遲春寧 丁國華

（哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 植物生物學(xué)黑龍江省高校重點實驗室，哈爾濱 150025）

植物耐重金屬的分子生物學(xué)研究進(jìn)展

遲春寧 丁國華

（哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 植物生物學(xué)黑龍江省高校重點實驗室，哈爾濱 150025）

重金屬污染對我國經(jīng)濟發(fā)展、人身健康造成重大負(fù)面影響，已經(jīng)成為當(dāng)今研究熱點。綜述了近年來重金屬對植物的毒害及植物耐性機制等方面的研究進(jìn)展，主要包括金屬對植物的生長發(fā)育影響，植物抵抗重金屬毒害的防御方式及抵抗重金屬脅迫的相關(guān)基因和蛋白等，旨在為該領(lǐng)域的相關(guān)研究提供資料和借鑒。

重金屬；植物；耐受性；分子機制

在過去的幾十年中，由于礦石開發(fā)、工業(yè)“三廢”的排放和農(nóng)業(yè)上大量化肥、農(nóng)藥的施用，土壤中重金屬的污染已經(jīng)成為一個嚴(yán)重的環(huán)境問題［1］。農(nóng)作物從土壤中攝取重金屬并在植物體內(nèi)積累，影響了作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，更為嚴(yán)重的是通過食物鏈進(jìn)入人體，影響人類健康［2］。作為固著生長的生物，植物只能從土壤中吸收生長發(fā)育所需的營養(yǎng)物質(zhì)［3］，同時也將那些存在于土壤中的重金屬吸收進(jìn)體內(nèi)，對其代謝產(chǎn)生嚴(yán)重影響。植物通過不斷的進(jìn)化和環(huán)境選擇，產(chǎn)生了一系列耐受機制，降低了重金屬對植物的毒性。本文將對近年來開展植物耐重金屬脅迫的分子機理方面的研究進(jìn)行綜述，旨為該領(lǐng)域的相關(guān)研究提供資料。

1 重金屬對植物的影響

有些重金屬對植物的生長是必需的，如銅和鋅，但屬于微量必需元素，植物吸收超量就會有毒害作用，引起代謝紊亂，生長受阻［4］。銅（Cu）的毒性是增強活性氧的產(chǎn)生能力，進(jìn)一步導(dǎo)致植物生長發(fā)育遲緩，減少根的萌發(fā)和側(cè)根的產(chǎn)生。Llorens等［5］研究表明，當(dāng)大豆暴露于過量銅就會破壞氮的代謝和固定，從而造成大豆的減產(chǎn)。鋅（Zn）毒性的主要癥狀是萎黃病和葉片變紅，在葉上出現(xiàn)壞死棕色斑點，伴隨著發(fā)育不良和減產(chǎn)，也抑制主根的生長和側(cè)根的出現(xiàn)。高濃度的鋅還會取代PSII反應(yīng)中鎂（Mg），因此會破壞光系統(tǒng)和電子傳遞鏈［6］。Ren等［7］研究表明在菠菜屬中質(zhì)體ATP綜合體也受到Zn毒限制，影響了植物的正常生長。

土壤中存在的非必需元素也會影響植物的生長發(fā)育。鎘（Cd）和鉛（Pb）因為容易被植物吸收，可以很容易地進(jìn)入食物鏈，是危害人類健康最嚴(yán)重的重金屬。在根部細(xì)胞，Cd造成水和營養(yǎng)物吸收的不平衡，干擾鈣（Ca）、鎂（Mg）、鉀（K）和磷（P）的吸附，抑制根部酶類所涉及的營養(yǎng)物的新陳代謝［8］。鎘在細(xì)胞水平會干擾有絲分裂，造成染色體畸變，抑制有絲分裂進(jìn)程。DalCorso等［9］研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中，鎘誘導(dǎo)突變導(dǎo)致花香異常、胚畸形和種子萌發(fā)力弱等癥狀。鉛的毒性和其他重金屬一樣引起相似的癥狀，即抑制生長、萎蔫、死亡。Eun等［10］發(fā)現(xiàn)玉米根系吸收鉛后，會降低生長速度，干擾根分生組織的微管網(wǎng)絡(luò)的形成，導(dǎo)致臨近根尖的區(qū)域變短，分布的側(cè)根更加密集。

2 植物對重金屬的耐受機制

重金屬對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生影響，植物自身也產(chǎn)生了一系列的耐受機制。這些機制主要有：一是外排和阻止重金屬的吸收來減少其在植物體內(nèi)的含量；二是通過絡(luò)合作用和螯合作用，減少細(xì)胞中游離的金屬離子；三是通過提高抗氧化酶活性來清除活性氧和自由基。

2.1 植物對重金屬的排斥機制

植物和其他生物一樣，在生長的過程中已經(jīng)進(jìn)化出復(fù)雜的體內(nèi)平衡機制，以盡量減少重金屬的傷害。排斥機制是通過阻止重金屬離子進(jìn)入植物體，來防止重金屬離子在細(xì)胞內(nèi)積累，從而減小傷害。植物通過以下兩道防線來排斥重金屬的進(jìn)入：第一道防線是植物的根部分泌如蘋果酸或檸檬酸進(jìn)入土壤，與金屬離子結(jié)合阻止根系吸收［11］；第二道防線是細(xì)胞壁和細(xì)胞外的碳水化合物，能固定有毒重金屬離子，阻止它們進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，影響細(xì)胞內(nèi)的代謝活動［12］。Carrier等［13］研究發(fā)現(xiàn)，在重金屬Cd的脅迫下，在細(xì)胞壁上出現(xiàn)Cd2+高電子密集體，Cd離子被隔離在細(xì)胞外，減少對細(xì)胞的毒害。質(zhì)膜在植物抗重金屬毒害過程中也起到了重要的作用。質(zhì)膜是原生質(zhì)體與外界環(huán)境的屏障，控制著細(xì)胞內(nèi)外的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與物質(zhì)交換，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境相對穩(wěn)定。質(zhì)膜表面具有電荷性，帶有很強的負(fù)性電荷，會與帶正電荷的重金屬離子結(jié)合，使膜對金屬離子更加敏感，重金屬離子結(jié)合在膜上從而被阻止進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。Liu等［14］利用EELS法證實含有Cd2+高電子密度的顆粒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部時被細(xì)胞質(zhì)膜包裹，以此減少細(xì)胞質(zhì)中游離Cd2+的數(shù)量，降低Cd對細(xì)胞的傷害，證明細(xì)胞膜對重金屬具有很好的敏感性。

2.2 植物對重金屬的耐受機制

金屬離子進(jìn)入細(xì)胞中產(chǎn)生活性氧，活性氧能與蛋白質(zhì)、脂類和DNA等發(fā)生反應(yīng)，引起酶活性降低、膜透性增強及突變增加等，清除活性氧是降低其對生物大分子傷害的一個重要措施。植物可以通過產(chǎn)生植物絡(luò)合素、金屬硫蛋白、氨基酸和有機酸等清除活性氧，減小活性氧對細(xì)胞的毒害［15］。

2.2.1 植物螯合肽 植物螯合肽（phytochelatin，PC）廣泛存在植物界，這種多肽不是由基因直接編碼產(chǎn)生，而是在重金屬誘導(dǎo)下，由植物螯合肽合成酶（PCS）催化谷胱甘肽合成［16］。進(jìn)入植物體內(nèi)的金屬離子可以與PC形成穩(wěn)定的螯合物隔離到液泡中，從而降低細(xì)胞內(nèi)游離金屬離子的濃度。PCS基因已從芥菜屬（BjPCS1）［17］小麥（TaPCS1）、水稻（OsPCS1）［18］和擬南芥（AtPCS1）［19］中被克隆。Gusic等［20］研究發(fā)現(xiàn)AtPCS1的表達(dá)提高了PC合成，并且增強轉(zhuǎn)基因芥菜對鎘和砷的耐性。

2.2.2 金屬硫蛋白 植物金屬硫蛋白（metallothionein，MT）是一種廣泛存在的低分子量、富含半胱氨酸和結(jié)合金屬的蛋白質(zhì)，可以通過其大量的Cys殘基螯合重金屬并清除活性氧。與PC不同的是，MT是受重金屬脅迫的誘導(dǎo)由mRNA轉(zhuǎn)錄直接合成的［21］。MT基因能夠在植物生長發(fā)育的不同階段表達(dá)，應(yīng)答不同的重金屬離子的脅迫。編碼MT的基因已經(jīng)在豌豆［22］、芥菜、煙草［23］和擬南芥［24］中克隆。通過研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中的MT2基因在Zn2+的誘導(dǎo)下表達(dá)，從而提高了植物對Zn2+的耐性［25］。

2.2.3 氨基酸和有機酸 有機酸和氨基酸中的S、N、O可以與金屬離子發(fā)生反應(yīng)，被認(rèn)為是金屬離子的配體。植物因有機酸中的檸檬酸、蘋果酸和草酸對重金屬發(fā)生螯合作用而具有一定的耐性［26］。氨基酸中的組氨酸在金屬超積累方面有重要作用，特別對Ni有很高結(jié)合力，Kr?mer等［27］研究發(fā)現(xiàn)植物暴露在Ni中時，植物的木質(zhì)部中的組氨酸的濃度增加，與Ni離子結(jié)合而降低對植物的毒害。

2.3 抗氧化酶的防御機制

活性氧（ROS）屬于自由基類的高活性氧化劑，其化學(xué)性質(zhì)非常活潑，氧化能力極強，并且極易與其他物質(zhì)反應(yīng)。植物體內(nèi)ROS不完全還原形成過氧化氫（H2O2）、超氧自由基（O2-）、羥基自由基（-OH）和分子氧的激發(fā)態(tài)（單線態(tài)氧），它們作為強氧化劑能與各種各樣的生物大分子反應(yīng)，損傷蛋白質(zhì)、核酸和膜脂等［28］。當(dāng)重金屬脅迫誘導(dǎo)下植物體內(nèi)ROS的含量升高，在細(xì)胞內(nèi)造成嚴(yán)重的氧化脅迫引起細(xì)胞損傷。研究發(fā)現(xiàn)植物體內(nèi)的抗氧化防御機制能夠保持活性氧的形成在較低的水平。植物細(xì)胞有酶類和非酶類兩種抗氧化系統(tǒng)，前者包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、谷胱甘肽還原酶（GR）和過氧化氫酶（CAT）；后者有谷胱甘肽、抗壞血酸、維生素和類黃酮等［29］。隨著重金屬的脅迫，抗氧化酶類也會增強表達(dá)提高活性，以應(yīng)對細(xì)胞內(nèi)活性氧和自由基增加而減少傷害。CAT是抗氧化系統(tǒng)中的一種關(guān)鍵酶，可以參與過氧化物酶系統(tǒng)反應(yīng)催化H2O2的分解，在脅迫下可降低H2O2的含量?，F(xiàn)已從植物體成功克隆出4種不同的CAT的基因序列，并發(fā)現(xiàn)當(dāng)受到重金屬鎘脅迫時CAT3的含量將增加［30］。用鎘處理豌豆時發(fā)現(xiàn)，鎘可使谷胱甘肽、抗壞血酸等含量降低，CAT和MDHAR（單脫氫抗壞血酸還原酶）的轉(zhuǎn)錄水平增高，但CAT的活性和含量下降，鎘的作用應(yīng)發(fā)生在翻譯后的修飾上［31］。實驗還發(fā)現(xiàn)GR和APX（抗壞血酸過氧化物酶）的活性和基因表達(dá)基本不受鎘的影響，但鎘脅迫降低CuZn-SOD的表達(dá)和活性。鎘的作用與ROS代謝及Ca2+通道、磷酸化和去磷酸化過程、一氧化氮、環(huán)腺苷酸、水楊酸及過氧化氫等信號物質(zhì)存在密切而復(fù)雜的聯(lián)系。

3 植物耐重金屬基因研究

近年來已鑒定和推測出參與重金屬響應(yīng)的眾多基因，這些基因的表達(dá)對重金屬離子在細(xì)胞中的運輸、富集以及提高植物的抗性等方面都有重要作用［32］。其中以重金屬運輸相關(guān)的蛋白基因的研究最為廣泛，主要包括ATP結(jié)合盒（ATP-binding cassette，ABC）轉(zhuǎn)運家族、鋅/鐵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運蛋白（zinc/ironregulated transporter protein，ZIP）家族、重金屬ATP酶（heavy-metal ATPases，HMAs）家族和陽離子擴散促進(jìn)者（cation diffusion facilitator，CDF）家族等，這些蛋白基因都對提高植物對重金屬的耐性有作用。

3.1 ABC轉(zhuǎn)運家族

ABC轉(zhuǎn)運家族屬于膜蛋白最大家族之一，具有種類繁多、分布廣泛、運轉(zhuǎn)物質(zhì)類型多樣等特點。各種ABC蛋白在結(jié)構(gòu)上都包含2個由4-6個跨膜片段組成的高度疏水區(qū)域（TMD）和2個外圍細(xì)胞質(zhì)的ATP結(jié)合區(qū)域或核苷結(jié)合區(qū)域（NBD）［33］。ABC蛋白主要參與多種物質(zhì)的運輸，包括離子、碳水化合物、脂質(zhì)、異生素、抗生素和重金屬等，而且一些ABC蛋白質(zhì)不僅可以直接運輸離子或其他溶質(zhì)，還具有監(jiān)管轉(zhuǎn)運的功能［34］。根據(jù)ABC蛋白上TMD和NBD區(qū)域的結(jié)構(gòu)可以將其分為3種類型：多向耐藥性蛋白（pleiotropic drug resistance，PDR）、多藥耐藥性蛋白（multidrug resistance，MDR）和多藥耐藥相關(guān)蛋白（multidrug resistance -associated proteins，MRP），這3種蛋白都與金屬離子的運輸有關(guān)。

PDR與MDRs和MRPs同樣具有兩個基本的結(jié)構(gòu)域：TMD和NBD，TMD由6個α螺旋組成，胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域有1個NBD。不同的是，MDRs和MRPs的NBD結(jié)構(gòu)域位于C末端，而PDRs相反，NBD結(jié)構(gòu)域位于其N末端［35］?，F(xiàn)已在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了PDR家族的15個成員，其中已研究分離出與重金屬脅迫相關(guān)AtPDR12和AtPDR8基因。Kim等［36］通過檢測發(fā)現(xiàn)在Cd和Pb處理下，擬南芥中AtPDR8的表達(dá)上調(diào)。AtPDR8過表達(dá)植株對鎘或鉛的耐性比野生型更高，體內(nèi)游離鎘離子濃度更低。Lee等［37］研究發(fā)現(xiàn)在Pb脅迫的擬南芥根部和嫩枝中，AtPDR12的濃度增加。過表達(dá)AtPDR12的擬南芥對Pb有很高的耐性，并比野生型積累更低的Pb；而在Pb的脅迫下atpdr12突變體植株生長較差。

MDR亞家族與MRPs和PDRs相比研究的較少，MDRs與MRPs基本結(jié)構(gòu)組成相同，但在N末端不同，在MRPs有一個大約220氨基酸組成的高度疏水的N端延伸區(qū)。而且還發(fā)現(xiàn)MDRs與植物生長素的運輸有關(guān)，限制根部細(xì)胞的生長［38］。MDRs基因已經(jīng)從擬南芥克隆，而且證實AtMDR1和AtPGP1可以外排有毒代謝物以此來抵抗有毒物質(zhì)脅迫，CjMDR1也是MDR亞家族的一個成員，可以運輸生物堿，使其在根部積累［39］。

MRP亞家族能夠廣泛運輸許多重金屬，如As、Cd、Sb、Hg和Zn等［40］。研究表明MRP在運輸中可以充當(dāng)鎘泵，參與跨液泡膜轉(zhuǎn)運GS2-Cd復(fù)合物和/或Cd2+螯合物［41］。Wojas等［42］研究發(fā)現(xiàn)，AtMRP7在煙草的異源表達(dá)定位在液泡膜和質(zhì)膜，可改變煙草對鎘的積累、分配和耐性。AtMRP7基因在液泡膜上的過量表達(dá)，產(chǎn)生的MRP轉(zhuǎn)運蛋白將鎘轉(zhuǎn)運到葉片的液泡中，提高了液泡中鎘的含量，從而減少了鎘對煙草的毒害。ABC轉(zhuǎn)運家族的種類繁多，除了以上3種之外ATM也是ABC運輸者的亞家族，主要位于線粒體膜上，通過增強Fe-S簇的合成和Fe-S簇從線粒體運輸進(jìn)入液泡誘導(dǎo)表達(dá)參與重金屬的運輸，AMT亞家族中的AtATM1、AtATM2和ATATM3三個成員在擬南芥中已經(jīng)被克?。?3］。Kim等［44］通過基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)Cd和Pb處理后，AtATM3在植物的根部表達(dá)上調(diào)；過表達(dá)AtATM3的轉(zhuǎn)基因植物提高了對Cd的耐性，而atatm3突變體植物比野生型對Cd更加敏感。

3.2 鋅/鐵調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)運蛋白（ZIP）家族

ZIP家族可以提高陽離子的吸收和積累，一些ZIP基因如AtZIP4、NcZNT1和TjZNT1已經(jīng)在不同植物中被發(fā)現(xiàn)，TjZNT1能夠參與Zn、Cd和Mn等轉(zhuǎn)運，在植物重金屬解毒中有重要作用［45］。其中bZIP基因是ZIP家族的一個重要代表在不同生物過程和應(yīng)答脅迫中被著重研究。植物中BjCdR15（bZIP家族成員）能夠調(diào)控植物絡(luò)合酶的合成和幾種金屬轉(zhuǎn)運［46］；鎘處理后，BjCdR15主要在表皮和維管系統(tǒng)表達(dá)，在根和葉中的表達(dá)也有增加；過表達(dá)BjCdR15的擬南芥和煙草對鎘的耐受性得到增強。

3.3 重金屬ATP酶（HMAs）家族

HMAs家族在植物和動物中均存在，負(fù)責(zé)陽離子的跨膜轉(zhuǎn)運，是一個轉(zhuǎn)運蛋白超級家族。HMAs可以運輸Zn2+、Cu2+、Cd2+、Pb2+、Ni2+和Co2+等金屬離子過膜而排出細(xì)胞，對生物體內(nèi)各種金屬的平衡起重要作用。HMAs家族中HMA1、HMA3和HMA4都已經(jīng)從植物體中被分離鑒定［47-49］。研究發(fā)現(xiàn)在擬南芥中HMA超表達(dá)促進(jìn)了Zn和Cd從根到嫩枝的轉(zhuǎn)移，并最終轉(zhuǎn)移到液泡中儲存，表明其在重金屬的耐受和積累中有重要的作用［50］。

3.4 陽離子擴散促進(jìn)者（CDF）家族

CDF家族對于金屬新陳代謝的維持是非常重要的，可以調(diào)節(jié)金屬離子從細(xì)胞溶質(zhì)的輸出和進(jìn)入液泡。CDF的結(jié)構(gòu)特征是：存在于真核生物和原核生物的生物膜上，具有6個跨膜域，1個C端陽離子結(jié)合域，1個N末端特有的信號序列和1個陽離子排出域等［51］。CDF家族中的13種成員已經(jīng)被分離鑒定，其中7種參與Zn、Cd和Co轉(zhuǎn)運。MTP1是CDF蛋白家族的一個成員，屬于液泡膜運輸器。研究發(fā)現(xiàn)擬南芥的CDF蛋白AtMTP1在重金屬Zn的脅迫下超表達(dá)，提高了擬南芥對Zn的耐受性和積累，并且能將Zn2+隔離在根部的液泡中，從而降低游離金屬離子對植物的毒害［52］。

在重金屬解毒作用的研究中，除了以上ABC家族、ZIP家族、HMAs家族和CDF家族外，還有很多與運輸金屬離子相關(guān)的基因，如Nramps（natural resistance-associated macrophage protein） 家 族［53］、銅離子轉(zhuǎn)運蛋白（copper transporter，CTR）家族［54］和YST（yellow-stripe 1-like）家族［55］等。這些基因家族的表達(dá)也對重金屬離子在細(xì)胞中的運輸及提高植物的抗性等方面都有重要作用。

4 結(jié)語

隨著工業(yè)和農(nóng)業(yè)的不斷發(fā)展和人類活動范圍的不斷擴大，造成土壤重金屬污染越來越嚴(yán)重，重金屬污染已是一個嚴(yán)重的環(huán)境問題。植物對重金屬的耐受性反映了其阻止重金屬的毒害的能力，植物通過細(xì)胞壁和質(zhì)膜阻止吸收重金屬，通過對重金屬的絡(luò)合和螯合作用及在液泡中的隔離，以及通過提高抗氧化酶活性清除自由基等方式來減輕重金屬造成的傷害。隨著分子生物學(xué)發(fā)展，將會在在植物中發(fā)現(xiàn)更多的與重金屬脅迫相關(guān)的基因，對它們的研究將成為未來植物抗重金屬脅迫的研究重點。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progress of the Molecular Biology in Heavy Metal Tolerance of Plants

CHI Chun-ning DING Guo-hua
（Key Laboratory of Plant Biology，College of Heilongjiang Province，Life Science and Technology College，Harbin Normal University，Harbin 150025）

Heavy metal pollution has caused great negative impact on China’s economic development and human health，which has became a hotspot of study. This paper reviewed the research progresses on toxicity of heavy metal on plants and mechanism of plants tolerance，including the effect of metal on plants growth and development，the ways of plant resistance on toxicity of heavy metal，the tolerance gene and protein of plants to heavy metal，and so on，existing problem and major topics of future research were also disussed.

heavy metal；plants；tolerance；molecular mechanism

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.002

2016-10-20

遲春寧，女，碩士研究生，研究方向：植物分子生物學(xué)；E-mail：15146843442@163.com

丁國華，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：植物抗病分子機理；E-mail：hsddgh@hrbnu.edu.cn