郭子明 阮狄克 何王德利 李威 李小川 林凌瀚 陳佳海

IL-1β 作用下功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠對(duì)大鼠髓核細(xì)胞蛋白多糖和 II 型膠原代謝影響的實(shí)驗(yàn)研究

目的觀察修飾有骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì) 7 ( bone morphogenetic protein 7，BMP-7 ) 功能片段的功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠 RADKPS 在低濃度炎癥因子白介素-1β ( inter leukin-1β，IL-1β ) ( 10 pg / ml )持續(xù)作用下對(duì)大鼠髓核細(xì)胞蛋白多糖和 II 型膠原代謝的影響。方法 體外分離培養(yǎng) SD 大鼠髓核細(xì)胞 ( nucleus pulposus cells，NPCs )，取第 3 代 NPCs 分別在無(wú) BMP-7 功能片段的 RADA16-I 或修飾有 BMP-7 功能片段的RADKPS 中培養(yǎng)，試驗(yàn)共分 4 組：A 組 ( 無(wú) IL-1β 干預(yù)的 RADA16-I 組 )、B 組 ( 有 IL-1β 干預(yù)的 RADA16-I組 )、C 組 ( 有 IL-1β 干預(yù)的 RADKPS 組 ) 和 D 組 ( 無(wú) IL-1β 干預(yù)的 RADKPS 組 )。分別在培養(yǎng)的第 3 天、第6 天及第 9 天通過(guò) RT-PCR 和 ELISA 檢測(cè)髓核細(xì)胞蛋白多糖和 II 型膠原在 RNA 和蛋白水平的表達(dá)量。結(jié)果RT-PCR 和 ELISA 結(jié)果表明在第 3 天和第 6 天時(shí) C 組蛋白多糖和 II 型膠原的表達(dá)水平均明顯高于 A 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＜0.05 )，但到第 9 天時(shí)兩組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＞0.05 )；B 組蛋白多糖和 II 型膠原的表達(dá)水平在第 3 天、第 6 天及第 9 天時(shí)均低于 A 組，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＞0.05 )；在第 3 天時(shí)C 組蛋白多糖和 II 型膠原的表達(dá)水平低于 D 組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＞0.05 )，在第 6 天和第 9 天時(shí)，C 組中兩者的表達(dá)量均明顯低于 D 組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＜0.05 )。結(jié)論 髓核細(xì)胞經(jīng) BMP-7 功能片段刺激后對(duì) IL-1β 抑制其蛋白多糖和 II 型膠原合成的作用更為敏感，但低濃度 IL-1β ( 10 pg / ml ) 不能完全抵消功能化自組裝多肽納米纖維水凝 RADKPS 中 BMP-7 功能片段對(duì)大鼠 NPCs 蛋白多糖和 II 型膠原合成的促進(jìn)作用。本研究表明 RADKPS 在體外條件下有一定的抗 IL-1β 作用，所以即使在炎癥因子 IL-1β 的存在下，RADKPS仍能促進(jìn)髓核細(xì)胞蛋白多糖和 II 型膠原的合成。

組織工程；骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)；白細(xì)胞介素；水凝膠；大鼠；髓核細(xì)胞

下腰痛是當(dāng)今臨床常見(jiàn)病之一，它不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和勞動(dòng)能力，同時(shí)還給社會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。研究表明椎間盤退變 ( intervertebral disc degeneration，IDD ) 是造成下腰痛的主要原因之一[2]。髓核細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖和 II 型膠原含量的降低在 IDD 的發(fā)生及發(fā)展中扮演著重要角色，因此提高退變椎間盤中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖和 II 型膠原的含量將是修復(fù)退變椎間盤的一個(gè)有效途徑[3-5]。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì) 7 ( bone morphogenetic protein 7，BMP-7 ) 又名成骨蛋白-1 ( osteogenic protein-1，OP-1 )，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β ( transforming growth factor-β，TGF-β ) 超家族中的一員，體外及體內(nèi)試驗(yàn)均表明 BMP-7 可促進(jìn)犬、兔及人髓核細(xì)胞中蛋白多糖和 II 型膠原的合成，同時(shí)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明 BMP-7 注射后還可提高新西蘭大白兔椎間盤內(nèi)的含水量及增加椎間盤高度，進(jìn)而達(dá)到修復(fù)退變椎間盤的作用[6-8]。

RADA16-I ( AcN-RADARADARADARADA-CNH )是一種新型自組裝多肽納米纖維支架材料，通過(guò)在其C 端末端復(fù)合短的具有不同功能的生物活性多肽片段提高其生物學(xué)活性，從而達(dá)到與組織細(xì)胞特異性作用的目的，并將這種經(jīng)過(guò)修飾后的 RADA16-I 材料稱之為“功能化自組裝納米纖維支架”[9]。本研究前期將短的具有 BMP-7 功能的多肽片段 ( KPSSAPTQLN )通過(guò)化學(xué)鍵方式結(jié)合在 RADA16-I 的 C 端從而構(gòu)建出功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠支架材料RADA-KPSS，再把 RADA-KPSS 與 RADA16-I 以1∶1 比例混合形成新型功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠支架材料 RADKPS，研究表明，RADKPS 在體外可明顯促進(jìn)人退變髓核細(xì)胞中蛋白多糖和 II 型膠原的合成，且后續(xù)的研究進(jìn)一步展現(xiàn)了 RADKPS 應(yīng)用于修復(fù)退變椎間盤的良好潛力[10-13]。

研究證實(shí)退變椎間盤組織中 IL-1β 的含量明顯升高，且其通過(guò)抑制髓核細(xì)胞外基質(zhì)的合成和加速細(xì)胞外基質(zhì)的降解進(jìn)而加速椎間盤的退變，所以IL-1β 可能影響 RADKPS 應(yīng)用于修復(fù)退變椎間盤的遠(yuǎn)期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)[14-16]。關(guān)于 RADKPS 在 IL-1β 持續(xù)作用下對(duì)髓核細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖和 II 型膠原的代謝的影響，目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道，本研究擬在體外觀察修飾有 BMP-7 功能片段的 RADKPS 在低濃度 IL-1β 的持續(xù)作用下對(duì)大鼠髓核細(xì)胞蛋白多糖和II 型膠原代謝的影響，為 RADKPS 進(jìn)一步應(yīng)用于體內(nèi)修復(fù)退變椎間盤提供指導(dǎo)。

材料與方法

一、試驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)健康雄性 SD 大鼠，5 只 ( 3 個(gè)月齡，體質(zhì)量 330～370 g )，均由解放軍海軍總醫(yī)院動(dòng)物試驗(yàn)中心提供，動(dòng)物處理方案經(jīng)過(guò)海軍總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、主要材料、儀器及試劑

RADA16-I [ 氨基酸序列：ACN- ( RADA ) 4-CONH2 ]與 RADA-KPSS [ 氨基酸序列列：ACN-( RADA ) 4GGKPSSAPTQLN-CONH ]多肽粉末各100 mg ( 利用固相合成法合成，純度＞90%；上海生工生物工程有限公司；RADA16-I，P10325；RADA-KPSS，P10324 )；胎牛血清 FBS ( Gibco，美國(guó)，16000-044 )；LG-DMEM 培養(yǎng)基 ( Solarbio，中國(guó)，31600-500 )；PBS 緩沖液 ( Hyclone，美國(guó)，SH30256.01 )；II 型膠原酶 ( Sigma，美國(guó)，C6885 )；胰酶 ( Gibco，美國(guó)，25300-054 )；Trizol ( Invitrogen，美國(guó)，15596026 ) IL-1β ( Peprotech，美國(guó)，200-01B )；RT-PCR 試劑盒 ( Takara，日本，RR820A )；RT-PCR 儀 ( Thermo Fisher，美國(guó)，TCR0096 )；ELISA 檢測(cè)試劑盒 ( Blue Gene，中國(guó)；大鼠蛋白多糖，E02P0161；大鼠 II 型膠原，E02C0779 )；RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis試劑盒 ( Takara，日本，RR036A )。Millicell cell culture insert ( 孔徑 0.4 μm，直徑 12 mm，Merck，美國(guó)，PICM01250 )；培養(yǎng)瓶 ( Corning，美國(guó)，431464U )；培養(yǎng)板 ( Corning，美國(guó)，NY14831 )。細(xì)胞培養(yǎng)箱 ( Thermo，美國(guó)，HERACell 150i )；倒置相差顯微鏡 ( Olympus，日本，703516 )；超聲破碎儀( Ameritech，中國(guó)，UC-5832 )。

三、試驗(yàn)步驟

1. 髓核細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及傳代：經(jīng)腹腔注射 10% 水合氯醛處死 SD 大鼠，置于 75% 乙醇中浸泡 10 min 后轉(zhuǎn)入經(jīng)紫外照射處理過(guò)的無(wú)菌動(dòng)物手術(shù)臺(tái)，常規(guī)消毒術(shù)區(qū)、鋪巾，沿背部正中入路切開(kāi)皮膚，輕柔剝離脊柱周圍附著的肌肉及軟組織結(jié)構(gòu)，于無(wú)菌操作下取出 SD 大鼠腰段脊柱，無(wú)菌 PBS 緩沖液清洗后立即轉(zhuǎn)入超凈臺(tái)，利用尖刀片在解剖顯微鏡下切開(kāi)椎間盤外層纖維環(huán)，顯露并分離中央膠凍樣髓核組織，眼科鑷夾取后置入裝有 PBS 緩沖液 ( 含 0.1% 雙抗的 ) 的 15 ml 離心管內(nèi)清洗 3 次( 3 min / 次 )，并以 1200 r / min 離心 5 min 后收集組織塊沉淀，隨后轉(zhuǎn)移至 6 孔板中，用眼科剪將 6 孔板中的組織塊剪碎至約 1 mm × 1 mm× 1 mm 大小后完全浸于 0.25% II 型膠原酶溶液，在 37 ℃ 及 5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行消化，每隔 30 min 用吸管輕柔吹打數(shù)次。4 h 后用等體積的完全培養(yǎng)基 ( 含 10% FBS 的 LG-DMEM ) 終止消化，用 200 目無(wú)菌篩網(wǎng)過(guò)濾后收集細(xì)胞沉淀，PBS 漂洗 2 次 ( 3 min / 次 )，1000 r / min 離心 5 min，棄上清，加入完全培養(yǎng)基重懸并用吸管輕柔吹打混勻細(xì)胞，隨后將細(xì)胞以1×105個(gè) / ml 接種于 25 cm2的無(wú)菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于5% CO2、37 ℃ 飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每 3 天換液 1 次。在倒置相差顯微鏡下觀察髓核細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，待細(xì)胞融合至 80%～90% 時(shí)，用 0.25% 胰酶( 含 0.01% EDTA ) 消化后按 1∶3 進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取第 3 代髓核細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。

2. 多肽水凝膠的制備：用無(wú)菌超純水將RADA16-I 和 RADA-KPSS 多肽粉末溶解后分別配制成濃度為 1% ( m / v ) 的多肽溶液，4 ℃ 條件下使用超聲破碎儀探針超聲 30 min 使多肽粉末充分溶解；將 1% RADA16-I 溶液與 1% RADA-KPSS 溶液等體積混合形成 1% RADKPS；置于 4 ℃ 保存以用于后續(xù)試驗(yàn) ( 圖1 )。

3. 細(xì)胞 / 多肽水凝膠支架材料的制備：將 transwell 小室輕置于 24 孔培養(yǎng)板內(nèi)，然后用 10% ( m / v )的蔗糖溶液重懸收集到的第 3 代髓核細(xì)胞并制備成濃度為 2.5×106個(gè) / ml 的細(xì)胞懸液，取 20 μl 細(xì)胞懸液 ( 含有 5×104個(gè)髓核細(xì)胞 ) 分別與 100 μl 的 1% RADA16-I 和 1% RADKPS 的多肽溶液迅速混勻。隨后立即將細(xì)胞 / 多肽水凝膠支架材料混懸液移入transwell 小室，用移液槍在 24 孔板底面輕緩的加入100 μl 完全培養(yǎng)基，隨后置入 5% CO2、37 ℃ 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 10 min 以成膠，成膠后移除 24 孔板底面的完全培養(yǎng)基，輕緩地在 24 孔板培養(yǎng)孔內(nèi)和水凝膠表面加入完全培養(yǎng)基共 1 ml，再次置入 5% CO2、37 ℃ 培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 30 min，之后每 30 min 更換 1 次培養(yǎng)孔內(nèi)及凝膠表面的完全培養(yǎng)基，至少更換 2 次以平衡水凝膠的 pH 值 ( 圖2 )。

4. 試驗(yàn)分組及 IL-1β 干預(yù)：試驗(yàn)共分為四組：A組，無(wú) IL-1β 干預(yù)的 RADA16-I 組；B 組，有 IL-1β ( 10 pg / ml ) 干預(yù)的 RADA16-I 組；C 組：有 IL-1β ( 10 pg / ml ) 干預(yù)的 RADKPS 組；D 組：無(wú) IL-1β 干預(yù)的 RADKPS 組。細(xì)胞 / 多肽水凝膠支架材料制備成功后在 A 組和 D 組培養(yǎng)孔內(nèi)和水凝膠表面輕緩加入完全培養(yǎng)基共 1 ml，B 組和 C 組在加入 1 ml 完全培養(yǎng)基的同時(shí)加入 IL-1β ( 10 pg / ml )。此后每天換液 1 次，每次換液時(shí)在 B 組和 C 組均加入 IL-1β ( 10 pg / ml )。

5. 蛋白多糖和 II 型膠原的 mRNA 檢測(cè)：實(shí)時(shí)熒光定量 PCR ( RT-PCR )：( 1 ) RNA 的提?。菏褂?Trizol 分別提取各組第 3 天、第 6 天及第 9 天時(shí)的髓核細(xì)胞的總 RNA；( 2 ) cDNA 合成：采用RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis 試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，37 ℃，15 min；反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)，85 ℃，5 s，得到 RT 反應(yīng)液；( 3 ) SYBR Green RT-PCR 反應(yīng)體系：采用 SYBRPremixEx TaqTM II ( Tli RNaseHPlus ) RT-PCR 試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)配制擴(kuò)增反應(yīng)體系，95 ℃ 預(yù)變性 30 s，進(jìn)行 40 個(gè)循環(huán)，95 ℃ 變性 3 s，60 ℃ 退火延伸 30 s，以 SD 大鼠的 β-actin 作為內(nèi)參基因，檢測(cè)各組蛋白多糖及 II 型膠原的 mRNA 相對(duì)表達(dá)量，以上引物均由北京生工有限公司合成。

圖1 功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠的大體照 a～b：RADA16-I；c～d：RADKPSFig.1 General observation of the functional self-assembling peptide nanof i ber hydrogel scaffold a - b: RADA16-I; c - d: RADKPS

圖2 髓核細(xì)胞與 RADA16-I 或 RADKPS 混合后放在 transwell小室內(nèi)培養(yǎng)Fig.2 NPCs / RADA16-I mixtureor NPCs / RADKPS mixture was cultured in transwell

6. 蛋白多糖和 II 型膠原的 ELISA 定量檢測(cè)：在第 3 天、第 6 天及第 9 天時(shí)用 RIPA 蛋白裂解液分別提取各組的總蛋白，暫存于 -80 ℃ 以用于后續(xù)試驗(yàn)。用 BCA 法測(cè)定每組的總蛋白濃度，根據(jù) ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)各組蛋白多糖和 II 型膠原進(jìn)行定量檢測(cè)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用 SPSS 20.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料表示為±s。將各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后，再采用單因素方差分析的檢驗(yàn)方法進(jìn)行組間比較，每次試驗(yàn)重復(fù) 3 次。P＜0.05 表示組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、RT-PCR 檢測(cè)各組細(xì)胞中蛋白多糖和 II 型膠原的 mRNA 表達(dá)水平

在第 3 天和第 6 天時(shí) C 組蛋白多糖和 II 型膠原的 mRNA 表達(dá)水平均明顯高于 A 組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＜0.05 )，在第 9 天時(shí)兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＞0.05 )；在第 3 天、第 6 天及第 9 天時(shí)B 組蛋白多糖和 II 型膠原的 mRNA 表達(dá)水平均低于A 組，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＞0.05 )；在第 3 天時(shí) C 組蛋白多糖和 II 型膠原 mRNA 的表達(dá)水平均低于 D 組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＞0.05 )，而在第6 天和第 9 天時(shí)兩者的表達(dá)水平均明顯低于 D 組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＜0.05 )，( 圖3 )。

圖3 蛋白多糖和 II 型膠原 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量 (aP ＜ 0.05，A 組與 C 組對(duì)比；bP ＜ 0.05，C 組與 D 組對(duì)比；A 組：RADA16-I，B 組：RADA16-I + IL-1β，C 組：RADKPS + IL-1β；D 組：RADKPS )Fig.3 Relative expression of Agg and COL2a mRNA (aP ＜ 0.05, group A vs. group C;bP ＜ 0.05, group C vs. group D; Group A: RADA16-I, Group B: RADA16-I + IL-1β, Group C: RADKPS + IL-1β, Group D: RADKPS )

二、ELISA 定量檢測(cè)各組中蛋白多糖和 II 型膠原的含量

蛋白多糖和 II 型膠原的 ELISA 定量檢測(cè)結(jié)果表明，在第 3 天和第 6 天時(shí) C 組蛋白多糖和 II 型膠原的含量均明顯高于 A 組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0.05 )，但在第 9 天時(shí)兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＞0.05 )；B 組蛋白多糖和 II 型膠原在第 3 天、第6 天及第 9 天時(shí)的含量均低于 A 組，兩組之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＞0.05 )；C 組蛋白多糖和 II 型膠原在第 3 天時(shí)的含量低于 D 組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＞0.05 )，但在第 6 天和第 9 天時(shí)兩者的含量均明顯低于 D 組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 ( P＜0.05 )，( 圖4 )。

圖4 通過(guò) ELISA 檢測(cè)到的蛋白多糖和 II 型膠原的含量 (aP ＜ 0.05，A 組與 C 組對(duì)比；bP ＜ 0.05，C 組與 D 組對(duì)比；A 組：RADA16-I，B 組：RADA16-I + IL-1β，C 組：RADKPS + IL-1β；D 組：RADKPS )Fig.4 The production of Agg and COL2a were determined by ELISA (aP ＜ 0.05, group A vs. group C;bP ＜ 0.05, group C vs. group D; Group A: RADA16-I, Group B: RADA16-I + IL-1β, Group C: RADKPS + IL-1β, Group D: RADKPS )

討 論

組織工程應(yīng)用于修復(fù)退變的椎間盤被認(rèn)為是一種很有前景的方式[17-18]，理想的組織工程材料不僅要提供利于髓核細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境，而且還要能促進(jìn)髓核細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，本試驗(yàn)前期研究已證明修飾有 BMP-7 功能片段的功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠 RADKPS 不僅能明顯促進(jìn)髓核細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖和 II 型膠原的合成，而且還具有理想的生物相容性、促進(jìn)種子細(xì)胞增殖及分化等作用[10-13]，這些研究表明 RADKPS 在將來(lái)應(yīng)用于體內(nèi)修復(fù)退變椎間盤方面具有良好的潛力。但在退變的椎間盤中炎癥因子的含量是明顯升高的，尤其是 IL-1β，IL-1β 的存在也許會(huì)影響 RADKPS 對(duì)退變椎間盤的修復(fù)作用[14,19]。本實(shí)驗(yàn)研究表明在低濃度 IL-1β ( 10 pg / ml ) 持續(xù)作用下會(huì)在一定程度上弱化，但不能完全抵消 RADKPS 對(duì)髓核細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖和II 型膠原合成的促進(jìn)作用。

關(guān)于 IL-1β 作用濃度的選擇，Huch 等[20]早期研究表明在 IL-1β 的作用濃度為 10 pg / ml 時(shí)，BMP-7 ( 50 ng / ml ) 對(duì)人膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖的合成仍有積極促進(jìn)作用，隨后 Zhang 等[19]報(bào)道 BMP-7 ( 100 ng / ml ) 可完全抵消 IL-1α ( 0.1 ng / ml ) 對(duì)牛髓核細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖合成的抑制作用?；谝陨涎芯?，本實(shí)驗(yàn)選用濃度為 10 pg / ml 的 IL-1β 作為后續(xù)的試驗(yàn)研究。

RT-PCR 及 ELISA 結(jié)果表明，在第 3 天和第6 天時(shí) C 組蛋白多糖和 II 型膠原的表達(dá)水平均明顯高于 A 組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，到第 9 天時(shí)C 組中兩者的表達(dá)量仍高于 A 組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在低濃度 IL-1β 持續(xù)作用 9 天下，IL-1β 不能完全抵消 RADKPS 中 BMP-7 功能片段對(duì)大鼠髓核細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖和II 型膠原合成的促進(jìn)作用。

此外 C 組蛋白多糖和 II 型膠原的表達(dá)量在第3 天時(shí)均低于 D 組，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在第6 天和第 9 天時(shí)均明顯低于 D 組，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同時(shí)在第 3、6 及 9 天時(shí) B 組蛋白多糖和II 型膠原的表達(dá)水平均低于 A 組，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Zhang 等[19]在之前的研究中也得出了類似的試驗(yàn)結(jié)果即在無(wú) BMP-7 刺激后低濃度的 IL-1α ( 0.1 ng / ml ) 對(duì)牛髓核細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖的合成有微弱的抑制作用，而同濃度的 IL-1α 對(duì)經(jīng) BMP-7 刺激后的牛髓核細(xì)胞中蛋白多糖的合成有明顯的抑制作用，出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是經(jīng) BMP-7 刺激后的髓核細(xì)胞對(duì)低濃度 IL-1 的負(fù)性調(diào)節(jié)作用更敏感。同時(shí)，Zhang 等[19]研究表明無(wú) BMP-7 存在時(shí)低濃度的 IL-1α ( 0.1 ng / ml ) 不僅不抑制牛纖維環(huán)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖的合成，反而對(duì)其合成起到一定的促進(jìn)作用；還有研究表明低濃度的 IL-1β ( 10 pg / ml ) 對(duì)人膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖的合成反而有一定的促進(jìn)作用[20]。

所以雖然修飾有 BMP-7 功能片段的 RADKPS能顯著促進(jìn)髓核細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖和 II 型膠原的合成，但本試驗(yàn)結(jié)果表明退變椎間盤中 IL-1β 的存在也許會(huì)在一定程度上弱化其對(duì)于退變椎間盤的修復(fù)作用。為了使 RADKPS 對(duì)退變椎間盤的修復(fù)達(dá)到更理想的效果，可以考慮通過(guò)抑制 IL-1β 的負(fù)面效應(yīng)而達(dá)到。最近研究表明 IL-1β 受體拮抗劑阿那白滯素已用于臨床上治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和骨關(guān)節(jié)炎，且取得了良好的臨床療效[21-22]。目前體外及動(dòng)物試驗(yàn)已證實(shí) IL-1β 受體拮抗劑可明顯減輕 IL-1β 對(duì)椎間盤組織所產(chǎn)生的致退變作用[23-25]，以上研究表明聯(lián)合使用 IL-1β 受體拮抗劑，也許會(huì)使 RADKPS 對(duì)退變椎間盤的修復(fù)達(dá)到更理想的效果。但目前關(guān)于IL-1β 受體拮抗劑應(yīng)用于修復(fù)退變椎間盤的研究主要局限于體外或者動(dòng)物試驗(yàn)，需進(jìn)行進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)以驗(yàn)證其在修復(fù)退變椎間盤方面的應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)用 IL-1β 在一定程度上模擬退變椎間盤周圍的炎性環(huán)境以觀察 RADKPS 對(duì)大鼠髓核細(xì)胞外基質(zhì)蛋白多糖和 II 型膠原代謝的影響，更加完善了功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠RADKPS 在修復(fù)退變椎間盤方面的作用，為其遠(yuǎn)期的體內(nèi)試驗(yàn)提供了一定的指導(dǎo)意義。

[1]Pellisé F, Balagué F, Rajmil L, et al. Prevalence of low back pain and its effect on health-related quality of life in adolescents[J]. Arch Pediatr Adolesc Med, 2009, 163(1):65-71.

[2]Freimark D, Czermak P. Cell-based regeneration of intervertebral disc defects: review and concepts[J]. Int J Artif Organs, 2009, 32(4):197-203.

[3]Antoniou J, Steffen T, Nelson F, et al. The human lumbar intervertebral disc: evidence for changes in the biosynthesis and denaturation of the extracellular matrix with growth, maturation, ageing, and degeneration[J]. J Clin Invest, 1996, 98(4):996-1003.

[4]Buckwalter JA. Aging and degeneration of the human intervertebral disc[J]. Spine, 1995, 20(11):1307-1314.

[5]Liu GZ, Ishihara H, Osada R, et al. Nitric oxide mediates the change of proteoglycan synthesis in the human lumbar intervertebral disc in response to hydrostatic pressure[J]. Spine, 2001, 26(2):134-141.

[6]Wang C, Ruan DK, Zhang C, et al. Effects of adeno-associated virus-2-mediated human BMP-7 gene transfection on the phenotype of nucleus pulposus cells[J]. J Orthop Res, 2011, 29(6):838-845.

[7]Imai Y, Miyamoto K, An HS, et al. Recombinant human osteogenic protein-1 upregulates proteoglycan metabolism of human anulus fibrosus and nucleus pulposus cells[J]. Spine, 2007, 32(12):1303-1309.

[8]An HS, Takegami K, Kamada H, et al. Intradiscal administration of osteogenic protein-1 increases intervertebral disc height and proteoglycan content in the nucleus pulposus in normal adolescent rabbits[J]. Spine, 2005, 30(1):25-31.

[9]Bradshaw M, Ho D, Fear MW, et al. Designer self-assembling hydrogel scaffolds can impact skin cell proliferation and migration[J]. Sci Rep, 2014, 4:6903.

[10]Tao H, Zhang Y, Wang CF, et al. Biological evaluation of human degenerated nucleus pulposus cells in functionalized self-assembling peptide nanof i ber hydrogel scaffold[J]. Tissue Engineering Part A, 2014, 20(11-12):1621-1631.

[11]劉龍剛, 伍耀宏, 陶暉, 等. 修飾有 BMP-7 功能片段的功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠 RADKPS 制備及其生物相容性研究[J]. 中國(guó)修復(fù)重建外科雜志, 2016, (4):491-498.

[12]Wu Y, Jia Z, Liu L, et al. Functional self-assembled peptide nanofibers for bone marrow mesenchymal stem cell encapsulation and regeneration in nucleus pulposus[J]. Artif Organs, 2016, 40(6):E112-119.

[13]Li XC, Wu YH, Bai XD, et al. BMP7-based functionalized self-assembling peptides protect nucleus pulposus-derived stem cells from apoptosis in vitro[J]. Tissue Eng Part A, 2016, 22(19-20):1218-1228.

[14]Yang W, Yu XH, Wang C, et al. Interleukin-1beta in intervertebral disk degeneration[J]. Clin Chim Acta, 2015, 450:262-272.

[15]Hu J, Deng G, Tian Y, et al. An in vitro investigation into the role of bone marrowderived mesenchymal stem cells in the control of disc degeneration[J]. Mol Med Rep, 2015, 12(4):5701-5708.

[16]Shen B, Melrose J, Ghosh P, et al. Induction of matrix metalloproteinase-2 and -3 activity in ovine nucleus pulposus cells grown in three-dimensional agarose gel culture by interleukin-1beta: a potential pathway of disc degeneration[J]. European Spine Journal, 2003, 12(1):66-75.

[17]Sakai D. Future perspectives of cell-based therapy for intervertebral disc disease[J]. Eur Spine J, 2008, 17(Suppl 4): S452-458.

[18]Vadalà G, Russo F, Martino AD, et al. Intervertebral disc regeneration: from the degenerative cascade to molecular therapy and tissue engineering[J]. J Tissue Eng Regen Med, 2013, 9(6):679-690.

[19]Zhang Y, An HS, Toofanfard M, et al. Low-dose interleukin-1 partially counteracts osteogenic protein-1-induced proteoglycan synthesis by adult bovine intervertebral disk cells[J]. Am J Phys Med Rehabil, 2005, 84(5):322-329.

[20]Huch K, Wilbrink B, Flechtenmacher J, et al. Effects of recombinant human osteogenic protein 1 on the production of proteoglycan, prostaglandin E2, and interleukin-1 receptor antagonist by human articular chondrocytes cultured in the presence of interleukin-1beta[J]. Arthritis Rheum, 1997, 40(12): 2157-2161.

[21]Chevalier X, Giraudeau B, Conrozier T, et al. Safety study of intraarticular injection of interleukin 1 receptor antagonist in patients with painful knee osteoarthritis: a multicenter study[J]. J Rheumatol, 2005, 32(7):1317-1323.

[22]Kary S, Burmester GR. Anakinra: the first interleukin-1 inhibitor in the treatment of rheumatoid arthritis[J]. Int J Clin Pract, 2003, 57(3):231-234.

[23]Genevay S, Finckh A, Mezin F, et al. Influence of cytokine inhibitors on concentration and activity of MMP-1 and MMP-3 in disc herniation[J]. Arthritis Res Ther, 2009, 11(6):R169.

[24]Gorth DJ, Mauck RL, Chiaro JA, et al. IL-1ra delivered from poly(lactic-co-glycolic acid) microspheres attenuates IL-1βmediated degradation of nucleus pulposus in vitro[J]. Arthritis Res Ther, 2012, 14(4):R179.

[25]Gorth DJ, Martin JT, Dodge GR, et al. In vivo retention and bioactivity of IL-1ra microspheres in the rat intervertebral disc: a preliminary investigation[J]. J Exp Orthop, 2014, 1(1):15.

( 本文編輯：李慧文 )

Effect of functionalized self-assembling peptide nanof i ber hydrogel on the metabolism of aggrecan and type II collagen of rat nucleus pulposus cells with the effect of IL-1β

GUO Zi-ming, RUAN Di-ke, HE Qing, WANG De-li,LI Wei, LI Xiao-chuan, LIN Ling-han, CHEN Jia-hai. Naval Clinical College of Anhui Medical University, Hefei, Anhui, 230032, China

RUAN Di-ke, Email: ruandikengh@163.com

ObjectiveTo observe the effect of RADKPS which is modif i ed with BMP-7 functional fragments on the metabolism of aggrecan and type II collagen of nucleus pulposus cells of rats when a low concentration of interleukin-1 beta ( IL-1β, 10 pg / ml ) is existent. Methods Nucleus pulposus cells ( NPCs ) were isolated from Sprague-Dawley rats and cultured to the 3rd passage in vitro. NPCs were cultured in the presence of RADA16-I which was without BMP-7 functional fragment or RADKPS which was combined with BMP-7 functional fragments. Experiments were divided into 4 groups: group A ( RADA16-I without IL-1β ), group B ( RADA16-I with IL-1β ), group C ( RADKPS with IL-1β ) and group D ( RADKPS without IL-1β ). Real-time PCR ( RT-PCR ) and enzymelinked immunosorbent assay ( ELISA ) were performed to determine the RNA and protein expressions of aggrecan and type II collagen of each group on the 3rd day, the 6th day and the 9th day. Results The results of RT-PCR and ELISA showed that the expression level of aggrecan and type II collagen of group C was signif i cantly higher than that of group A on the 3rd day and the 6th day and the difference was statistically signif i cant ( P ＜ 0.05 ), but the differencebetween the 2 groups was not statistically signif i cant on the 9th day ( P ＞ 0.05 ); the expression level of aggrecan and type II collagen of group B was lower than that of group A at the 3rd day, the 6th day and the 9th day, but the difference between the 2 groups was not statistically signif i cant at the 3 time points ( P ＞ 0.05 ); the expression level of aggrecan and type II collagen of group C was lower than that of group D on the 3rd day and there was no statistical signif i cance ( P ＞ 0.05 ). But the expression level of aggrecan and type II collagen of group C was signif i cantly lower than that of group D on the 6th day and the 9th day, and the difference between the 2 groups was statistically signif i cant ( P ＜0.05 ). Conclusions After being stimulated by BMP-7 functional fragments, nucleus pulposus cells are more sensitive to the inhibition of IL-1β on the synthesis of aggrecan and type II collagen. However, IL-1β ( 10 pg / ml ) could not completely counteract the positive effect of BMP-7 functional fragments which are compounded in the functionalized self-assembled peptide nanof i ber hydrogel RADKPS on the synthesis of aggrecan and type II collagen of NPCs. The present study shows that RADKPS has a certain anti-IL-1β effect in vitro. Therefore, RADKPS can still promote the synthesis of aggrecan and type II collagen of NPCs when proinf l ammatory cytokine IL-1β is present.

Tissue engineering; Bone morphogenetic protein 7; Interleukin-1 beta; Hydrogel; Rats; Nucleus pulposus cells

10.3969/j.issn.2095-252X.2017.03.009

R318

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目 ( 81472121 )

230032 合肥，安徽醫(yī)科大學(xué)海軍臨床學(xué)院 ( 郭子明、阮狄克 )；100048 北京，海軍總醫(yī)院骨科 ( 何、王德利、李威、李小川、林凌瀚、陳佳海 )

阮狄克，Email：ruandikengh@163.com

2016-12-20 )