龔 頻， 皮思慧， 楊文娟， 王 蘭， 陳福欣

(1.陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021； 2.西安科技大學 化學與化工學院， 陜西 西安 710054)

四甲基脲酸對鎘損傷小鼠肝臟的保護作用

龔 頻1， 皮思慧1， 楊文娟1， 王 蘭1， 陳福欣2*

(1.陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021； 2.西安科技大學 化學與化工學院， 陜西 西安 710054)

從元素鎘、鋅、鐵、銅的變化水平研究四甲基脲酸對鎘損傷小鼠肝臟的保護作用，采用小鼠腹腔注射CdCl2，連續(xù)處理14 d，測定肝臟元素鎘、鋅、鐵、銅的含量.結果表明，鎘在肝臟中蓄積呈極顯著增加(###P<0.001)，同時影響鋅含量顯著減少(#P<0.05)，鐵含量增加，銅含量無顯著差異變化.四甲基脲酸可能通過清除過量自由基，降低了氧化損傷的程度，使元素含量呈現(xiàn)出劑量依賴，抑制鎘和鐵的增加，鋅和銅含量減少.

四甲基脲酸； 鎘； 微量元素； 氧化損傷

0 引言

重金屬鎘被廣泛的應用于工業(yè)生產，極易通過食物鏈在人及動物體內蓄積，具有致癌、致畸和致突變作用.之前的研究表明鎘的毒性作用能夠誘導肝臟損傷[1]，尋找一種有效的防治鎘的肝毒性藥物迫在眉睫.四甲基尿酸(theacrine，TC)是一類具有嘌呤環(huán)的天然生物堿類物質，主要存在于普洱茶變種的苦茶嫩葉中[2].研究表明，四甲基脲酸具有抗抑郁、鎮(zhèn)靜催眠和抗炎鎮(zhèn)痛的藥理作用[3-5]，在化學、食品和醫(yī)藥方面引起了極大的反響.前期結果表明，四甲基脲酸對鎘誘導的肝臟損傷具有一定保護作用，但保護機制尚未明確.本研究擬通過構建鎘誘導小鼠肝臟損傷模型，結合元素鎘、鋅、鐵、銅和谷胱甘肽、脂質過氧化的含量變化，從新角度探究四甲基脲酸對鎘損傷小鼠肝臟保護作用的潛在機制，為苦茶產品的開發(fā)和深加工提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

氯化鎘(CdCl2)購自天津市福晨化學試劑廠；生理鹽水購自西安雙鶴制藥有限公司；濃硝酸購自天津市河東區(qū)紅巖試劑廠；濃鹽酸購自北京化工廠；5，5-二硫代-2-硝基苯甲酸(DTNB)購自Alfa Aesar公司，三氯乙酸、硫代巴比妥酸均購自上海山浦化工有限公司;其它試劑均為分析純.

1.2 實驗動物與模型構建

雄性昆明小鼠35只，購買自西安交通大學醫(yī)學院實驗動物中心，體重20±2 g.隨機將小鼠分成5組，每組7只，給藥方式按表1所示，CdCl2溶液濃度為2 mg/(kg·d)，胃飼不同濃度四甲基脲酸溶液.每天給藥1次，持續(xù)給藥14 d，四甲基脲酸濃度分別為10 mg/(kg·d)、20 mg/(kg·d)、30 mg/(kg·d)，末次注射后禁食24 h，斷頸處死解剖，取肝臟樣品，保存于-70 ℃的冰箱中待用.

表1 構建鎘損傷小鼠模型給藥方式

注：CdCl2溶液濃度為2 mg/(kg·d).

1.3 小鼠臟器系數(shù)測定

小鼠處死前后，分別稱量體重和肝臟的重量，按文獻[6]中公式，計算肝臟臟器系數(shù).

1.4 元素含量檢測

使用干灰化法[7]進行樣品前處理.準確稱取待測肝臟組織，定性濾紙充分吸干水分，置于瓷坩堝中.馬弗爐中500 ℃灰化6～8 h，過夜冷卻，稀混酸充分溶解灰分.使用偏振塞曼原子吸收光度計，采用火焰法[8]測定鎘、鋅、鐵、銅的標準曲線，同時檢測樣品中的鎘、鋅、鐵、銅元素的含量(μg/g tissue).

1.5 酶學指標測定及方法

準確稱量肝臟樣品，制備成10%組織勻漿，采用考馬斯亮藍法測定蛋白含量，5，5-二硫代-2-硝基苯甲酸(DTNB)法測定還原型谷胱甘肽(GSH)[9]，硫代巴比妥酸法測定脂質過氧化指標丙二醛(MDA)含量[10].

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學方法

所有的實驗數(shù)據(jù)都表示為“mean ± SE”.平均值用單向方差分析法(one-way analysis of variance,ANOVA)和相應的t-檢驗進行統(tǒng)計學分析.統(tǒng)計學上P<0.05認為差異有統(tǒng)計學意義.

2 結果與討論

2.1 鎘損傷和四甲基脲酸保護對小鼠體重的影響

如圖1所示，2 mg/(kg·d) CdCl2損傷14 d，使Cd組小鼠體重明顯低于空白組(##P<0.01)，當四甲基脲酸劑量為10 mg/(kg·d)、20 mg/(kg·d)、30 mg/(kg·d)時，給藥第四天體重增長持續(xù)上升；鎘損傷組從第六天開始呈下降趨勢；而低、中劑量保護組第六天也呈下降趨勢，第十二天下降趨勢得到控制；這可能是保護藥的濃度過低，并不能有效的抑制體內由鎘競爭抑制金屬元素帶來的改變及氧化應激的作用[11].高劑量四甲基脲酸組明顯抑制了下降趨勢，并在保護藥給予十天后呈現(xiàn)顯著增加趨勢(*P<0.05)，而低、中劑量四甲基脲酸組沒有顯著性差異.

2.2 鎘損傷和四甲基脲酸保護對小鼠肝臟相對系數(shù)的影響

如圖2所示，與空白組相比，鎘損傷組臟器系數(shù)呈顯著增加(##P<0.01).當四甲基脲酸的濃度為30 mg/(kg·d)時，能夠抑制增加(*P<0.05).這是由于肝是機體中重要的解毒器官，任何藥物或毒物進入體內后都要在其中進行代謝，肝臟臟器系數(shù)的升高可能是器官損傷的一種代謝補償效應[12].

(n=7；與Control組相比，##P<0.01；與Cd-treatment組相比，*P<0.05)圖1 鎘損傷和四甲基脲酸保護對小鼠體重的影響

(n=7；與Control組相比，##P<0.01；與Cd-treatment組相比，*P<0.05)圖2 鎘損傷和四甲基脲酸保護對小鼠肝臟相對系數(shù)的影響

2.3 鎘損傷和四甲基脲酸保護對小鼠肝臟中Cd、Zn、Fe、Cu的影響

CdCl2損傷14天，肝臟中元素含量的變化如圖3所示.損傷組與空白組比較，鎘的蓄積呈極顯著(###P<0.001)增加，保護組與損傷組比較，鎘含量有下降趨勢，沒有統(tǒng)計學意義；損傷組與空白組比較，鋅含量減少，具有統(tǒng)計學意義(#P<0.05)，TC濃度為30 mg/(kg·d)時顯著抑制其減少(*P<0.05)；損傷組與空白組比較，鐵含量增加，沒有統(tǒng)計學意義；TC濃度為10 mg/(kg·d)時，鐵含量增加具有統(tǒng)計學意義(*P<0.05)，TC濃度為20、30 mg/(kg·d)，鐵含量減少.銅含量在不同組別間沒有顯著性變化.

(n=7；與Control組相比，###P<0.001，#P<0.05；與Cd-treatment組相比，*P<0.05)圖3 鎘損傷和四甲基脲酸保護對小鼠肝臟中Cd、Zn、Fe、Cu的影響

體內的微量元素之間既有拮抗又有協(xié)同作用的存在，重金屬鎘的攝入對它們的影響是極其復雜的相互關系.鎘在肝臟內的大量蓄積，使得鎘置換出線粒體關鍵酶中的鐵元素，從而干擾線粒體的正常功能，同時鐵離子的游離，誘導體內發(fā)生Fenton反應，產生過量的氧自由基，誘導氧化應激的發(fā)生.鎘通過活化黃嘌呤氧化酶、血紅素氧化酶使機體內產生過量的超氧化自由基，消耗大量的鋅離子參與抗氧化酶的合成，以減少機體的氧化損傷[13].

2.4 鎘損傷和四甲基脲酸保護對小鼠肝臟中GSH和MDA的影響

谷胱甘肽作為機體內重要活性物質，具有清除自由基、促進鐵質吸收等功能.脂質過氧化物是機體的氧化應激標志，其含量增加會影響細胞生長，導致蛋白質變性.如圖4所示，鎘損傷組與空白組相比，谷胱甘肽呈顯著下降(##P<0.01)，脂質過氧化物呈增加趨勢(#P<0.05)，有統(tǒng)計學意義；四甲基脲酸劑量為30 mg/(kg·d)時，抑制脂質過氧化物的增加趨勢(*P<0.05)，谷胱甘肽在不同劑量保護下，沒有顯著性變化.

(a)谷胱甘肽

(b)脂質過氧化(n=7；與Control組相比，##P<0.01,#P<0.05；與Cd-treatment組相比，*P<0.05)圖4 鎘損傷和四甲基脲酸保護對小鼠肝臟中GSH和MDA的影響

3 結論

本實驗通過構建鎘損傷小鼠肝臟模型，從元素含量變化研究四甲基脲酸的保護作用.實驗結果表明,肝臟內鎘的累積增加了鐵離子的含量，減少了鋅、銅含量.四甲基脲酸通過清除過量產生的自由基，降低了氧化損傷的程度.為進一步闡明鎘對肝臟毒性機制提供了新的思路，也為進一步開發(fā)苦茶中四甲基脲酸提供了數(shù)據(jù)支持.

[1] Gong P,Chen F X,Wang L,et al.Protective effects of blueberries(vaccinium corymbosum L.)extract against cadmium-induced hepatotoxicity in mice[J].Environmental Toxicology and Pharmacology,2014,37:1 015-1 027.

[2] 葉創(chuàng)興,Ashihara H,鄭新強,等.一種野生茶樹的新嘌呤堿模式[J].中山大學學報(自然科學版),2003,42(1):62-65.

[3] 謝 果,吳敏芝,黃映如,等.1,3,7,9-四甲基尿酸抗抑郁作用的實驗研究[J].中國藥理學通報,2009,25(9):1 160-1 163.

[4] 王冬梅,盧嘉麗,程 悅,等.苦茶的急性毒性與神經藥理活性初步研究[J].中山大學學報(自然科學版),2010,49(1):76-79.

[5] Wang Y,Yang X,Zheng X,et al.Theacrine,a purine alkaloid with anti-inflammatory and analgesic activities[J].Fitoterapia,2010,18(6):627-631.

[6] 金龍金,張軍明,董杰影.醋酸鉛對雄性小鼠生殖功能的毒性作用[J].生殖醫(yī)學雜志,2003,12(5):288-291.

[7] 陳新煥,肖家勇,易征璇,等.干灰化法前處理測定茶葉中鉛的影響因素[J].光譜實驗室,2012,29(5):2 685-2 688.

[8] 武國華,陳艾亭,李 龍.原子吸收光譜法在中草藥微量元素及重金屬分析中的應用[J].江蘇科技大學學報,2012,26(6):615-623.

[9] 陳儉梅,周 琳.幾種谷胱甘肽的檢測方法[J].山東食品發(fā)酵,2007(3):26-29.

[10] 左 玉.脂質過氧化及抗氧化劑抗氧化活性檢測方法[J].糧食與油脂,2009(2):39-42.

[11] Li W X,Li Y F,Zhai Y J,et al.Theacrine,a purine alkaloid obtained from Camellia assamica var.kucha,attenuates restraint stress-provoked liver damage in mice[J].J Agric Food Chem,2013,61(26):6 328-6 335.

[12] 曹瓊潔,陳忠義,阮冬芬,等.氯化鎘對小鼠臟器系數(shù)及睪丸生殖細胞線粒體D-Loop基因突變的影響[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學,2010,27(11):695-697.

[13] Di Giulio R T,Scanlon P F.Effects of cadmium ingestion and food restriction on energy metabolism and tissue metal concentrations in mallard ducks[J].Environ Res,1985,37:433-444.

【責任編輯：蔣亞儒】

Protective effects of theacrine against cadmium-induced hepatotoxicity in mice

GONG Pin1, PI Si-hui1, YANG Wen-juan1, WANG Lan1, CHEN Fu-xin2*

(1.School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China； 2.School of Chemistry and Chemical Engineering, Xi′an University of Science and Technology, Xi′an 710054, China)

The elementals analysis on the level of cadmium,zinc,iron and copper in mice liver exposed to cadmium chloride (Cd(Ⅱ)) and the protective effect of theacrine against Cd(Ⅱ)-induced hepatic injury were investigated.After injected with CdCl2(ip) for 14 days,the oxidative damage of liver was evaluated through measurement of cadmium,zinc,iron,copper contents.The results showed that cadmium accumulated in the liver was significantly increased (###P<0.001),while the zinc content significantly reduced (#P<0.05),the iron content increased,the copper content shows no significant difference.Theacrine may clear the way by an excess of free radicals,reducing the degree of oxidative damage,so that the element content showed a dose-dependent inhibition of cadmium and iron increased tendency and reduce the downward trend in zinc and copper.

theacrine; cadmium; trace elements; oxidative damage

2016-12-17 基金項目：國家自然科學基金項目(21407104,81402815)

龔 頻(1983-)，女，湖南邵陽人，副教授，博士，研究方向：藥理生理

陳福欣(1981-)，男，河北吳橋人，副教授，博士，研究方向：天然產物化學，chenfuxin@xust.edu.cn

1000-5811(2017)02-0131-04

R99

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