蘇鵬 龔國利

（陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，西安 710021）

優(yōu)化大腸桿菌表達(dá)外源蛋白的研究進(jìn)展

蘇鵬 龔國利

（陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，西安 710021）

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前表達(dá)外源蛋白的首選，利用該表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白有許多優(yōu)越性，但表達(dá)的外源蛋白容易被宿主蛋白酶攻擊或未能正確折疊形成包涵體，其表達(dá)受到了限制。綜述了國內(nèi)外利用大腸桿菌表達(dá)外源蛋白過程中采用的一些優(yōu)化策略，主要包括表達(dá)稀有密碼子、應(yīng)用融合標(biāo)簽，改變表達(dá)菌株、降低包涵體形成、單一蛋白技術(shù)、自誘導(dǎo)、流加培養(yǎng)以及高密度細(xì)胞培養(yǎng)等，以期探索外源蛋白表達(dá)的最優(yōu)策略。

大腸桿菌；外源蛋白；流加培養(yǎng)；高密度培養(yǎng)

隨著人類生活質(zhì)量的提高和健康意識(shí)逐漸加強(qiáng)，對能夠抵御各種疾病的藥物包括醫(yī)用外源蛋白的需求逐漸加大，以中藥醫(yī)用蛋白為主的生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展。與其他原核表達(dá)系統(tǒng)相比，大腸桿菌因其遺傳背景清楚、繁殖快、成本低、表達(dá)量高、2H/13C/15N同位素標(biāo)記技術(shù)穩(wěn)定以及適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于外源蛋白表達(dá)研究。但原核細(xì)胞內(nèi)糖基化和磷酸化作用缺乏，并且原核細(xì)胞質(zhì)不是形成復(fù)雜二硫鍵的合適場所，導(dǎo)致外源蛋白在細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)尤為困難。針對近年來用于藥用蛋白生產(chǎn)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的不足，優(yōu)化大腸桿菌表達(dá)外源蛋白從而增強(qiáng)其表達(dá)水平，提高生產(chǎn)效率，對于確定未來外源蛋白表達(dá)為主的生物技術(shù)的發(fā)展方向提供一定的理論依據(jù)。

近年來市售的大約30%的重組蛋白產(chǎn)品是由大腸桿菌生產(chǎn)［1］。當(dāng)?shù)鞍追肿恿啃∮?00 kD，翻譯后修飾作用不影響特定結(jié)構(gòu)和生物活性時(shí)，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是首要選擇。本文對優(yōu)化大腸桿菌表達(dá)外源蛋白的進(jìn)展進(jìn)行了分析，以期提高外源蛋白的表達(dá)水平提供理論依據(jù)。

1 研究現(xiàn)狀

1.1 mRNA模板的優(yōu)化

許多氨基酸由多種密碼子編碼，密碼子在不同生物中使用頻率不同。研究發(fā)現(xiàn)有些外源蛋白表達(dá)水平非常低，是由于稀有密碼子在宿主細(xì)胞中的使用導(dǎo)致由稀有密碼子編碼的靶標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄延遲或提前終止，這時(shí)可根據(jù)宿主對密碼子的偏愛性優(yōu)化cDNA密碼子，提高靶蛋白表達(dá)水平，并且互聯(lián)網(wǎng)程序已開發(fā)出來協(xié)助密碼子優(yōu)化［2］。另一種方法是采用能為目標(biāo)基因提供稀有密碼子且可共表達(dá)的大腸桿菌菌株，這些菌株已被Rosetta2和CodonPlus公司商業(yè)化。靶標(biāo)基因及其周圍基因的DNA序列需要進(jìn)行檢查，例如核糖體互補(bǔ)序列的結(jié)合序列“AGGAG”是否存在。

1.2 增溶標(biāo)簽

當(dāng)外源蛋白在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，有些蛋白會(huì)在細(xì)胞質(zhì)中形成不溶性的包涵體，這些包涵體顆粒直徑50-500 nm不等［3］，阻礙蛋白的表達(dá)，將靶蛋白融合在某些易于表達(dá)和純化的“融合標(biāo)簽”的N末端或C末端可提高蛋白的高效可溶性表達(dá)。這種融合策略非常有效，常用的融合標(biāo)簽有：硫氧還蛋白（TRX），麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP），谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST），鏈球菌G蛋白B1結(jié)構(gòu)域（GB1），小泛素相關(guān)修飾蛋白（SUMO）和HaloTag蛋白［4-6］。MBP、GST和HaloTag也可以用作親和標(biāo)記物純化蛋白，因?yàn)樗鼈兡芤愿哂H和力結(jié)合特定的配體或樹脂。當(dāng)前的商業(yè)化標(biāo)簽pET32a（+）中含有trx A基因并攜帶用于蛋白生產(chǎn)和純化的雙融合伴侶［7］。HaloTag在微量靶蛋白的純化和蛋白質(zhì)陣列平臺(tái)的固定特別有用，因?yàn)樗梢怨矁r(jià)鍵結(jié)合到特定配體。

嵌合蛋白的結(jié)晶化和X射線晶體結(jié)構(gòu)分析經(jīng)常在沒有去除親和標(biāo)記物或增溶標(biāo)簽時(shí)進(jìn)行。靶蛋白的均勻性可以通過融合增溶標(biāo)簽改善，晶體的生長被包含增溶標(biāo)簽的化學(xué)單元促進(jìn)，稱為“載體驅(qū)動(dòng)”效應(yīng)［8］。一些嵌合蛋白的核磁共振波譜分析已經(jīng)做過，如果增溶標(biāo)簽不干擾目的蛋白的分析，可不去除可見的核磁共振增溶標(biāo)簽。例如，幾種蛋白質(zhì)的核磁共振波譜在沒有消除GB1標(biāo)簽情況下成功地分析，作為核磁共振信號GB1標(biāo)簽很難引起信號退化［4］，因?yàn)镚B1的分子量較小，從GB1中衍生的核磁信號的數(shù)量也很少，最終核磁共振信號明確分配。但與GST融合的蛋白質(zhì)，由于GST的一部分核磁信號被嚴(yán)重拓寬，從目的蛋白衍生的核磁信號可被檢測［9］。因此，在NMR檢測中，基于目的蛋白特性、靶標(biāo)蛋白分析目的和實(shí)驗(yàn)條件，目的蛋白的NMR分析應(yīng)去除增溶標(biāo)簽［10］。低耐熱性和易聚集的目的蛋白在可溶性宿主細(xì)胞中與增溶標(biāo)簽融合表達(dá)時(shí)，雖然增溶標(biāo)簽可正確折疊，但目的蛋白部分未折疊，可去除增溶標(biāo)簽形成不溶聚合物［11］，而NMR分析要求目的蛋白熱力學(xué)穩(wěn)定性和溶解性良好，所以這成了一個(gè)問題。在此情況下，NMR可利用2H/13C/15N同位素標(biāo)記技術(shù)檢測，未用同位素標(biāo)記的“隱形增溶標(biāo)簽”融合到同位素富集的目的蛋白，從而由目的蛋白衍生的核磁信號被檢測，而沒有聚集［12-14］。

細(xì)胞質(zhì)在氧化還原分子調(diào)節(jié)下維持在高度還原環(huán)境中，外源蛋白的表達(dá)，需要形成復(fù)雜的二硫鍵并正確折疊，這往往導(dǎo)致包涵體的形成或蛋白質(zhì)降解。大腸桿菌細(xì)胞周質(zhì)間隙的還原環(huán)境低于細(xì)胞質(zhì)，外源蛋白通過和細(xì)胞周質(zhì)間信號序列（MBP、Dsba或Dsbc）的融合作用，從細(xì)胞質(zhì)改變到細(xì)胞周質(zhì)［15］。

使用某些功能缺失的大腸桿菌突變菌株表征對硫氧還蛋白還原酶B（trxB）或谷胱甘肽還原酶（gor）的影響，如折疊酶系（如德國Novagen公司的origami試劑盒），是現(xiàn)行有效的一種替代方法。此外，Shuffle菌株可以共表達(dá)除功能缺失的trxB和gor外的目的蛋白重組二硫鍵異構(gòu)酶（PDI），因?yàn)榇竽c桿菌中細(xì)胞質(zhì)還原環(huán)境低下［16］，Shuffle菌株的使用可能明顯提高需要合成二硫鍵的外源蛋白的數(shù)量。DsbC與其他重組PDI的共表達(dá)可進(jìn)一步促進(jìn)目的蛋白質(zhì)的折疊，減少聚合［17］。

1.3 肽生產(chǎn)策略

多肽結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析在蛋白質(zhì)間交互作用的競爭性抑制和用于治療性藥物的小分子中的應(yīng)用是一個(gè)有價(jià)值的策略［18］。盡管治療性多肽本身可以作為藥物直接使用，考慮到肽的安全穩(wěn)定性和吸收效率，利用結(jié)構(gòu)觀察分析來提高其穩(wěn)定性和開發(fā)小分子治療藥物具有重要意義。當(dāng)目標(biāo)肽上有疏水基或芳香氨基酸殘基時(shí)，它與受體蛋白或脂質(zhì)分子的結(jié)合具有重要的生物學(xué)意義，這時(shí)重組肽的過表達(dá)是存在疑問的。此外，由于肽鏈短，肽結(jié)構(gòu)靈活多變，隨著過表達(dá)有退化傾向。在這種情況下，使用類固醇異構(gòu)酶（KSI）與肽串聯(lián)融合體系，可作為pET31b（+）載體由Novagen商業(yè)化提供。編碼目標(biāo)肽的互補(bǔ)DNA盒式重復(fù)序列（3-6拷貝數(shù)），通過pET31b（+）質(zhì)粒嵌入下游的KSI互補(bǔ)DNA。KSI多肽可以在大腸桿菌宿主細(xì)胞質(zhì)中高度表達(dá)，形成包涵體，它將保護(hù)目標(biāo)多肽免受蛋白酶的攻擊，包涵體能水洗純化，目標(biāo)多肽可用先前程序進(jìn)行純化。包涵體的形成可避免細(xì)胞毒素對宿主的毒性作用。此外，甲硫氨酸殘基被人為的編入連接肽中，通過溴化氰（CNBr）消化的一次性表達(dá)可以獲得大量目標(biāo)肽，顯然這種方法不適用于本身具有甲硫氨酸殘基的目標(biāo)肽。另外高絲氨酸內(nèi)脂能通過氫溴化物分解形成，并且位于目標(biāo)肽的羧基端。

當(dāng)目標(biāo)肽以可溶的形式在大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)中時(shí)，泛素和GB1被用作增溶標(biāo)簽，溶解在靶標(biāo)多肽N端的泛素標(biāo)簽?zāi)鼙环核厮饷该附?，保留完整的目?biāo)肽，這是一個(gè)重要的突破點(diǎn)，因?yàn)槿绻鋈軜?biāo)簽的酶切形成一個(gè)改良的多肽，這可能會(huì)影響三級結(jié)構(gòu)的形成或生物功能，這種情形更可能引發(fā)多肽鏈變短，因此泛素標(biāo)簽和水解酶體系的使用影響短肽的過表達(dá)。重組泛素水解酶也能高度表達(dá)并且容易被大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)純化。

MBP和Trx能被用作肽表達(dá)的增溶標(biāo)簽，MBP用PMAL載體系列可在細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞周質(zhì)中過表達(dá)，該載體將周質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)信號置于MBP的N端。在靶標(biāo)多肽本身是無序結(jié)構(gòu)蛋白（誘導(dǎo)激酶翻譯的cAMP聯(lián)合蛋白）或者在靶標(biāo)多肽逐漸消失的情況下，考慮到周質(zhì)中含量較少的蛋白酶，包含胞質(zhì)信號移位序列的MBP融合物可能降低靶標(biāo)多肽的非特異性退化危險(xiǎn)。

1.4 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)改造蛋白產(chǎn)品的先進(jìn)技術(shù)

pET表達(dá)系統(tǒng)是大腸桿菌細(xì)胞最常用的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)，由德國的Novagen公司商業(yè)上提供，不同的pET質(zhì)粒DNA擁有T7啟動(dòng)子和目的基團(tuán)，它們進(jìn)入大腸桿菌宿主細(xì)胞進(jìn)行外源基因表達(dá)。例如，源于λ噬菌體DE3的表達(dá)菌株BL21（DE3），帶有l(wèi)acUV基因啟動(dòng)子T7 RNA聚合酶編碼基因。培養(yǎng)過程中，lacUV啟動(dòng)子的活性被lac抑制，這種抑制作用能通過異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）來消除，它可導(dǎo)致T7 RNA聚合酶的表達(dá)。然而，因?yàn)門7啟動(dòng)子的活性較強(qiáng)并且lac抑制劑對lacUV啟動(dòng)子的抑制作用較弱，pET系統(tǒng)在重組蛋白表達(dá)中可產(chǎn)生許多不合需要的結(jié)果：（1）大量的快速過表達(dá)外源蛋白容易形成包涵體，基于快速合成的異源蛋白和蛋白折疊的分子伴侶本身的缺點(diǎn)，它包含了不完全折疊的外源蛋白［19］；（2）即使缺IPTG誘導(dǎo)，T7 RNA聚合酶的泄漏表達(dá)可能發(fā)生。因此，當(dāng)靶標(biāo)蛋白作為宿主細(xì)胞的細(xì)胞毒素時(shí)，轉(zhuǎn)化株可能因?yàn)橹亟M基因在宿主細(xì)胞中不穩(wěn)定而難以獲得，即使轉(zhuǎn)化株能夠獲得，細(xì)胞生長和蛋白表達(dá)可能顯著減少。1.4.1 降低包涵體形成的一般策略 如果大量外源蛋白形成不可溶的聚集物，培養(yǎng)溫度應(yīng)降低到20-30℃或采取低營養(yǎng)物質(zhì)，這些條件下基因的轉(zhuǎn)錄翻譯被減弱，靶標(biāo)蛋白可適當(dāng)折疊，溶解性提高［11］。當(dāng)用BL21（DE3）表達(dá)菌株時(shí)，外源蛋白的表達(dá)水平和細(xì)胞內(nèi)的堆積物能通過IPTG進(jìn)行改變，當(dāng)高頻使用BL21（DE3）時(shí)，條件更難控制，目前這些菌株已經(jīng)被Novagen公司商業(yè)化［20］。另外，將少量的刺激性物質(zhì)加入培養(yǎng)液中，例如能抑制大腸桿菌中蛋白合成的3%的乙醇或1 μg/mL的抗生素（卡那霉素、氯霉素、鏈霉素、四環(huán)素和嘌呤霉素），它可提高可溶性外源蛋白表達(dá)水平，因?yàn)榉肿影閭H本身的表達(dá)可能因刺激而減少。

pCold載體系統(tǒng)是一個(gè)先進(jìn)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，由日本TaKaRa公司提供，低溫培養(yǎng)在大腸桿菌表達(dá)外源蛋白水平和增大可溶性方面成為最有效的手段之一。當(dāng)培養(yǎng)溫度迅速降低到15℃，CspA啟動(dòng)子與冷休克反應(yīng)被激活，導(dǎo)致冷休克蛋白的特異性表達(dá)，并且CspA成為主要的冷休克蛋白產(chǎn)生。通過低溫抗生素截短CspA的效應(yīng)，大腸桿菌細(xì)胞生長停滯，蛋白質(zhì)的從頭合成被抑制。用這種方法，pCold載體的CspA啟動(dòng)子控制目的基因，低溫條件培養(yǎng)大腸桿菌轉(zhuǎn)化株，外源蛋白質(zhì)可以特異性過表達(dá)。pCold載體系統(tǒng)可用于不含λDE3基因但能編碼lacUV啟動(dòng)子序列和T7 RNA聚合酶的大腸桿菌宿主菌株，當(dāng)使用pCold載體目的蛋白表達(dá)水平不足時(shí)，可猜想靶標(biāo)mRNA的半衰期短和靶標(biāo)蛋白降解。這時(shí)，靶標(biāo)mRNA水平的降低通過使用BL21Star菌株作為宿主來預(yù)防，因?yàn)檫@種基因修飾的菌株NaseE活性比較弱。

1.4.2 抑制泄漏表達(dá)技術(shù) T7 RNA聚合酶表達(dá)的不完全抑制可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP增加，產(chǎn)生培養(yǎng)基中葡萄糖的消耗和后續(xù)除葡萄糖外的糖的新陳代謝。利用代謝物阻遏lacUV啟動(dòng)子，當(dāng)用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主細(xì)胞時(shí)，增加0.5%-1.0%（W/V）葡萄糖進(jìn)入瓊脂培養(yǎng)基中，T7 RNA聚合酶泄漏表達(dá)可被抑制，重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性也得到改善；另一種方法是通過與T7溶菌酶共表達(dá)抑制T7 RNA聚合酶泄漏活性，T7溶菌酶是T7RNA聚合酶天然抑制劑。BL21 pLysS和pLysE菌株具有編碼T7溶菌酶的質(zhì)粒。另外，T7 RNA聚合酶基因由araBAD啟動(dòng)子控制時(shí)，T7 RNA聚合酶泄漏表達(dá)可以有效抑制，抑制的活性可通過添加L-阿拉伯糖激活，這樣的菌株有來自Life公司的大腸桿菌BL21-AI。因此，一種特殊的大腸桿菌宿主菌株與葡萄糖誘導(dǎo)性代謝物阻遏劑的聯(lián)合使用可有效表達(dá)目標(biāo)蛋白。此外，保持重組質(zhì)粒的低拷貝數(shù)是避免異源基因細(xì)胞毒性作用的一種有效手段，購自德國Novagen公司的pETcoco載體，每個(gè)細(xì)胞可以保持在1拷貝數(shù)，不像一般pET載體拷貝數(shù)通常為20-25個(gè)。

大多數(shù)的GPCR的天然表達(dá)水平比較低，在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究領(lǐng)域建立實(shí)驗(yàn)方案來表達(dá)和純化大量重組GPCR有重大意義［21］，然而它的最佳表達(dá)條件難以確定，這是由于膜蛋白的低水平表達(dá)和大腸桿菌宿主細(xì)胞生物量的不充分，細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞之間存在的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和蛋白嵌入脂質(zhì)雙分子層機(jī)理不同是最大阻礙。 橫跨膜的、膜結(jié)合和高度疏水的蛋白質(zhì)的溶解性、表達(dá)水平或外源蛋白的聚集，可以通過使用大腸桿菌宿主菌株如C41（DE3）、C43（DE3）或Lemo21（DE3）菌株得到改善［22，23］。C41（DE3）菌株是由BL21（DE3）通過基因修飾改造的。由于該菌株的lacUV啟動(dòng)子和其他成分的突變，T7 RNA聚合酶的表達(dá)水平相對較低，從而目的重組蛋白的表達(dá)率可顯著降低。對于由未知因素引起的過表達(dá)和重組蛋白的聚集，C41（DE3）顯示出很強(qiáng)應(yīng)激作用。基于這些特點(diǎn)，重組膜蛋白或毒性蛋白的產(chǎn)率可以得到提高。C43（DE3）菌株是C41（DE3）衍生物，具有比C41（DE3）更高的脅迫耐受性。Lemo21（DE3）菌株具有獨(dú)立的質(zhì)粒pLemo，該質(zhì)粒有rhaBAD啟動(dòng)子并隨cDNA編碼T7溶菌酶。與BL21（DE3）pLys菌株情況不同，T7溶菌酶的表達(dá)水平可通過調(diào)節(jié)L-鼠李糖的劑量控制，T7RNA聚合酶活性可以優(yōu)化。作為C41（DE3）菌株類似物，可以緩解由外源蛋白的快速積累導(dǎo)致的應(yīng)激，提高重組膜蛋白產(chǎn)量。此外，靶蛋白與Mistic的融合，是由110個(gè)氨基酸殘基組成的高親水性膜結(jié)合蛋白的枯草芽孢桿菌，是一種提高目標(biāo)膜蛋白表達(dá)水平的策略。

1.5 pCold GST載體系統(tǒng)

當(dāng)可溶性蛋白的表達(dá)水平低，即使使用pcold載體系統(tǒng)也不能提高時(shí)，可將pCold載體與增溶標(biāo)簽聯(lián)合，這在增加可溶性外源蛋白的產(chǎn)量方面具有很好的意義。Hayashi和Kojima［24］研發(fā)的pCold-GST載體，使得之前難表達(dá)或易聚集的外源蛋白在大腸桿菌成功表達(dá)。為了找到能使pCold系統(tǒng)作用最大化的增溶標(biāo)簽，Hayashi和Kojima嘗試了許多增溶標(biāo)簽，包括MBP、GB1和Trx，最終發(fā)現(xiàn)與GST標(biāo)簽的融合效果最好。除了作為一種有效的增溶標(biāo)簽外，GST融合蛋白的GST部分核磁共振信號嚴(yán)重拓寬，因此目的蛋白衍生的核磁信號在沒有消除GST標(biāo)簽的情況下被清楚的檢測。目前，除了pCold-GST質(zhì)粒外，pCold ProS2載體也已經(jīng)應(yīng)用，它能利用由ProS2衍生的S蛋白作為pCold系統(tǒng)進(jìn)行外源蛋白表達(dá)的增溶標(biāo)簽［25］。最近，一種2H/13C/15N同位素標(biāo)記技術(shù)被報(bào)道，利用 pCold ProS2系統(tǒng)和蛋白質(zhì)結(jié)扎技術(shù)可將隱形的核磁共振ProS2多肽融合到可見的核磁共振目的蛋白［26］。

1.6 單一蛋白生產(chǎn)技術(shù)

大腸桿菌體內(nèi)本身存在毒素-抗毒素系統(tǒng)，它可適應(yīng)環(huán)境的變化，在大腸桿菌的細(xì)胞生長和細(xì)胞程序性死亡起作用。MazF毒素蛋白具有mRNA干擾酶活性并且可選擇性的降解mRNA中5'端ACA序列的一部分。大腸桿菌中本身含有ACA序列，這些能被MazF消化，幾乎完全抑制大腸桿菌中蛋白質(zhì)的合成。在這種條件下，雖然大腸桿菌細(xì)胞生長在一個(gè)“準(zhǔn)休眠狀態(tài)”中，但細(xì)胞中ATP的合成和蛋白表達(dá)等基本生命活動(dòng)可以繼續(xù)，因?yàn)檫@些過程之前已經(jīng)存在。在這一方法下，如果靶標(biāo)基因中的ACA序列提前和其他堿基替換，靶標(biāo)蛋白氨基酸序列仍然保持不變，異源靶標(biāo)蛋白幾乎完全表達(dá)。這個(gè)系統(tǒng)被Inouye及其同事研發(fā)，稱為單一蛋白生產(chǎn)方法（SPP）。SPP有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，特別是在2H/13C/15N同位素標(biāo)記領(lǐng)域，同位素標(biāo)記可選擇性的結(jié)合蛋白，因此同位素標(biāo)記技術(shù)的效率比傳統(tǒng)標(biāo)記技術(shù)高。即使在一定程度上核磁共振信號包含雜質(zhì)，非靶標(biāo)蛋白化學(xué)組衍生的核磁共振信號也實(shí)現(xiàn)了最小化［27］，因此，單一蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)在同位素富集膜蛋白產(chǎn)量方面尤其有效［28，29］，用大腸桿菌作為樣品，同位素標(biāo)記的膜蛋白在脂質(zhì)膜中過表達(dá)的核磁信號能用固體核磁共振技術(shù)直接測得。最近一種新的單一蛋白質(zhì)表達(dá)技術(shù)被發(fā)展，它利用了 MazF-bs mRNA 干擾酶，能夠特異性的消化mRNA 序列5'端的UACAU堿基［30］，目前SPP處在解決重組蛋白生產(chǎn)領(lǐng)域許多問題的邊緣。

1.7 自誘導(dǎo)

當(dāng)培養(yǎng)液中的細(xì)胞濃度近飽和時(shí)，外源蛋白表達(dá)在缺少IPTG情況下是自誘導(dǎo)的。自誘導(dǎo)能夠通過以下方法完成：將單菌落接種于混合液體培養(yǎng)基（甘油、D葡萄糖和α乳糖作為大腸桿菌的碳源）并且培養(yǎng)20-24 h，D葡萄糖被耗盡之前乳糖的新陳代謝不能開始。葡萄糖被利用完后，乳糖的攝取開始，lac操縱子即可被誘導(dǎo)。誘導(dǎo)時(shí)間是重組蛋白表達(dá)的關(guān)鍵，可以通過改變培養(yǎng)基中的D葡萄糖的量調(diào)整。該方法有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：培養(yǎng)過程簡單；蛋白誘導(dǎo)具有較好的重現(xiàn)性；對于可能實(shí)現(xiàn)過表達(dá)的異源蛋白的篩選，蛋白誘導(dǎo)培養(yǎng)可同時(shí)進(jìn)行。此外，該系統(tǒng)在NMR研究領(lǐng)域可對外源蛋白質(zhì)進(jìn)行2H/13C/15N同位素標(biāo)記。該方法的缺點(diǎn)是外源蛋白質(zhì)的非特異性降解可能性大，這可能是由于培養(yǎng)周期長。另外，競爭性誘導(dǎo)靶蛋白的表達(dá)可能會(huì)削弱細(xì)胞生長，當(dāng)使用BL21（DE3）plys菌株過表達(dá)T7溶菌酶時(shí)效果可能會(huì)更顯著。當(dāng)外源蛋白有細(xì)胞毒性時(shí)，相比采用IPTG的傳統(tǒng)誘導(dǎo)系統(tǒng)，生產(chǎn)大量的外源蛋白可能更加困難。先前的大規(guī)模培養(yǎng)，細(xì)胞的生長速度，目標(biāo)蛋白的生產(chǎn)水平和最佳培養(yǎng)條件應(yīng)通過初步試點(diǎn)規(guī)模培養(yǎng)來檢查。

1.8 高細(xì)胞密度培養(yǎng)

在自誘導(dǎo)的情況下，細(xì)胞生長和蛋白表達(dá)可同時(shí)取得成效，較之IPTG人工誘導(dǎo)方法的生物量或外源蛋白的產(chǎn)量高。然而，大腸桿菌細(xì)胞的體力和代謝經(jīng)濟(jì)學(xué)活動(dòng)受到限制，細(xì)胞生長速率與靶蛋白表達(dá)成反比，所以大的細(xì)胞量和靶蛋白的高表達(dá)水平很難同時(shí)獲得［11］。因此，在自誘導(dǎo)培養(yǎng)中，細(xì)胞量在誘導(dǎo)之前盡可能增加，在細(xì)胞密度趨于飽和時(shí)，預(yù)先調(diào)整培養(yǎng)基進(jìn)行自誘導(dǎo)。高細(xì)胞密度培養(yǎng)和蛋白誘導(dǎo)表達(dá)適用于常規(guī)人工誘導(dǎo)系統(tǒng)。在這樣的情況下，大量的大腸桿菌細(xì)胞在轉(zhuǎn)化體通過大規(guī)模培養(yǎng)后重懸于小體積的新鮮培養(yǎng)基，通過加入誘導(dǎo)物到高細(xì)胞密度懸浮液，靶標(biāo)蛋白實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)，大腸桿菌在活性最強(qiáng)的細(xì)胞指數(shù)期收集。Zou等［31］通過控制誘導(dǎo)物的加入速率［0.4 g/（h · L）］，采用分批補(bǔ)料方式發(fā)酵支鏈淀粉酶，得到菌體干重為15 g/L，Yang等［32］采用分批補(bǔ)料方式發(fā)酵幽門螺桿菌多表位疫苗，且在誘導(dǎo)階段使用甘油而非葡萄糖作為碳源，證明該種誘導(dǎo)方式不僅可以降低乙酸的積累，而且菌體得率可達(dá) 70 g/L，目的蛋白占菌體總蛋白質(zhì)的32%。Zhang等［33］優(yōu)化了鏈霉素Protein G高密度發(fā)酵中的溶氧、pH、初始接種量及發(fā)酵策略等因素，最終得到菌體干重為80-150 g/L，且目的蛋白產(chǎn)率最高為1 g/L。當(dāng)使用2H/13C/15N同位素標(biāo)記的外源蛋白的高細(xì)胞密度誘導(dǎo)技術(shù)時(shí)，同位素富集試劑的量可根據(jù)培養(yǎng)基的體積減少，這增加了同位素標(biāo)記培養(yǎng)的成本，因?yàn)橥凰馗患脑噭┓浅０嘿F。然而，實(shí)現(xiàn)高同位素?fù)饺胄什⒉缓唵危褂玫呐囵B(yǎng)方法和最佳培養(yǎng)條件需要進(jìn)一步分析研究。

1.9 流加培養(yǎng)

在誘導(dǎo)蛋白表達(dá)的過程中，通過連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基促進(jìn)細(xì)胞生長和蛋白表達(dá)，這種技術(shù)被稱為“流加培養(yǎng)”［34］。在2H/13C/15N同位素標(biāo)記培養(yǎng)采用普通培養(yǎng)基的情況下，流加培養(yǎng)技術(shù)顯著提高了效率［35，36］。定期向培養(yǎng)基中加酸溶液、堿溶液和空氣可以保持最佳的pH和通氣量，這些因素對生物量和蛋白表達(dá)有重要影響。為了提高流加培養(yǎng)的效率，發(fā)酵罐的選擇尤為重要。如果發(fā)酵系統(tǒng)不可用，使用通風(fēng)效率較高的產(chǎn)量燒瓶比擋板三角瓶會(huì)更有效［37］。如果使用擋板三角瓶，在振蕩培養(yǎng)過程中采用蠕動(dòng)泵不斷輸入空氣或新鮮的養(yǎng)分進(jìn)入培養(yǎng)基，也可以獲得比較好的結(jié)果［36］。一種升級版的流加培養(yǎng)技術(shù)最近被應(yīng)用，稱為EnBase技術(shù)。在這種方法中，封裝在緩釋聚合物凝膠中的葡萄糖在培養(yǎng)過程中緩慢而穩(wěn)定的流入培養(yǎng)基中［38］，這可能是EnBase技術(shù)與Miyazawa-Onami等［36］方法的結(jié)合。細(xì)胞生理活動(dòng)可以通過連續(xù)添加補(bǔ)料保持恒定，補(bǔ)料提供了營養(yǎng)并且稀釋了分泌物，在培養(yǎng)過程中促進(jìn)細(xì)胞生長及蛋白表達(dá)。近年來，一些先進(jìn)的流加技術(shù)被開發(fā)，如濃縮補(bǔ)料批次培養(yǎng)（CFB）、膨脹床吸附（EBA）和灌注系統(tǒng)［39］。在CFB法他和EBA法中，采用超濾膜或色譜樹脂不斷從培養(yǎng)基消除代謝廢物，及時(shí)收集分泌的重組外源蛋白，這些技術(shù)能有效收集靶蛋白，尤其在產(chǎn)生微量或易降解的目標(biāo)蛋白時(shí)非常有效。

2 展望

目前，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白技術(shù)雖日臻成熟，但其表達(dá)效率還有一定提升空間，一些優(yōu)化策略被采用，優(yōu)化密碼子、采用融合標(biāo)簽、單一蛋白生產(chǎn)技術(shù)、自誘導(dǎo)效應(yīng)、高細(xì)胞密度培養(yǎng)以及流加培養(yǎng)等，旨在探索一種最優(yōu)策略，降低包涵體形成，改善外源蛋白的表達(dá)水平，提高表達(dá)效率。另外，結(jié)構(gòu)生物學(xué)的研究是必不可少的，表達(dá)系統(tǒng)可表達(dá)2H/13C/15N同位素或硒代蛋氨酸標(biāo)記的重組蛋白。它不僅擴(kuò)大蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和生物學(xué)研究的多樣性和可能性，也能在原子水平上分析許多以前難表達(dá)的蛋白質(zhì)。細(xì)胞核磁共振分析是一個(gè)新的研究領(lǐng)域，需要蛋白表達(dá)系統(tǒng)和蛋白質(zhì)同位素標(biāo)記技術(shù)同步發(fā)展。隨著細(xì)胞核磁共振技術(shù)的發(fā)展，活細(xì)胞中分子間相互作用或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測定的結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析逐漸實(shí)現(xiàn)［40］。隨著基因工程手段、同位素標(biāo)記技術(shù)、核磁共振分析以及蛋白組學(xué)等研究方法對外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)的不斷改進(jìn)，優(yōu)化方案的不斷改進(jìn)，大腸桿菌表達(dá)外源蛋白的效率將會(huì)更進(jìn)一步。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Research Progress on Optimizing the Expression of Exogenous Proteins in Escherichia coli

SU Peng GONG Guo-li
（School of Food and Biological Engineering，Shaanxi University of Science & Technology，Xi’an 710021）

Escherichia coli expression system has become the first choice of expression of exogenous protein，the expression system for recombinant protein presents many advantages，and however，sometimes expressed exogenous protein is easily attacked by host protease or cannot form insoluble inclusion bodies because of incorrect folding，thus by which the expression is limited. This paper summarizes some optimization strategies used in the process of the expression of exogenous proteins in E. coli，mainly including the expression of rare codons，application of fusion tags，change of E. coli strains for expression，and reducing the formation of inclusion bodies，a single protein production system，auto-induction，fed-batch cultivation，high cell-density culture，etc.，which aims at exploring the optimal strategy for the expression of exogenous protein.

Escherichia coli；exogenous protein；fed-batch cultivation；high-cell-density cultivation

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.003

2016-05-21

蘇鵬，男，碩士，研究方向：中藥生物技術(shù)；E-mail：275736846@qq.com

龔國利，男，博士，研究方向：食品微生物技術(shù)；E-mail：15029027717@126.com