林藝華鄭濤高三基陳振東

（1. 福建省熱帶作物科學研究所，漳州 363001；2. 福建農(nóng)林大學國家甘蔗工程技術研究中心，福州 350002）

人工miRNA技術及其在植物抗病育種中的應用

林藝華1鄭濤1高三基2陳振東1

（1. 福建省熱帶作物科學研究所，漳州 363001；2. 福建農(nóng)林大學國家甘蔗工程技術研究中心，福州 350002）

內(nèi)源miRNAs被認為是真核生物調(diào)控基因表達的重要調(diào)節(jié)因子，人工miRNA（amiRNA）是一種基于天然miRNA的結(jié)構用以沉默內(nèi)源基因的有效策略。利用人工miRNA替換植物內(nèi)源miRNA前體中miRNA/miRNA*序列，使產(chǎn)生的人工miRNA與靶基因配對，并特異性地抑制靶基因的表達。從天然miRNA的合成過程和作用機制，人工miRNA的設計基本原理及構建方法，人工miRNA技術在植物抗病育種上的應用等方面進行綜述。

miRNA；人工miRNA；轉(zhuǎn)基因；抗病育種

微小RNA（microRNA，或miRNA）是一類長為19-24 nt的內(nèi)源性非編碼RNAs，普遍存在于真核生物及病毒中，在轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）中發(fā)揮重要作用［1］。miRNA是在生物體內(nèi)形成、通過與外源mRNAs的序列互補配對而識別靶基因，降解靶mRNA或抑制基因翻譯，最終抑制目的基因表達［2］，并參與植物器官的形態(tài)建成［3］、激素感知應答與信號轉(zhuǎn)導［4］、植物生長發(fā)育［5，6］和RNA代謝［7，8］等過程的調(diào)控。miRNA于1993年首次在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）中被發(fā)現(xiàn)［9］。此后，大量的研究表明在動物和植物界均存在miRNA家族［9-11］。PTGS傳統(tǒng)研究方法是基于不同方式導入植物體內(nèi)的雙鏈小分子RNA（dsRNA），衍生出小分子干擾RNA（siRNA）抑制RNA沉默，揭示PTGS途徑中的基因功能。我們所熟知的病毒誘導的基因沉默（VIGS）就是將病毒基因組作為載體，在植物上建立有效的基因沉默體系［12］。盡管這些方法具有一定優(yōu)勢，但作為沉默體系的病毒載體鑒定還是工作中的難點。隨著miRNAs的深入研究，為克服上述難點且有效沉默靶基因提出了一種新方法，即人工miRNA（amiRNA）技術［13，14］。

1 植物miRNA的合成和作用機制

miRNA介導的基因沉默是一種古老的基因調(diào)控機制，是在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)生的，由細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄的mRNA進入細胞質(zhì)后，與具有同源的植物體內(nèi)源基因或入侵的同源病毒核酸形成了特異的結(jié)合并發(fā)生了核酸的降解。miRNA在進化過程中表現(xiàn)出很高的結(jié)構保守性。基因沉默是個復雜的過程，首先由雙鏈RNA（dsRNA）所引發(fā)，dsRNA 被具有RNaseⅢ活性稱為Dicer的RNA酶（DCLs）識別并切割成21-25 nt 的小片段干涉RNA（siRNA）或microRNA（miRNA）。隨后這些小分子RNA整合到一種稱為RNA 誘導的沉默復合體（RISC）中，并通過堿基配對原理引導RISC特異性剪切靶mRNA或阻遏靶mRNA的正常翻譯，從而使目的基因發(fā)生沉默。dsRNA可以是內(nèi)源的，如轉(zhuǎn)座子插入、RNA 病毒的復制、轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄本等，也可以通過實驗的方法外源導入。

參與基因沉默的miRNA來源于內(nèi)源基因，由RNA聚合酶Ⅱ進行轉(zhuǎn)錄，首先由長的內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA）生成70 nt左右的miRNA前體（premiRNA），含有5'帽子和3' poly（A）尾巴。premiRNA發(fā)夾在依賴性Exportin-5機制作用下被輸出到細胞質(zhì)中，隨后在Dicer酶（DCL1）的作用下使其加工成為一個不穩(wěn)定的miRNA/miRNA*二價體，接著整合到RISC，成熟的miRNA鏈保留在RISC里，并通過與靶位點堿基互補識別和指導mRNA的剪切（在植物上）或抑制其翻譯（在動物上），另一miRNA*被降解［15，16］。miRNA表達的時序性和組織特異性提示人們miRNA的分布可能決定組織和細胞的功能特異性，也可能參與了復雜的基因調(diào)控，對組織的發(fā)育起重要作用，同時還參與了逆境應答與激素調(diào)節(jié)和病毒侵染下基因沉默調(diào)控［16-18］。

植物miRNA與靶標mRNA的序列完全或幾乎完全互補（0-5個錯配堿基）時，RISC通過切斷miRNA與mRNA形成雙鏈的第10與11個堿基，從而降解靶mRNA。相反，當植物miRNA與靶標mRNA不完全互補時，RISC則通過抑制靶mRNA翻譯進行基因調(diào)控。此外，miRNA也可以通過甲基化方式在轉(zhuǎn)錄水平進行調(diào)控［19，20］。在細菌侵染植物時，植物生長素信號相關的調(diào)節(jié)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子的miRNAs呈現(xiàn)上調(diào)，并抑制了生長素信號，因此在對抗病原菌侵染時誘導出了寄主植物防御機制［21］。雖然植物病毒可以通過編碼沉默抑制子拮抗植物的防御機制（RNA沉默）［22］，但是，有研究表明一些植物內(nèi)源miRNAs能夠靶標病毒抑制子的轉(zhuǎn)錄本使得植物能夠抵抗病毒侵染。miRNAs在轉(zhuǎn)錄后水平的非生物脅迫響應調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著重要作用［23］。大多數(shù)植物miRNAs靶標的是在種子萌發(fā)到種子成熟發(fā)育過程參與的轉(zhuǎn)錄因子［24］，這些miRNAs同時也調(diào)控植物逆境脅迫響應。靶標各種非生物脅迫相關的轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)控蛋白的保守miRNAs在脅迫期間顯著地上調(diào)或者下調(diào)。例如，miR395和miR399分別在硫酸鹽和磷酸鹽缺乏的環(huán)境下過量表達［4，25］。

2 人工miRNA干擾技術

2.1 人工miRNA簡介

人工miRNAs是基于內(nèi)源的miRNA前體設計，以miRNA前體作為基本骨架。由于一個miRNA前體只生成一個sRNA二價體，即miRNA/miRNA*二價體，將miRNA/miRNA*二價體區(qū)域的序列替換為與靶基因序列互補的特異miRNA，則產(chǎn)生具有新功能的人工miRNA［26］。只要人工miRNA前體的二級折回結(jié)構保持原樣，它與內(nèi)源miRNA前體的生物學功能將會一致［27，28］。因此，對于基因功能的分析和鑒定，人工miRNA技術能夠通過選擇感興趣的一個或多個靶基因進行設計。同時，人工miRNA序列應與選擇被沉默的植物基因具有較低同源性以避免產(chǎn)生脫靶效應［29，30］。

2.2 人工miRNA特點

人工miRNA技術的本質(zhì)是利用生物體內(nèi)源的miRNA前體為基本骨架，將其保守且互補的一段序列替換成目的片段，按照miRNA形成過程，產(chǎn)生能夠沉默目的基因的小RNA分子［29］。miRNA前體優(yōu)先產(chǎn)生miRNA/miRNA*二價體。當兩邊序列不匹配或凸起時，通常會產(chǎn)生所需序列的miRNA高度富集。2004年Parizotto等［31］在擬南芥中的研究，證明人工miRNA技術成功干擾了報告基因GFP的表達。隨后，研究表明人工miRNA不僅能干擾報告基因，也可靶標內(nèi)源的基因，且在其他植物上同樣有效［14，32］。此外，植物人工miRNA具有類似于內(nèi)源miRNA的高度特異性［14，33］，這樣優(yōu)化的人工miRNA序列就能特異地沉默一個或多個靶標轉(zhuǎn)錄本。

2.3 植物人工miRNA的設計

Schwab等［14］于2006年開發(fā)了一套免費開放的人工miRNA在線設計軟件（http://wmd3.weigelworld. org），可適用于250多種植物的人工miRNA序列設計。對于完全注釋的基因組，如擬南芥和水稻，只需要在WMD平臺的Design工具輸入基因的登錄號即可。對于個別拼接的序列或無登錄號的情況則需要輸入其fasta格式的序列，點擊提交后即可自動設計。為了使得人工miRNA在植物體內(nèi)能夠高特異性地沉默目的基因，對于人工miRNA設計的優(yōu)化，需要滿足幾點：（1）第一個堿基為U；（2）第10個核苷酸為A或者U；（3）第13位和第21位堿基之間最多只能有4個堿基錯配，且不能有2個堿基連續(xù)出現(xiàn)；（4）第10和第11位堿基上不能出現(xiàn)堿基錯配［29］；（5）盡可能在全基因組范圍內(nèi)考慮人工miRNA與mRNA的關系，減少人工miRNA的非特異性［22］；（6）人工miRNA靶位點不選擇在較易形成復雜高級結(jié)構的區(qū)域?？傊ㄟ^在線設計軟件生成的人工miRNA序列在具體實踐中還需進一步篩選和優(yōu)化。

2.4 人工miRNA載體構建

Schwab等提出的重疊PCR法構建植物人工miRNA載體因操作簡便、快速、準確性高而成為目前最常用的方法之一。WMD平臺包含的“Oligo”工具可自動產(chǎn)生基于擬南芥miR319（或水稻miR528）前體的4條寡核苷酸引物（I、II、III和IV）。重疊PCR法基于人工miRNA前體序列組成，通過在WMD在線軟件上設計的3對引物（A/V、II/III和I/B）分別擴增前體序列5'端到miRNA位點、miRNA位點到miRNA*位點和miRNA*位點到前體序列的3'端。以天然miRNA前體的DNA為模板進行3次PCR擴增，再以純化后的3次PCR產(chǎn)物為模板，A/B為上下游引物進行第4次PCR擴增，即得到了人工miRNA基因（圖1）。最后，通過分子克隆手段將其連接至合適的表達載體中進行遺傳轉(zhuǎn)化。

圖1 重疊PCR法構建人工miRNA示意圖［14］

除了重疊PCR方法外，很多研究者也提出了自己的構建方法，如Niu等［34］采用一步PCR方法構建人工miRNA基因，Ossowski等［29］提出了基于尿嘧啶切除的克隆法［35］，以及Liu等［36］提出的加入酶切回收小片段的一種新的構建方法。但不同的方法操作起來復雜程度不同，且有些方法改變了天然miRNA前體的長度，是否會影響其在植物體內(nèi)的功能及沉默效果仍未可知。

3 人工miRNA在植物抗病育種上的應用

人工miRNA是通過與宿主基因組比對，選擇只生成一段21 nt的siRNA，因而能有效避免傳統(tǒng)RNAi方法引起的脫靶效應。同時，人工miRNA不存在與侵染植物的非靶標病毒基因組發(fā)生重組的風險，因此利用人工miRNA技術靶向病毒基因可以獲得更安全、高效、廣譜的抗病毒轉(zhuǎn)基因植物。此外，田間病毒多是混合侵染，且病毒變異較快，而人工miRNA允許錯配存在，因此針對病毒保守區(qū)設計的人工miRNA，能有效抑制大多數(shù)病毒株系，且當病毒發(fā)生突變后仍然保持抗病能力［37，38］，既能延長品種壽命，又能防止病毒變異的積累產(chǎn)生新毒株，對培育持久廣譜的抗病毒品種具有重要意義。

人工miRNA技術最早被用于哺乳動物細胞系［39］，而在植物上的首次應用是2004年用于模式植物擬南芥［31］。隨后，人工miRNA在擬南芥、煙草、番茄、水稻、茄子及木薯等植物上特異性沉默目的基因表達的研究陸續(xù)被報道［34，38，40-43］。黃軍艷等［44］將At3A06基因的人工miRNA載體遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥，得到了對菌核病敏感性顯著增強的后代轉(zhuǎn)基因株系。人工miRNA在植物抗病育種上具有潛在的巨大影響，特別是針對植物病毒抗性的人工miRNA應用已經(jīng)被廣泛研究［14，34］。例如，Niu等［34］將蕪菁花葉病毒（Turnip mosaic virus，TuMV）的HC-Pro基因和蕪菁黃花葉病毒（Turnip yellow mosaic virus，TYMV）的P69基因替換擬南芥的miR159a骨架的保守片段，構建了兩個人工miRNA載體，結(jié)果表明，這兩個人工miRNA能特異性沉默靶基因的表達，并穩(wěn)定遺傳給后代。靶向黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）沉默抑制子2b基因的人工miRNA載體遺傳轉(zhuǎn)化番茄，獲得的轉(zhuǎn)基因番茄植株能有效抵抗CMV的侵染［45，46］。此外，若是將不同病毒基因的人工miRNA的前體骨架遺傳轉(zhuǎn)化至同一植物中，可以同時獲得多種病毒的抗性。Ai等［28］將靶向沉默抑制子HC-Pro（PVY）和p25（PVX）的人工miRNA導入煙草（Nicotiana tabacum），轉(zhuǎn)基因煙草明顯提高了對這兩種病害的抗病性。Song等［38］設計了基于PVY和煙草蝕紋病毒（Tabacco etch virus，TEV）Nib和CP基因的人工miRNA，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草對這兩種病毒同時具有抗性。

然而，人工miRNA技術在農(nóng)業(yè)應用方面也可能遇到障礙，尤其是在抗病毒轉(zhuǎn)基因分子育種上，這是因為病毒基因組比植物miRNAs進化得更快，病毒能夠通過突變等方式改變靶區(qū)域的保守性，造成人工miRNA的脫靶［47，48］。解決方法可采用基于病毒多個高度保守區(qū)域的多重人工miRNAs表達。Duan等［49］靶向黃瓜花葉病毒（CMV）的2b蛋白編碼區(qū)和基因組3'端非編碼保守區(qū)設計多重人工miRNA干擾載體，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因擬南芥對3個CMV病毒亞組的毒株具有高度抗性。

4 展望

植物基因沉默技術是植物遺傳改良一個重要的操作工具，人工miRNA具有高效、精確、可控和安全的優(yōu)點，在培育抗病毒植株、建立基因組突變庫和多拷貝基因與基因家族的研究等領域具有特別優(yōu)勢。人工miRNA可在組成型或組織特異性啟動子控制下在活體細胞內(nèi)高效表達，選擇性沉默一個或多個靶基因［14，31］。人工miRNA骨架是影響其表達效果的因素之一，有些miRNA前體作為骨架可以在不同植物中應用，如擬南芥miRNA前體在煙草、番茄等植物上的應用提高了其抗病性［14，32，34］。傳統(tǒng)的RNA干擾（RNA interference，RNAi）過程中，siRNA可能非特異性地結(jié)合與其序列互補性高的非靶基因，從而阻斷非特異基因的表達，即產(chǎn)生siRNA的脫靶效應。而人工miRNA允許一定數(shù)量的堿基錯配，且人工miRNA長度僅為21 nt，能有效避免傳統(tǒng)RNAi抗病毒策略引起的脫靶效應［50］。然而，人工miRNA在植物體內(nèi)是否均能按照預期的加工機制干擾靶基因mRNA，有些植物基因組信息缺乏而難以在基因組內(nèi)考慮人工miRNA的沉默效應，生物體復雜的調(diào)控機制對人工miRNA作用效率的影響等，這些方面還不是完全清楚，仍有待進一步研究。而人工miRNA技術的可設計性和靶標特異性充分體現(xiàn)了該技術在植物抗病育種上的有效性和多功能性，并已在多種植物中得到應用。隨著越來越多的內(nèi)源miRNA的發(fā)現(xiàn)以及其作用機制的不斷深入研究，人工miRNA技術將不斷得到完善，并在植物領域中發(fā)揮更大作用。另外，CRISPR/Cas9是新一代基因組編輯技術，可以實現(xiàn)定向改造植物基因組上一個或多個基因，為植物的遺傳改良提供了新的途徑。利用基因編輯技術對染色體大片段的缺失，可以快速敲除控制不良性狀的基因簇，實現(xiàn)作物的快速遺傳改良［51］。

［1］Carrington JC, Ambros V. Role of microRNAs in plant and animal development［J］. Science, 2003, 301（5631）：336-338.

［2］Bartel DP. MicroRNAs：target recognition and regulatory functions［J］. Cell, 2009, 136（2）：215-233.

［3］Kidner CA, Martienssen RA. Spatially restricted microRNA directs leaf polarity through ARGONAUTE1［J］. Nature, 2004, 428（6978）：81-84.

［4］Jones-Rhoades MW, Bartel DP. Computational identification of plant microRNAs and their targets, including a stress-induced miRNA［J］. Molecular Cell, 2004, 14（6）：787-799.

［5］Aukerman MJ, Sakai H. Regulation of flowering time and floral organidentity by a microRNA and its APETALA2-like target genes［J］. The Plant Cell, 2003, 15（11）：2730-2741.

［6］Chen X. A microRNA as a translational repressor of APETALA2 in Arabidopsis flower development［J］. Science, 2004, 303（5666）：2022-2025.

［7］Vaucheret H, Vazquez F, Crété P, et al. The action of ARGONAUTE1 in the miRNA pathway and its regulation by the miRNA pathway are crucial for plant development［J］. Genes & Development, 2004, 18（10）：1187-1197.

［8］Xie Q, Guo HS, Dallman G, et al. SINAT5 promotes ubiquitin-related degradation of NAC1 to attenuate auxin signals［J］. Nature, 2002, 419（6903）：167-170.

［9］Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14［J］. Cell, 1993, 75（5）：843-854.

［10］Lagos-quintana M, Rauhut R, Lendeckel W, et al. Identification of novel genes coding for small expressed RNAs［J］. Science, 2001, 294（5543）：853-858.

［11］Llave C, Kasschau KD, Rector MA, et al. Endogenous and silencing-associated small RNAs in plants［J］. The Plant Cell Online, 2002, 14（7）：1605-1619.

［12］Lu R, Martin-Hernandez AM, Peart JR, et al. Virus-induced gene silencing in plants［J］. Methods, 2003, 30：296-303.

［13］高鵬. 人工miRNA技術及其在植物中的應用研究進展［J］.浙江農(nóng)業(yè)學報, 2010, 22（3）：393-397.

［14］Schwab R, Ossowski S, Riester M, et al. Highly specific gene silencing by artificial microRNAs in Arabidopsis［J］. The Plant Cell, 2006, 18（5）：1121-1133.

［15］Filipowicz W, Jaskiewicz L, Kolb A, et al. Post-transcriptional gene silencing by siRNAs and miRNAs［J］. Current Opinion in Structural Biology, 2005, 15（3）：331-341.

［16］Bartel DP. MicroRNAs：genomics, biogenesis, mechanism, and function［J］. Cell, 2004, 116：281-297.

［17］Zuo J, Wang Y, Liu H, et al. MicroRNAs in tomato plants［J］. Science China Life Sciences, 2011, 54（7）：599-605.

［18］楊曦, 何玉科. 植物microRNA 的生物合成和調(diào)控功能［J］.生命科學, 2010（7）：688-696.

［19］Khraiwesh B, Arif MA, Seumel GI, et al. Transcriptional control of gene expression by microRNAs［J］. Cell, 2010, 140（1）：111-122.

［20］Wu L, Zhou H, Zhang Q, et al. DNA methylation mediated by a microRNA pathway［J］. Molecular Cell, 2010, 38（3）：465-475.

［21］Kumar R. Role of microRNAs in biotic and abiotic stress responses in crop plants［J］. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2014, 174（1）：93-115.

［22］Voinnet O. Induction and suppression of RNA silencing：insights from viral infections［J］. Nature Reviews Genetics, 2005, 6：206-220.

［23］Kawaguchi R, Girke T, Bray EA, et al. Differential mRNA translation contributes to gene regulation under non-stress and dehydration stress conditions in Arabidopsis thaliana［J］. Plant Journal, 2004, 38：823-839.

［24］Jones-Rhoades MW, Bartel DP, Bartel B. MicroRNAS and their regulatory roles in plants［J］. Annual Review of Plant Biology, 2006, 57：19-53.

［25］Chiou TJ, Aung K, Lin SI, et al. Regulation of phosphate homeostasis by microRNA in Arabidopsis［J］. Plant Cell, 2006, 18：412-421.

［26］Tiwari M, Sharma D, Trivedi PK. Artificial microRNA mediated gene silencing in plants：Progress and perspectives［J］. Plant Molecular Biology, 2014, 86（1/2）：1-18.

［27］Sablok G, Pérez-Quintero áL, Hassan M, et al. Artificial microRNAs（amiRNAs）engineering-On how microRNA-based silencing methods have affected current plant silencing research［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2011, 406（3）：315-319.

［28］Ai T, Zhang L, Gao Z, et al. Highly efficient virus resistance mediated by artificial microRNAs that target the suppressor of PVX and PVY in plants［J］. Plant Biology, 2011, 13（2）：304-316.

［29］Ossowski S, Schwab R, Weigel D. Gene silencing in plants using artificial microRNAs and other small RNAs［J］. The Plant Journal, 2008, 53（4）：674-690.

［30］Park W, Zhai J, Lee JY. Highly efficient gene silencing using perfect complementary artificial miRNA targeting AP1 or heteromeric artificial miRNA targeting AP1 and CAL genes［J］. Plant Cell Reports, 2009, 28（3）：469-480.

［31］Parizotto EA, Dunoyer P, Rahm N, et al. In vivo investigation of the transcription, processing, endonucleolytic activity, and functional relevance of the spatial distribution of a plant miRNA［J］. Genes& Development, 2004, 18（18）：2237-2242.

［32］Alvarez JP, Pekker I, Goldshmidt A, et al. Endogenous and synthetic microRNAs stimulate simultaneous, efficient, and localized regulation of multiple targets in diverse species［J］. Plant Cell, 2006, 18：1134-1151.

［33］Schwab R, Palatnik JF, Riester M, et al. Specific effects of microRNAs on the plant transcriptome［J］. Developmental Cell, 2005, 8（4）：517-527.

［34］Niu QW, Lin SS, Reyes JL, et al. Expression of artificial microRNAs in transgenic Arabidopsis thaliana confers virus resistance［J］. Nature Biotechnology, 2006, 24（11）：1420-1428.

［35］Nour-Eldin HH, Hansen BG, N?rholm MHH, et al. Advancing uracil-excision based cloning towards an ideal technique for cloning PCR fragments［J］. Nucleic Acids Research, 2006, 34（18）：e122.

［36］Liu C, Zhang L, Sun J, et al. A simple artificial microRNA vector based on ath-miR169d precursor from Arabidopsis［J］. Molecular Biology Reports, 2010, 37（2）：903-909.

［37］Kung YJ, Lin SS, Huang YL, et al. Multiple artificial microRNAs targeting conserved motifs of the replicase gene confer robust transgenic resistance to negative-sense single-stranded RNA plant virus［J］. Molecular Plant Pathology, 2012, 13（3）：303-317.

［38］Song YZ, Han QJ, Jiang F, et al. Effects of the sequence characteristics of miRNAs on multi-viral resistance mediated by single amiRNAs in transgenic tobacco［J］. Plant Physiology and Biochemistry, 2014, 77：90-98.

［39］Zeng Y, Wagner EJ, Cullen BR. Both natural and designed micro RNAs can inhibit the expression of cognate mRNAs when expressed in human cells［J］. Molecular Cell, 2002, 9（6）：1327-1333.

［40］Toppino L, Kooiker M, Lindner M, et al. Reversible male sterility in eggplant（Solanum melongena L.）by artificial microRNA-mediated silencing of general transcription factor genes［J］. Plant Biotechnology Journal, 2011, 9（6）：684-692.

［41］Warthmann N, Chen H, Ossowski S, et al. Highly specific gene silencing by artificial miRNAs in rice［J］. PLoS One, 2008, 3（3）：e1829.

［42］Wagaba H, Patil BL, Yadav JS, et al. Testing the efficacy of artificial microRNAs to control cassava brown streak disease［C］// Second RUFORUM Biennial Regional Conference on” Building capacity for food security in Africa”, Entebbe, Uganda, RUFORUM, 2010：287-291.

［43］Peng JC, Chen TC, Raja JAJ, et al. Broad-spectrum transgenic resistance against distinct tospovirus species at the genus level［J］. PLoS One, 2014, 9（5）：e96073.

［44］黃軍艷, 許李明, 張學江, 等. 人工microRNAs干擾At3A06基因增強了擬南芥對菌核病的敏感性［J］. 中國油料作物學報, 2010, 32（3）：345-348.

［45］Qu J, Ye J, Fang R. Artificial microRNA-mediated virus resistance in plants［J］. Journal of Virology, 2007, 81（12）：6690-6699.

［46］Zhang X, Li H, Zhang J, et al. Expression of artificial microRNAs in tomato confers efficient and stable virus resistance in a cellautonomous manner［J］. Transgenic Research, 2011, 20（3）：569-581.

［47］Lin SS, Wu HW, Elena SF, et al. Molecular evolution of a viral noncoding sequence under the selective pressure of amiRNA-mediated silencing［J］. PLoS Pathogens, 2009, 5（2）：e1000312.

［48］Simón-Mateo C, García JA. MicroRNA-guided processing impairs Plum pox virus replication, but the virus readily evolves to escape this silencing mechanism［J］. Journal of Virology, 2006, 80（5）：2429-2436.

［49］Duan CG, Wang CH, Fang RX, et al. Artificial microRNAs highly accessible to targets confer efficient virus resistance in plants［J］. Journal of Virology, 2008, 82（22）：11084-11095.

［50］Fedorov Y, Anderson EM, Birmingham A, et al. Off-target effects by siRNA can induce toxic phenotype［J］. RNA, 2006, 12（7）：1188-1196.

［51］周想春, 邢永忠. 基因組編輯技術在植物基因功能鑒定及作物育種中的應用［J］. 遺傳, 2016, 38（3）：227-242.

（責任編輯 馬鑫）

Technology of Artificial microRNA and Its Application in Breeding Disease-resistant Plants

LIN Yi-hua1ZHENG Tao1GAO San-ji2CHEN Zhen-dong1
（1. Fujian Institute of Tropical Crops，Zhangzhou 363001；2. National Engineering Research Center for Sugarcane，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou 350002）

Endogenous microRNAs（miRNAs）are recognized as important regulators of gene expression in eukaryotes. Artificial microRNA（amiRNA）is an effective strategy of silencing endogenous gene based on natural miRNAs. Using amiRNA to replace the miRNA/ miRNA* sequence in plant’s endogenous miRNA precursor，the generated amiRNA match the target gene，specifically suppressing the expression of target gene. Here，we summarize the synthetic process and action mechanism of natural miRNA，the basic design principles and construction methods of amiRNA，and the application of artificial miRNA technique in breeding disease-resistant plant.

miRNA；artificial miRNA；transgenic；disease-resistant breeding

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.02.007

2016-05-26

國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系（CARS-20-2-4），國家自然科學基金項目（31170345），福建省公益類科研院所專項（2014R1028-1）

林藝華，女，碩士，研究方向：作物分子育種；E-mail：yihualin0596@163.com

高三基，男，博士，研究方向：甘蔗病原分子生物學和抗病育種；E-mail：gsanji@163.com