞數(shù)/心肌細胞總數(shù)×100%，每張片取平均數(shù)。

采用免疫組織化學(xué)法測定心肌組織P－AKT蛋白的含量，免疫組織化學(xué)法:切片方法同上，片厚5 μm，取5片，操作嚴格按照試劑說明書操作，每位患兒的切片均取一套切片不加一抗作為空白對照，最后在顯微鏡下觀察，P－AKT蛋白大部分定位于細胞質(zhì)與細胞核，陽性細胞為胞漿及胞膜內(nèi)側(cè)或細胞核呈棕黃色或棕褐色。用Image Pro Plus 6.0醫(yī)學(xué)圖像分析軟件(Media Cybernetics，美國)分析，每張切片隨機選取了5個視野，測量并計算平均光密度值，值越大，表示染色越強，陽性表達率越高，每張片取平均數(shù)。

1.2.5 心功能指標 記錄或計算術(shù)中復(fù)跳時間、復(fù)跳率、術(shù)后2 h左心室Tei指數(shù)、心臟指數(shù)(CI)、左心室射血分數(shù)(LVEF)和正性肌力藥物依賴情況、術(shù)后24 h心律失常發(fā)生情況等。其中復(fù)跳時間為從主動脈開放后至心臟復(fù)跳轉(zhuǎn)為竇性節(jié)律的時間;以常規(guī)二維心臟超聲用Simpson法測術(shù)后2 h安靜狀態(tài)下LVEF和CI;采用 SIEMENS Acuson Sequoia 512型超聲診斷儀，探頭頻率6.0MHZ，Tei指數(shù)= (左心室等容收縮時間+左心室等容舒張時間/射血時間;Simpson法檢測相關(guān)數(shù)據(jù)，并計算 LVEF。LVEF=(左心室舒張末容積－左心室收縮末容積/左心室舒張末容積)x 100%。每一個指標連續(xù)記錄3個心動周期，取其平均值;心律失常包括陣發(fā)性室上性心動過速、頻發(fā)房性早搏、Ⅱ°以上房室傳導(dǎo)阻滯、室性早搏、室顫等。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)用均數(shù)士標準差(±s)表示，兩組間均數(shù)采用t檢驗，計數(shù)數(shù)據(jù)用X2檢驗，相關(guān)性用Pearson相關(guān)分析，采用雙側(cè)檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料 術(shù)后24 h內(nèi)無死亡病例，所有患兒均成功納入統(tǒng)計，兩組患兒臨床資料比較均無顯著性差異(P＞0.05)，見表1。

2.2 兩組心肌細胞凋亡情況及心肌組織P－AKT蛋白檢測方法的比較 主動脈阻斷前心肌組織PAKT和組織細胞AI均無顯著差異(P＞0.05);主動脈開放30 min后，兩組心肌組織的P－AKT和AI均顯著升高(P＜0.05)，B組 P－AKT顯著高于A組(P＜0.05)，B組AI顯著底于A組(P＜0.05)(見圖1～2及表2)。

表1 兩組患者臨床資料的比較

表2 兩組心肌組織凋亡情況及心肌組織P－AKT蛋白的比較(±s)

表2 兩組心肌組織凋亡情況及心肌組織P－AKT蛋白的比較(±s)

AI(%) P－AKT(IOD/μm2)組別主動脈阻斷前 主動脈開放30 min 主動脈阻斷前 主動脈開放30 min A組(n=33) 26.48±3.54 86.17±12.16 0.081±0.012 0.165±0.023 B組(n=49) 25.91±3.92 73.74±10.48 0.079±0.014 0.27±0.044 t值 0.16 5.35 1.13 13.88 P值 0.87 0.000 0.26 0.000

圖1 TUNEL法檢測兩組心肌細胞凋亡(×400)。

圖2 免疫組化法檢測心肌細胞P－AKT蛋白表達(×400)。

表3 兩組術(shù)中及術(shù)后心功能相關(guān)指標的比較(±s)

表3 兩組術(shù)中及術(shù)后心功能相關(guān)指標的比較(±s)

例數(shù) 復(fù)跳時間(s) Tei指數(shù) CI［L/(min·m2)］ LVEF(ms) 正性肌力藥物依賴情況［n(%)］術(shù)后24 h心律失常發(fā)生率［n(%)］A組(n=33) 86.22±25.44 0.45±0.14 2.84±0.55 45.43±5.43 12(36.36) 1(3.03) B組(n=49) 69.18±19.27 0.38±0.11 3.12±0.37 52.15±7.12 13(26.53) 1(2.04) χ2/t值 2.98 2.17 2.54 5.90 0.90 0.08 P值 0.01 0.03 0.01 0.00 0.46 0.77

2.3 術(shù)中及術(shù)后心功能相關(guān)指標的比較 兩組術(shù)中的復(fù)跳率均為100%，復(fù)跳時間、術(shù)后2 h左心室Tei指數(shù)、CI、LVEF、正性肌力藥物依賴情況及術(shù)后24 h心律失常發(fā)生率等均有顯著差異，B組顯著優(yōu)于A組(P＜0.05)，見表3。

2.4 相關(guān)性分析 術(shù)后心肌組織P－AKT表達量與復(fù)跳時間、AI及Tei指數(shù)負相關(guān)(r=－0.11，P=0.04; r=－0.47，P=0.00;r=－0.14，P=0.02);與LVEF及CI正相關(guān)(r=0.38，p=0.001;r=0.31，P=0.01)。

3 討論

冷血停搏液是冷晶體停搏液與氧合血混合而成，特點是含高鉀離子與鎂離子，導(dǎo)致心肌細胞內(nèi)鈉離子內(nèi)流速度減慢，使心肌細胞發(fā)生動作電位減慢或傳播停止，心臟停跳于舒張狀態(tài)。與晶體液相比，含血停搏液具有含氧、補充能量、血漿蛋白保持較高的膠體滲透壓，血細胞還具有緩沖能力和抗氧自由基作用等優(yōu)點［6－7］，是目前臨床最常用的心肌保護液。但NCABC則需經(jīng)氧合管道，與非生物材料接觸后釋放大量炎性因子等損傷心肌的物質(zhì)，本中心取自患者自身動脈血自行制備而成冷CABC不僅避免了上述心臟停搏液的弊端，還可以使心臟停搏前出現(xiàn)短時間的全身器官缺血預(yù)適應(yīng)［5，8－9］。經(jīng)本中心初步研究［10－11］表明:CABC有利于嬰兒體外循環(huán)直視手術(shù)心臟功能恢復(fù)，對未成熟心肌有良好的保護作用;對嬰幼兒心肌有良好保護效果可能與降低心肌細胞氧自由基的產(chǎn)生有關(guān)。2010年沈定榮等［12］進一步發(fā)現(xiàn):冷CABC可減輕缺血對未成熟心肌細胞線粒體的損傷，減少心肌損傷物質(zhì)的釋放，CABC比NCABC與HTK液能更好地保存心肌細胞能量，減輕心肌損傷，對心臟具有較好的保護作用。至目前，本中心CABC對未成熟心肌細胞凋亡影響的信號機制研究尚未開展，亦未見有相關(guān)報道。

為明確CABC對未成熟心肌細胞生存的影響機制，本研究組應(yīng)用NCABC和CABC在對未成熟心肌保護作用的探討中發(fā)現(xiàn):在主動脈阻斷前，兩組患兒的未成熟心肌組織P－AKT蛋白的含量與心肌細胞AI均無顯著差異，而在主動脈開放30 min后，兩組均顯著升高，且 CABC組顯著高于 NCABC組。CABC組患兒心肌細胞AI顯著底于NCABC組的患兒。AKT能直接磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控這些轉(zhuǎn)錄因子，可以抑制凋亡基因的表達和增強抗凋亡基因的表達，從而促進細胞的存活，如，轉(zhuǎn)FKHRLl、NF－kB和Bcl－2基因［13－16］，這些基因與許多細胞因子和生長因子引起的細胞分化、凋亡和生存有關(guān); AKT還可以通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase9、Forkhead、mTOR、Par－4、P21等，從而調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡［17－18］，本結(jié)果表明CPB心臟直視術(shù)對心肌組織細胞具有明顯的損害，造成心肌細胞凋亡，而CABC比NCABC能更好的保護心肌組織細胞，減少凋亡。在患兒心功能的檢測中發(fā)現(xiàn)兩組的復(fù)跳時間、術(shù)后2 h左心室Tei指數(shù)、CI、LVEF、正性肌力藥物依賴情況及術(shù)后24 h心律失常發(fā)生率等均有顯著差異，應(yīng)用CABC的患兒心功能較好，表明兩種心臟停搏液對心臟功能的保護具有差異，而CABC的心臟功能保護效果顯著優(yōu)于NCABC。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn):心肌組織的P－AKT蛋白水平與復(fù)跳時間、心肌細胞AI、Bax/Bcl－2比值及Tei指數(shù)負相關(guān);與LVEF及CI正相關(guān)，心臟功能受損與心肌細胞凋亡有關(guān)，心肌細胞凋亡是心臟功能惡化的因素之一［21］，此研究結(jié)果表明P－AKT蛋白表達與心肌細胞凋亡有關(guān)，CABC對心臟功能的保護作用可能通過調(diào)節(jié)P－AKT蛋白的表達，減少心肌細胞凋亡，保護心肌組織，減輕心臟功能障礙的程度。

CABC應(yīng)用于未成熟心肌保護在本院雖然已經(jīng)應(yīng)用多年，并且取得了良好的臨床應(yīng)用效果，但為了更廣泛的應(yīng)用及其應(yīng)用方法的進一步創(chuàng)新，其心肌保護機制需要深入的研究探討，本文的未成熟心肌保護作用與磷酸化AKT的相關(guān)性研究是CABC與PI3K/AKT通路研究的初步結(jié)果，而CABC與PI3K/ AKT信號介導(dǎo)的心肌細胞保護的詳細調(diào)節(jié)機制需要進一步研究探討。

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Research on correlation between the protection effect of cold autologous blood cardioplegia solution to immaturem yocardium and the P－AKT

Ma Chao，Zhang Qing，Shen Ding－rong，Wang Yuan－xiang，Peng Le，Meng Bao－ying，Ti Yun－xing，Ding Yi－qun
Cardiovascular Center，Shenzhen Children＇s Hospital，Shenzhen Guangdong，518026，China

Objective To explore the correlation between the protection effectof cold autologous blood cardioplegia solution to immaturemyocardium and the phosphorylated protein kinase B(P－AKT).M ethods 82 infantswith cyanotic congenital heart disease undergoing cardiac surgery were random ly divided into cold non－autologous blood cardioplegic solution(A)group(n=33)and cold autologous blood cardioplegic solution group(B)group(n=49).The right auricle tissue was taken before the aortic cross－clamping and 30 minute after the aortic cross－clamping to detectmyocardial cell apoptosis and calculate the apoptosis index(AI)with TUNEL method，and to detect the phosphorylated AKT(P－AKT)with the immunohistochemicalmethod.The auto－beating time and rate during operation，the left ventricularmyocardial performance index(Tei Index)，the cardiac Index(CI)，left ventricular ejection fraction (LVEF)，positive inotropic drug administration 2 hs postoperatively，and the incidence rate of cardiac arrhythmia 24 hs postoperatively of all patientswere recorded.Results There was no significant difference on the levels of P－AKT and AI before the aortic crossclamping between 2 groups(P＞0.05)，while all significantly elevated 30minutes after the aortic cross－clamping(P＜0.05).There were significant differences on the auto－beating time，left ventricular Tei index，CI，LVEF and positive inotropic drug administration 2 hs postoperatively，the incidence rate of cardiac arrhythmia 24 hs postoperatively between two groups(P＜0.05).The level of P－AKT in myocardial tissue was negatively correlated with AI，auto－beating time and Tei index(P＜0.05)，positively correlated with the LVEF and CI(P＜0.05).Conclusion Compared with cold non－autologous blood cardioplegic solution，cold autologous blood cardioplegic solution can promotemyocardial p－AKT protein expression，reducemyocardial cell apoptosis，and has better protective effects for immaturemyocardium.

Cold autologous blood cardioplegic solution;Infant;Congenital heart disease;Protein kinase B/AKT

2016-07-11)

2016-09-01)

10.13498/j.cnki.chin.j.ecc.2017.01.02

深圳市科技計劃項目(201303069)

5180026廣東深圳，深圳市兒童醫(yī)院心血管中心

82例行體外循環(huán)術(shù)的先天性心臟病嬰兒隨機分為:非自體冷血停搏液(A)組33例和自體冷血停搏液(B)組49例。阻斷前和主動脈開放30 min取右心耳組織，TUNEL法檢測心肌細胞凋亡情況，計算凋亡指數(shù)(AI);免疫組織化學(xué)法測定心肌組織磷酸化AKT(P－AKT)，記錄術(shù)中復(fù)跳時間、復(fù)跳率、術(shù)后2 h左心室心肌運動指數(shù)(Tei指數(shù))、心臟指數(shù)(CI)、左心室射血分數(shù)(LVEF)和正性肌力藥物依賴情況、術(shù)后24 h心律失常發(fā)生率等。結(jié)果 主動脈阻斷前心肌組織P－AKT和AI均無顯著差異(P＞0.05);主動脈開放30 min后，兩組心肌組織的P－AKT和AI均顯著升高(P＜0.05)，B組P－AKT顯著高于A組(P＜0.05)，B組AI顯著底于A組(P＜0.05)。兩組的復(fù)跳時間、術(shù)后2 h左心室Tei指數(shù)、心臟指數(shù)(CI)、LVEF、正性肌力藥物依賴情況及術(shù)后24 h心律失常發(fā)生率等均有顯著差異，B組顯著優(yōu)于A組(P＜0.05)。心肌組織的P－AKT水平與AI、復(fù)跳時間及Tei指數(shù)負相關(guān)(P＜0.05);與LVEF及CI正相關(guān)(P＜0.05)。結(jié)論 對于未成熟心肌，自體冷血停搏液比非自體冷血停搏液能促進心肌P－AKT組織蛋白的表達，減輕心肌細胞凋亡，對心臟具有更好的保護作用。