錢衛(wèi)東, 吳啟航, 劉昱辰, 王 婷, 毛培宏

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 陜西 西安 710069； 3.新疆大學(xué) 物理科學(xué)學(xué)院， 新疆 烏魯木齊 830046)

谷胱甘肽高產(chǎn)酵母融合子的制備及發(fā)酵工藝

錢衛(wèi)東1, 吳啟航1, 劉昱辰1, 王 婷2, 毛培宏3

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.西北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 陜西 西安 710069； 3.新疆大學(xué) 物理科學(xué)學(xué)院， 新疆 烏魯木齊 830046)

為構(gòu)建谷胱甘肽(glutathione，GSH)高產(chǎn)酵母菌株，本實(shí)驗(yàn)利用原生質(zhì)體融合方法制備多形漢遜酵母和粟酒裂殖酵母融合子，結(jié)合自主設(shè)計(jì)的耐高溫、鉬酸鈉和乙醇耐受性培養(yǎng)基方法高通量篩選酵母融合子，進(jìn)而利用DTNB法定量測(cè)定GSH高產(chǎn)酵母融合子，并分析GSH高產(chǎn)酵母融合子的遺傳穩(wěn)定性，最后對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行研究.結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)利用原生質(zhì)融合方法成功構(gòu)建一株GSH產(chǎn)量高、遺傳穩(wěn)定的GSH高產(chǎn)酵母融合子，為低成本、高效生產(chǎn)GSH提供了新途徑.

多形漢遜酵母菌； 粟酒裂殖酵母菌； 原生質(zhì)體融合； 融合子

0 引言

谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是一種由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸組成的活性三肽，幾乎存在于生物體的所有細(xì)胞中，由于半胱氨酸上所具有的活性基團(tuán)巰基可與重金屬、碘乙酸等毒素相結(jié)合，使其具有整合解毒作用，即GSH具有廣譜解毒作用[1]；此外，GSH還具有抗氧化作用，達(dá)到延緩機(jī)體衰老的功效.因此，GSH在醫(yī)藥、保健食品和化妝品等行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用[2].

目前，國(guó)內(nèi)GSH的市場(chǎng)需求量日益增多，但我國(guó)GSH幾乎完全依賴進(jìn)口.GSH的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、萃取法、酶法和發(fā)酵法[3].其中，發(fā)酵生產(chǎn)GSH法因其產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低、易分離、無(wú)污染等優(yōu)點(diǎn)，日益?zhèn)涫車?guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)注.目前，國(guó)外在利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)GSH的研究水平較高，而國(guó)內(nèi)發(fā)酵生產(chǎn)GSH的整體水平與國(guó)外相比仍有差距，這歸因于缺乏高質(zhì)量的菌株發(fā)酵生產(chǎn)菌株，因此開發(fā)性能優(yōu)良的GSH高產(chǎn)菌株意義明顯.目前，用于發(fā)酵GSH最常用的菌株主要為酵母菌，其中GSH含量較高的為多形漢遜酵母屬、裂殖酵母屬、釀酒酵母屬和假絲酵母屬[4-6].

作為食品級(jí)的多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)DL-1因其具有安全性高、培養(yǎng)成本低、耐高溫、生長(zhǎng)速度快及易高密度發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)備受關(guān)注.加上遺傳背景清晰、遺傳操作簡(jiǎn)單的粟酒裂殖酵母也具備優(yōu)良的GSH生產(chǎn)能力.因此，如何充分整合兩株酵母GSH生產(chǎn)性能，進(jìn)而結(jié)合兩者清晰的遺傳操作背景開展定向分子改良，將為高效生產(chǎn)GSH提供新思路.為此，本實(shí)驗(yàn)以多形漢遜酵母菌株DL-1和粟酒裂殖酵母為出發(fā)菌株，利用細(xì)胞融合技術(shù)整合兩種酵母優(yōu)良性能，并結(jié)合自主設(shè)計(jì)的高通量篩選方法，構(gòu)建GSH高產(chǎn)酵母融合子[7,8].

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

多形漢遜酵母(Hansenulapolymorpha，H.polymorpha)DL-1，源于中國(guó)工業(yè)微生物保藏中心，保藏號(hào)為ATCC No.26012；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe，S.promb)(S.promb2.1794)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院微生物研究所.

1.1.2 試劑及儀器

(1)主要試劑： 5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)和GSH標(biāo)準(zhǔn)品，來(lái)源于Sigma公司；其余試劑均來(lái)源于天津市天力化學(xué)試劑有限公司；

(2)主要儀器：高速冷凍離心機(jī)(sigma)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海普度實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、超凈工作臺(tái)(蘇州蘇潔凈化設(shè)備公司)、高壓蒸汽滅菌鍋(上海賽默生物科技發(fā)展有限公司)、紫外可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器廠).

1.2 方法

1.2.1 酵母融合子的制備

(1)原生質(zhì)體的制備

分別取多形漢遜酵母和粟酒裂殖酵母種子液200μL，轉(zhuǎn)接于10 mLYPD培養(yǎng)基(1%酵母浸粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，pH7.2)中，37 ℃和28 ℃，140 r/min，培養(yǎng)16～18 h.取新鮮發(fā)酵液1 mL，離心后棄上清液，PBS緩沖液洗滌3次，再加入1 mL預(yù)處理液(0.05 mol/L EDTA水溶液0.02 mL、β-巰基乙醇0.02 mL溶于PB緩沖液，定容于20 mL)，搖勻，30 ℃水浴10 min后，離心后棄上清液，PBS緩沖液洗滌3次，再加入1 mL 2.5%的蝸牛酶溶液，搖勻，35 ℃水浴1 h，離心后棄上清液，PBS緩沖液洗滌3次，最后加入1 mL高滲緩沖液(5.2 g KCl溶于PB緩沖液，定容至100 mL)中得原生質(zhì)體懸液.

(2)原生質(zhì)體的融合

取兩種原生質(zhì)體1 mL，紫外滅活3 min，黑暗中保存20 min，將二者混合，2 500 r/min離心10 min，棄上清液，加入1 mL PEG-CaCl2促融劑(PEG6000 8 g、CaCl20.9 g、β-巰基乙醇0.04 mL溶于PB緩沖液，定容至20 mL)，震蕩搖勻，30 ℃水浴20 min，立即用高滲緩沖液稀釋菌體[9].

(3)融合子的篩選

①生長(zhǎng)性能篩選：取融合子懸液0.5 mL，涂布于固體蔗糖高滲培養(yǎng)基(1%酵母浸粉，2%蛋白胨，2%葡萄糖，15%蔗糖，2%瓊脂粉，pH7.2)上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，隨機(jī)挑選生長(zhǎng)較快、長(zhǎng)勢(shì)較好的菌株，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h.

②耐高溫篩選：將基于生長(zhǎng)性能篩選獲得的初篩菌株，連同作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的多形漢遜酵母菌和粟酒裂殖酵母菌，接種于固體蔗糖高滲培養(yǎng)基上，在48 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，篩選能耐高溫的菌株，該實(shí)驗(yàn)步驟可達(dá)到排除粟酒裂殖酵母，得到酵母融合子和多形漢遜酵母的目的.

③鉬酸鈉和乙醇耐受性篩選：將生長(zhǎng)性能良好、耐高溫的融合子，連同作為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照的多形漢遜酵母菌株和粟酒裂殖酵母菌株，將經(jīng)梯度稀釋后的菌液接種于乙醇(4%)選擇固體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，轉(zhuǎn)接在鉬酸鈉(2.5 mmol/L)選擇固體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，可獲得具有鉬酸鈉和乙醇耐受性的融合子，該實(shí)驗(yàn)步驟可實(shí)現(xiàn)排除多形漢遜酵母，得到酵母融合子的效果[10,11].

(4)融合子遺傳穩(wěn)定性

將性能優(yōu)良的GSH高產(chǎn)融合子，接種到液體YPD培養(yǎng)基中，37 ℃，130 r/min，恒溫培養(yǎng)，每48 h傳一代，連續(xù)傳8代，依次對(duì)每一代進(jìn)行GSH含量的檢測(cè)[12].

1.2.2 DTNB方法檢測(cè)GSH產(chǎn)量

按照參考文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行操作，分別取融合子、多形漢遜酵母和粟酒裂殖酵母的新鮮發(fā)酵液5 mL，離心得上清液和細(xì)胞沉淀.上清液用于測(cè)定胞外GSH的含量，細(xì)胞用于測(cè)定胞內(nèi)GSH的含量，GSH的總含量為二者之和.

細(xì)胞干重測(cè)定方法為將發(fā)酵液離心后，蒸餾水洗滌2～3次，在85 ℃烘干至恒重，稱重.在新鮮發(fā)酵液離心得到的上清液和菌體細(xì)胞經(jīng)破壁處理后得到的上清液中，分別加入1.5 mL 0.06% NaOH和0.5 mL 0.03%甲醛，搖勻，靜止2 min，再加入2.5 mL DTNB分析液(1 mL 0.01 mol/L DTNB溶液與99 ml 0.25 mol/L Tris-Hcl緩沖液混合，pH8.0)，搖勻，25 ℃水浴5 min，測(cè)412 nm吸光值.再根據(jù)吸光度與GSH濃度的關(guān)系計(jì)算出樣品中GSH的含量[14].

1.2.3 酵母融合子的發(fā)酵工藝

將酵母融合子接種至YPD培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)18h.取對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的酵母液進(jìn)行GSH含量測(cè)定.

(1)發(fā)酵條件的優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)置正交試驗(yàn)，確定最佳組合方式.運(yùn)用極差分析法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，確定最佳發(fā)酵工藝.選定發(fā)酵時(shí)間、接種量、碳源(葡萄糖)添加量和氮源(酵母浸粉)添加量為4個(gè)考察因素，每個(gè)因素分為3個(gè)水平，以GSH產(chǎn)量為考察指標(biāo)，因素水平見表1所示[15].

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

(2)培養(yǎng)溫度

①恒溫發(fā)酵試驗(yàn):溫度對(duì)微生物的生長(zhǎng)及其代謝產(chǎn)物合成有明顯影響，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置不同溫度(20 ℃、25 ℃、30 ℃、34 ℃、37 ℃、40 ℃、45 ℃、49 ℃)條件下恒溫發(fā)酵48 h，每隔6 h取樣一次，測(cè)定細(xì)胞干重(DCW)及GSH產(chǎn)量.

②變溫發(fā)酵試驗(yàn):由于高溫條件對(duì)菌體具有一定的脅迫作用，可根據(jù)恒溫發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)變溫條件，以提高GSH產(chǎn)量.

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)溫度酵母融合子的制備

2.1.1 培養(yǎng)溫度高溫篩選

由于裂殖酵母的最高耐受溫度為46 ℃，而漢遜酵母的最高耐受溫度為50 ℃，所以在48 ℃下恒溫培養(yǎng)48 h，可去除粟酒裂殖酵母.如圖1所示，在48 ℃恒溫培養(yǎng)條件下，多形漢遜酵母菌可順利生長(zhǎng)且長(zhǎng)勢(shì)較好，粟酒裂殖酵母菌無(wú)法生長(zhǎng)，初篩得到的融合子在48 ℃恒溫培養(yǎng)條件下能正常生長(zhǎng).

(a)多形漢遜酵母 (b)粟酒裂殖酵母 (c)初篩得到的融合子圖1 菌體在48 ℃恒溫培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)情況

2.1.2 鉬酸鈉和乙醇抗性篩選

如圖2所示，在乙醇和鉬酸鈉選擇固體培養(yǎng)基中，多形漢遜酵母菌和酵母融合子長(zhǎng)勢(shì)均較好，而粟酒裂殖酵母菌均無(wú)法生長(zhǎng)，可篩出具有乙醇和鉬酸鈉耐受性的菌株，即可以進(jìn)一步去除多形漢遜酵母，得到目標(biāo)GSH高產(chǎn)酵母融合子.

(a)乙醇選擇固體培養(yǎng)基 (b)鉬酸鈉選擇固體培養(yǎng)基圖2 酵母融合子在選擇培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

2.1.3 DTNB法檢測(cè)GSH的含量

由表2可知，DTNB法測(cè)得35#和67#酵母融合子的GSH產(chǎn)量均高于多形漢遜酵母出發(fā)菌株和粟酒裂殖酵母出發(fā)菌株.

表2 融合子的GSH產(chǎn)量

2.1.4 融合子穩(wěn)定性分析

從以35# GSH高產(chǎn)融合子為發(fā)酵菌株，連續(xù)傳8代，對(duì)每一代進(jìn)行GSH含量的檢測(cè).由圖3可知，35#菌株的GSH產(chǎn)量下降大致在10%之內(nèi)，表明該高產(chǎn)菌株遺傳穩(wěn)定.

圖3 GSH高產(chǎn)融合子遺傳性

2.2 酵母融合子的發(fā)酵工藝研究

2.2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，各因素極差順序?yàn)镽B>RD>RC>RA，影響因子先后順序?yàn)榻臃N量>酵母浸粉>葡萄糖>接種時(shí)間，各因素最佳組合為A2B2C2D3，即接種時(shí)間為18 h，接種量為4%，葡萄糖為30 g/L，酵母浸粉為15 g/L.

表3 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證所得試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，將最佳發(fā)酵條件組合A2B2C2D3(接種時(shí)間為18 h，接種量為4%，葡萄糖為20 g/L，酵母浸粉為20 g/L)與正交試驗(yàn)中A1B2C2D2(接種時(shí)間為17 h，接種量為4%，葡萄糖為20 g/L，酵母浸粉為15 g/L)進(jìn)行對(duì)比驗(yàn)證試驗(yàn).如表4所示，2種方案對(duì)比驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，在最優(yōu)發(fā)酵條件下所得的GSH產(chǎn)量高于正交試驗(yàn)中的2號(hào)組合，說(shuō)明經(jīng)過(guò)正交試驗(yàn)篩選得出的條件組合可信.

表4 對(duì)比驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 培養(yǎng)溫度對(duì)GSH產(chǎn)量的影響

(1)恒溫發(fā)酵試驗(yàn)

如圖4～5所示，溫度對(duì)DCW和GSH產(chǎn)量有著一定的影響.由圖4可見，當(dāng)培養(yǎng)溫度為30 ℃時(shí)，DCW高達(dá)到6.2 g/L；從圖5可見，當(dāng)培養(yǎng)溫度為37 ℃時(shí)，GSH產(chǎn)量高達(dá)489.6 mg/L.37 ℃時(shí)GSH產(chǎn)量相比于30 ℃時(shí)提高了3.69倍，但是，其DCW卻下降了56.4%.由此可見，GSH高產(chǎn)酵母融合子的最適生長(zhǎng)溫度與發(fā)酵生產(chǎn)GSH的溫度不同，表明可通過(guò)變溫發(fā)酵試驗(yàn)來(lái)提高酵母融合子生物合成GSH的能力.

圖4 溫度對(duì)菌體生物量的影響

圖5 溫度對(duì)GSH產(chǎn)量的影響

(2)變溫發(fā)酵試驗(yàn)

由于細(xì)胞在高溫條件下可受到脅迫作用，且該酵母融合子屬于一種耐高滲酵母，當(dāng)溫度升高時(shí)，細(xì)胞脫水形成高滲環(huán)境，這為酵母發(fā)酵生產(chǎn)應(yīng)激產(chǎn)物GSH提供了動(dòng)力.所以，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)變溫發(fā)酵試驗(yàn)，將酵母融合子在最適生長(zhǎng)溫度30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，再升溫至最適發(fā)酵溫度37 ℃繼續(xù)恒溫培養(yǎng)24 h.此外，將酵母融合子在最適生長(zhǎng)溫度30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，再升溫至脅迫溫度49 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，再降溫至最適發(fā)酵溫度37 ℃繼續(xù)恒溫培養(yǎng)24 h.如表5所示，結(jié)果表明兩者變溫發(fā)酵策略都可以提高GSH產(chǎn)量.

表5 變溫發(fā)酵后的DCW和GSH的產(chǎn)量

3 結(jié)論

該融合子是來(lái)源于多形漢遜酵母菌和粟酒裂殖酵母菌，兩個(gè)親本在生理生化方面有著一定的差異，但融合子整合了兩個(gè)親本的生長(zhǎng)性能.

GSH高產(chǎn)酵母融合子的篩選方法主要為耐高溫篩選和乙醇、鉬酸鈉耐受性篩選.在耐高溫篩選實(shí)驗(yàn)中，由于多形漢遜酵母菌和粟酒裂殖酵母菌的最高耐受溫度分別為50 ℃和46 ℃，所以在48 ℃培養(yǎng)時(shí)，多形漢遜酵母菌和酵母融合子長(zhǎng)勢(shì)均較好，而粟酒裂殖酵母菌均無(wú)法生長(zhǎng).可排除粟酒裂殖酵母菌的存在，說(shuō)明在耐高溫特性上，融合子表現(xiàn)出多形漢遜酵母菌特點(diǎn)，而在乙醇和鉬酸鈉耐受性篩選實(shí)驗(yàn)中，粟酒裂殖酵母可順利生長(zhǎng)，多形漢遜酵母菌無(wú)法生長(zhǎng)，從而可排除多形漢遜酵母菌的存在，表明在鉬酸鈉和乙醇耐受性篩選實(shí)驗(yàn)中，融合子表現(xiàn)出粟酒裂殖酵母菌生長(zhǎng)特性.

從以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，35#和67# 融合子是由多形漢遜酵母菌和粟酒裂殖酵母菌融合得到的.這表明PEG法融合多形漢遜酵母菌和粟酒裂殖酵母菌是行之有效的方法.融合子在生長(zhǎng)方面具有多形漢遜酵母菌和粟酒裂殖酵母菌的特性，其遺傳物質(zhì)也來(lái)自于兩親本.本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明利用原生質(zhì)體融合方法構(gòu)建的融合子生產(chǎn)GSH的能

力均強(qiáng)于兩個(gè)親本，加上其遺傳背景清晰、遺傳操作簡(jiǎn)單的特性，這為后續(xù)分子定向改良GSH生產(chǎn)性能提供了實(shí)踐依據(jù).

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【責(zé)任編輯：蔣亞儒】

Preparation and fermentation process of GSH high-yield yeast fusant

QIAN Wei-dong1， WU Qi-hang1， LIU Yu-chen1, WANG Ting2， MAO Pei-hong3

(1.School of Food and Biological Engineering, Shaanxi Unversity of Science & Technology, Xi′an 710021, China; 2.College of Life Sciences, Northwest University, Xi′an 710069, China; 3.School of Physics and Technology, Xinjiang University, Urumqi 830046, China)

To construct glutathione (GSH) high-yield yeast fusant,the fusants were derived from protoplast fusion betweenHansenulapolymorphaandSchizosaccharomycespombeby polyethylene glycol(PEG) fusion method.Based on-high temperature screening was adopted in prescreening,and ethanol and Sodium molybdate culture medium were utilized in second screening.Then GSH content was determined by 5,5′-Dithio bis-(2-nitrobenzoic acid)(DTNB).Finally,the genetic stability of the glutathione (GSH) high-yield yeast fusants was analyzed.One GSH yeast fusant strain high-yield and genetic stability was constructed.Therefore,a breeding strategy based on the protoplast fusion method would be a valuable alternative to improve glutathione production.

Hansenulapolymorpha；Schizosaccharomycespombe； protoplast fusion； fusant

2016-12-11 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(11575149); 陜西省科技廳自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2016JM3020); 陜西省教育廳專項(xiàng)科研計(jì)劃項(xiàng)目(15JK1088)

錢衛(wèi)東(1980-)，男，安徽蕪湖人，副教授，博士，研究方向：高附加功能性有效成分開發(fā)

1000-5811(2017)02-0126-05

R284.1

A