劉 偉, 蔣儂輝, 袁沛元, 邱燕萍, 凡 超, 楊曉燕, 向 旭

廣東省農業(yè)科學院果樹研究所, 廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點實驗室; 農業(yè)部南亞熱帶果樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室, 廣州 510640

SSR和SNP標記在荔枝遺傳育種中的應用

劉 偉, 蔣儂輝, 袁沛元, 邱燕萍, 凡 超, 楊曉燕, 向 旭*

廣東省農業(yè)科學院果樹研究所, 廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點實驗室; 農業(yè)部南亞熱帶果樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室, 廣州 510640

荔枝育種長期以來主要依賴實生選種和表型選擇，遺傳改良進展緩慢，主要源于其種質資源遺傳背景不清與品種名稱混亂、雜種早期鑒定與功能基因發(fā)掘等現(xiàn)代高效育種技術欠缺等原因，因此亟待完善荔枝分子標記輔助選擇育種技術，克服傳統(tǒng)育種技術障礙，為荔枝遺傳改良提供新的技術支撐。對近年來荔枝SSR和SNP兩類特異性強的分子標記應用于種質親緣關系研究、核心種質構建、種質精準鑒定與分子條碼構建、真假雜種鑒別以及遺傳圖譜構建方面的進展進行了綜述，以期為荔枝特異性分子標記在育種中的應用提供理論及實踐參考。

荔枝；特異性分子標記；分子標記輔助選擇；育種應用

我國是荔枝(LitchichinensisSonn.)原產國，同時也擁有世界上最豐富的荔枝種質資源，早在20世紀《荔枝志》就記載有222份[1]；截至目前，據不完全統(tǒng)計，總數應已超過500份，這是其他國家無法比擬的優(yōu)勢。但是，在全國20多個主栽品種中品質一般的品種(“黑葉”、“白蠟”、“大造”、“雙肩玉荷包”、“妃子笑”、“懷枝”等)占比過大，且成熟期集中，從而導致季節(jié)性過剩和價格長期低迷等產業(yè)難題。種質資源是品種改良的基礎，如何予以高效利用是業(yè)界的普遍難題，更是荔枝產業(yè)可持續(xù)發(fā)展最關鍵的制約因素。近十年來荔枝產業(yè)發(fā)展陷入低谷，均與育種技術落后、新品種選育跟不上市場的需求明顯相關，荔枝品種結構調整的任務緊迫而繁重。

迄今為止，荔枝品種改良的歷史主要是實生選種的歷史，較少開展有目的的人工雜交育種，更是缺乏通過基因工程進行目標性狀改良。由于荔枝樹極其長壽，幾百上千年的老樹古樹在產區(qū)較為普遍，且歷史上(1950年以前)荔枝栽培多以播種自然授粉種子為主，現(xiàn)存的大量實生群體為近幾十年來的新品種選育提供了豐富的素材，但是，荔枝遺傳改良不可能始終依靠傳統(tǒng)育種資源；著眼未來，隨著消費者新的需求和市場的變化，探索新的技術手段并應用于創(chuàng)造實生選種無法選育出的新品種，既是時代的要求，也是歷史發(fā)展的必然趨勢。

現(xiàn)有荔枝種質資源的遺傳背景不清與品種名稱混亂極大地阻礙了育種的進程。首先，現(xiàn)有荔枝種質之間缺乏系譜關系的記載，選擇親本時盲目性強、無從下手；其次，常見的同名異物或同物異名等現(xiàn)象，也給生產應用帶來諸多不便。荔枝的育種周期長，親本選擇不慎就有可能使育種者一無所獲，因此，荔枝育種工作中一直存在著如何高效評價和選擇雜交親本的問題。然而，荔枝種質資源的遺傳背景不清與品種名稱混亂，一開始就為育種者設置了天然屏障，不論是親本選擇，還是育種目標，均具有較大的盲目性。

困擾荔枝育種的另一個主要問題是缺乏對雜種后代進行早期鑒定的有效手段。荔枝樹是喬木，童期長，一般從種子播種到開花需要8～15年，而且占地面積大，培育雜交實生苗的成本極高。目前，形態(tài)特征性狀觀察仍然是雜種后代早期鑒定的主要方法[2]，實踐表明該方法效率低、可靠性差，因此迫切需要更有效的早期鑒定手段。

上述問題的解決首先要明確種質間的遺傳差異，這需要有高效可靠的分子標記及相應的檢測技術。近十多年來，盡管多種分子標記已經在荔枝上得到了廣泛的應用，如RAPD[3～6]、AFLP[7,8]、ISSR[9]和SRAP[10,11]等。但是，由于前述類型分子標記特異性不強、穩(wěn)定性欠佳，再加上取材的局限，分析結果差異較大，總體研究進展緩慢，缺乏提升荔枝育種技術的實際成果及其應用。SSR(simple sequence repeat)和SNP(single nucleotide polymorphism)是近年來獲得廣泛應用的兩類特異性強的分子標記。本文綜述了SSR和SNP分子標記在荔枝遺傳育種中的應用進展，以期為荔枝遺傳育種研究提供參考。

1 SSR和SNP分子標記簡介

SSR是廣泛分布于真核生物基因組中的一種特殊序列，主要由串聯(lián)重復單元組成，其核心單位由1～6個核苷酸組成，串聯(lián)重復的數目可變且呈現(xiàn)出高度多態(tài)性[12]。SSR標記具有數量豐富、多態(tài)性高、重復性好和共顯性等優(yōu)點[13]。

SNP是單核苷酸多態(tài)性的簡稱，主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性[14,15]，目前被業(yè)界公認為最新一代分子標記。DNA 上單個堿基變異導致的SNP是生物基因組中最普遍存在的遺傳多樣性，由不同位點上SNP構成的組合更是不可勝數，因此，SNP更適合作為物種或品種鑒定采用的DNA 分子標記。

2 SSR和SNP標記在荔枝遺傳育種中的應用

2.1 荔枝種質親緣關系研究

理清荔枝種質的親緣關系，對于育種工作中最優(yōu)親本組合的選配具有重要意義。關于荔枝的分類，以前一直限于形態(tài)學性狀，普遍采用吳淑嫻[1]提出的方法，即以成熟果實中部果皮上龜裂片和裂片峰的主要特征作為分類標準，把全國的荔枝品種分為3大類型：果皮龜裂片尖突類型、果皮龜裂片隆起類型和果皮龜裂片平坦類型，但這一分類體系在準確反映親緣關系方面還是存在不足[4]。

研究者們按親緣關系對荔枝品種的分類進行了較多研究。Viruel[16]利用12對基因組SSR引物對21份荔枝品種進行親緣關系分析，將其分為兩大類群：古老品種和現(xiàn)代品種；姚慶榮等[17]利用22對多態(tài)性基因組SSR引物對22份海南荔枝種質資源進行擴增，供試材料被聚為兩大類；傅嘉欣等[18]利用27對基因組SSR引物對47份荔枝品種進行了遺傳多樣性分析，供試品種被分為3大組，且分組結果與成熟期性狀具有較好的一致性；Madhou[19]利用12對基因組SSR引物對34份荔枝種質進行分析，34份材料被分為9大支；向旭等[20]利用30對EST-SSR(expressed sequence tag-SSR)核心引物對96份荔枝種質進行親緣關系的研究，將96份荔枝種質劃分為8個類群，在很大程度上與地理起源和成熟期相關；Liu等[21]利用155對SNP標記，對96份荔枝種質進行SNP分型，基于SNP標記的UPGMA聚類結果表明，荔枝種質的親緣關系和成熟期具有很好的一致性，分為特早熟、早熟、中熟和晚熟4大類，表明應將成熟期作為荔枝種質分類的首要標準。

2.2 荔枝種質精準鑒定

荔枝存在著嚴重的同名異物和同物異名的問題[22]，既不利于標準化栽培技術的推廣應用和品種優(yōu)良特性的發(fā)揮，也不利國際交流與貿易的正常開展；此外，荔枝種苗的純正性鑒定以及品種知識產權保護等也缺乏科學的手段。荔枝早在我國兩千多年前就有種植，隨著自然的演化及人為的影響，形成了豐富的荔枝種質資源。單從形態(tài)學上對荔枝進行命名缺乏統(tǒng)一的標準，且由于引種及傳播過程的無序加重了同名異物以及同物異名現(xiàn)象的發(fā)生。對這些豐富而又雜亂的荔枝種質資源進行整理、鑒定和歸類，特別是在追求育種效率又提倡保護品種知識產權的今天就顯得更加必要和迫切。

Madhou[19]利用12對基因組SSR引物對34份荔枝種質進行基因分型，發(fā)現(xiàn)其中10份名為“Tai So”的材料盡管在表型上存在差異，但SSR譜帶完全一致，表明它們是同一品種，其表型差異應該是由環(huán)境引起而非遺傳上的差異；同樣，四川的“絳紗蘭”和廣東的“黑葉”相似性系數為1.0，即兩者之間不存在差異，應該是同物異名[18]；研究者們分別利用34對EST-SSR和21對EST-SNP核心標記分析全面代表荔枝種質資源豐富性的384份荔枝種質，發(fā)現(xiàn)其中7份材料存在同物異名的現(xiàn)象，另有32份材料存在同名異物的問題，如來自廣東的“黑葉”和福建的“烏葉”其遺傳相似系數為1.0，推測為同物異名，來自福建和廣東的“下番枝”，廣西和廣東的“錦鐘”，廣西和廣東的“四兩果”實為不同的品種，應該是同名異物[23,24]。

2.3 荔枝種質分子條碼(指紋)構建

現(xiàn)代農業(yè)已經發(fā)展到了分子農業(yè)與精細農業(yè)的新時代，為荔枝種質構建分子條碼(指紋)，既是荔枝產業(yè)現(xiàn)代化、標準化生產的需要，也是荔枝產業(yè)國際化和貿易現(xiàn)代化的標志，因此，構建荔枝種質分子條碼(指紋)作為品種純正化與生產標準化的前提，應成為產業(yè)現(xiàn)代化的基石。

傅嘉欣等[18]從27對基因組SSR引物中選取2對多態(tài)性高、重復性好、分辨率高的引物作為基準引物，結合這2對引物的29個多態(tài)性位點構建了36份材料的DNA指紋圖譜；白麗軍等[25]篩選了多態(tài)性類型差異清晰可辨的9個EST-SSR標記，用于對96份荔枝種質資源構建分子指紋，可將絕大多數種質區(qū)別開來，但從“桂味”品種選出的“桂花一號”和“桂花二號”相互之間分子指紋無差異，因此此類型分子指紋尚存在明顯缺陷，有待改進和完善；Liu等[21]發(fā)現(xiàn)了14個多態(tài)性較高的SNP位點，其可以作為85份荔枝種質的分子條碼，并證明同一品種的不同個體在這14個SNP位點上都表現(xiàn)出相同的基因型，不因產地的不同而改變，從而確認了這14個SNP位點作為荔枝種質分子條碼的可靠性。

2.4 荔枝核心種質構建

荔枝核心種質構建是加快優(yōu)稀種質資源利用與育種進程的關鍵。核心種質是初始群體庫的一個核心子集，需要具備最小的遺傳冗余，所以必須用最少的樣品數最大限度地保留原始群體的遺傳多樣性[26,27]。如何正確評價不同材料間的遺傳相似性是正確構建核心種質的前提，而確定合適的取樣方法和取樣比例則是構建核心種質的重要環(huán)節(jié)。

白麗軍[25]利用30對核心EST-SSR標記對96份荔枝種質資源開展核心種質的初步篩選，用3種相似系數Dice、SM和Jaccard進行聚類，然后采用位點優(yōu)先法進行抽樣，綜合考慮后選取了29個樣品(比例30.2%)作為核心種質，經3種相似系數下構建的核心種質和原種質的遺傳多樣性比較和t檢驗，3種核心種質都能很好的代表原種質的遺傳多樣性，而Dice和Jaccard的代表性較SM要更好，除此之外，采用主坐標法對3種核心種質的代表性進行確認，初步結果表明核心種質遍布整個坐標圖，用此方法構建核心種質是可行的。Sun等[28]與多個表型性狀相結合證實了白麗軍[25]的結果；馬文朝[29]利用34對核心EST-SSR引物對384份荔枝種質資源進行遺傳分析構建核心種質庫，首先采用UPGMA法進行聚類，根據聚類結果，用位點優(yōu)先與逐步聚類相結合的方法構建荔枝核心種質，結果表明，取樣比例為8.98%時(33份種質)所構建的核心種質對原種質各項參數的保留率基本都達到了100%以上，符合核心種質的構建要求，且所構建的核心種質不僅在分子水平上差異較大，在表觀生態(tài)學上差異也比較明顯，具有代表性和異質性。

2.5 荔枝真假雜種鑒別

由于荔枝為高大喬木，授粉條件控制難度較大，如品種間串粉、去雄或套袋不及時等原因，造成真假雜種苗混雜的現(xiàn)象，因此，荔枝雜交育種工作中存在真假雜種的鑒別問題。

孫清明等[30]以“雪懷子”ד桂味”和“雪懷子”ד焦核三月紅”兩個雜交群體的F1代為材料，利用EST-SSR標記進行真假雜種鑒定，真雜種判定標準為至少兩對EST-SSR引物擴增譜帶中出現(xiàn)父本特征譜帶或雙親互補特征譜帶，分別采用4對在“雪懷子”和“桂味”及“雪懷子”和“焦核三月紅”間能產生差異譜帶的引物組合即實現(xiàn)了所有雜交后代的鑒定，結果表明兩個雜交群體的159個F1單株均為真雜種；田婉瑩等[31]利用5對SSR標記和3對Indel標記引物，從11個雜交組合的2 317株F1代中鑒定出真雜種1 666株，結果顯示，不同組合雜交效率存在差異，平均真雜種率為71.9%，發(fā)現(xiàn)了可用于8個組合后代真雜種鑒定的5個純合顯性標記；鮑秀麗等[32]利用 155對SNP標記對2011年構建的“白糖罌”ד禾蝦串”、“禾蝦串”ד白糖罌”，以及2013年構建的“白糖罌”ד禾蝦串”，“白糖罌”ד無核荔”共4個雜交群體開展了真假雜種的鑒定，首先利用155個SNP位點對雜交父母本進行質譜分型，篩選在父母本之間表現(xiàn)為不同純合基因型的SNP位點，針對獲得的雜交親本之間純合共顯性SNP 位點，進一步設計了HRM分型引物，對相應雜交組合的后代進行HRM分型，真雜種判定標準為在相應SNP位點上表現(xiàn)雜合基因型或者父本基因型，按照這一標準成功地進行了所有雜交苗后代的鑒定。

2.6 荔枝遺傳圖譜構建

遺傳圖譜是某一染色體上標記或基因的線型排列，是利用多態(tài)性的遺傳標記對研究的家系進行遺傳連鎖分析而得到的反映基因組遺傳結構的圖譜。利用分子標記構建遺傳圖譜是基因定位、克隆和分子標記輔助選擇的基礎。

荔枝的遺傳連鎖圖譜也在發(fā)展和完善中，尤以華南農業(yè)大學園藝學院劉成明課題組的貢獻較大；劉成明[4]以“馬貴荔”ד焦核三月紅”F1群體為作圖群體，構建了母本“馬貴荔”的分子遺傳連鎖圖譜，也是荔枝的第一張遺傳連鎖圖譜；劉睿[33]進一步采用RAPD技術，分別構建了父本和母本的遺傳連鎖圖譜，此研究首次獲得了父本“焦核三月紅”的遺傳連鎖圖譜；之后的研究者們[11，34，35]采用AFLP和SRAP技術，結合已獲得的RAPD標記[4，33]，分別構建了父、母本的分子遺傳圖譜。

馬文朝[29]利用EST-SSR標記，并整合劉成明課題組已建立的“馬貴荔”ד焦核三月紅”遺傳連鎖圖譜，進一步提高圖譜的密度。首先利用“馬貴荔”和“焦核三月紅”對合成的784對EST-SSR引物進行篩選，共得到242對在雙親上具有多態(tài)性的引物；利用初選的242對引物進行作圖群體的電泳檢測，最終在140對引物中得到了215個分離位點，其中父本特有位點69個，母本特有位點85個，雙親共有位點61個；根據引物在雜交群體的擴增情況并進行讀帶統(tǒng)計，然后整合劉成明課題組已繪制的遺傳連鎖圖譜，利用JoinMap 3.0軟件構建新的遺傳連鎖圖譜，共有87個標記進入8個連鎖群，作圖效率為44.2%，覆蓋總圖距為683 cM，連鎖群的平均長度為85.4 cM，標記間的平均距離為7.85 cM，平均每個連鎖群包含10.9個標記。

3 展望

迄今為止，荔枝種質資源利用與新品種選育仍然依靠表型選擇與實生或芽變選種的傳統(tǒng)方法，其遺傳改良舉步維艱與育種新技術發(fā)展緩慢關系密切。理清荔枝種質親緣關系、實現(xiàn)種質的精準鑒定、構建核心種質、準確開展雜種鑒別均是提高荔枝遺傳改良效率的先決條件，同時，上述技術的突破也將提高荔枝優(yōu)稀種質基因資源的發(fā)掘與創(chuàng)新利用的效率，促進遺傳改良的進程。盡管多種分子標記已經在上述研究領域獲得了一定的應用，但是，由于前述類型分子標記的局限，今后應重點開發(fā)SSR和SNP標記，同時，應盡可能把標記定位到染色體圖譜上，在高密度遺傳圖譜基礎上重點篩選均勻分布的標記，提高分子標記的代表性與特異性；在分析選材上則盡可能多的收集重點野生荔枝發(fā)現(xiàn)區(qū)域(云南、海南、廣西、廣東)的野生和半野生種質，克服樣品代表性與一致性的缺陷。

目前，制約荔枝分子標記輔助選擇育種技術突破的主要因素還在于雜交群體偏少，尤其是適合進行分子遺傳圖譜構建的作圖群體太少，無法開展各種性狀的遺傳分離規(guī)律研究，一方面使我們對不同性狀遺傳力的認識缺失，另一方面也較難篩選與目標性狀(如焦核或無核、大果、優(yōu)質、特早熟或特遲熟、特殊風味等性狀)緊密連鎖的分子標記，從而妨礙了分子標記輔助選擇育種技術的實質性突破。今后的雜交育種應重視雜交親本的選配，以荔枝種質親緣關系研究的結果為依據，結合表型性狀的差異，選擇最佳的親本組合進行雜交育種，建立起足夠大的作圖群體，構建高密度分子遺傳圖譜，定位重要農藝性狀的主效QTL及其緊密連鎖的分子標記，為荔枝的分子標記輔助育種奠定基礎。

除QTL作圖外，關聯(lián)分析則是發(fā)掘性狀相關位點和功能基因的另一重要策略。因此，要充分利用好荔枝全基因組測序和重測序數據，同時利用我國豐富的荔枝種質資源這個自然群體，以前期初步構建的核心種質為依據，或重新構建更完善合理的荔枝核心種質庫，通過應用全基因組關聯(lián)分析進行性狀關聯(lián)位點及功能基因的發(fā)掘，為荔枝遺傳改良及分子育種提供關鍵的基因資源和早期選擇標記，克服傳統(tǒng)育種技術障礙，加快遺傳改良和新品種選育的進程，促進產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

截至目前，荔枝新品種認定與審定除性狀特異性外，僅要求其遺傳穩(wěn)定性與一致性，尚未在分子標記鑒定與分子條碼上進行規(guī)范。但是，性狀表型的特異性受環(huán)境影響較大，環(huán)境變化導致基因表達的差異，容易發(fā)生誤判；品種的遺傳背景，也就是基因型的差異，才是品種間的本質差異。荔枝新品種推廣育苗主要是通過嫁接和圈枝，由于是無性繁殖，荔枝品種極易脫離育種者的掌控而被大量盜用，而且品種及種苗的純正性在生產上也容易產生爭議。因此，不論從新品種保護與知識產權的角度還是新品種推廣的角度，都亟需建立分子標記鑒定的標準化技術與分子條碼。因此，分子標記鑒定與分子條碼應逐漸規(guī)范化成為新品種認定的手段和工具。

近年來，荔枝全基因組測序與代表性種質重測序工作的完成，為荔枝特異性分子標記的大規(guī)模研發(fā)，并應用于育種實踐奠定了堅實的基礎，也是最佳的機遇期。

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Application of SSR and SNP Molecular Marker in Litchi Breeding

LIU Wei, JIANG Nonghui, YUAN Peiyuan, QIU Yanping, FAN Chao, YANG Xiaoyan, XIANG Xu*

GuangdongProvincialKeyLaboratoryofTropicalandSubtropicalFruitTreeResearch;KeyLaboratoryofSouthSubtropicalFruitBiologyandGeneticResourceUtilization,MinistryofAgriculture;InstituteofFruitTreeResearch,GuangdongAcademyofAgriculturalSciences,Guangzhou510640,China

Litchi breeding has been mainly resort to seedling selection and phenotype selection for a long term. Considerable difficulties in the initial stage and slow progress of genetic improvement in litchi were mainly due to its unclear genetic background of germplasm, chaos of cultivar name, lack of high efficient modern technology such as early identification of hybrids and functional gene exploration. It is urgent to develop and improve marker-assisted breeding in litchi, so as to overcome the obstacles of traditional breeding and provide new technical support for genetic improvement in litchi breeding. In this paper, we summarized the application of litchi SSR and SNP, two kinds of specific molecular marker, on germplasm genetic relationships analysis, core collection construction, germplasm accurate identification and molecular barcode construction, hybrid identification, as well as genetic map construction. The paper was expected to provide theoretical and practical reference for the breeding application of specific molecular markers in litchi.

litchi; specific molecular markers; molecular marker-assisted selection; application in breeding

2016-06-01; 接受日期：2016-08-02

國家自然科學基金項目(31272135;31401829)；廣東省自然科學基金項目(2014A030310467)；廣東省省屬科研機構競爭性支持類項目(2014B070706018)；現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項資金 (nycytx-32)資助。

劉偉，助理研究員，博士，主要從事荔枝生物技術育種研究。E-mail:liuwei1987ahnu@126.com。*通信作者：向旭，研究員，博士，主要從事荔枝種質資源利用與新技術育種研究。E-mail:xiangxu@vip.163.com

10.3969/j.issn.2095-2341.2017.01.02