黃亮節(jié) 翁土軍 張春麗 劉彥 錢隆 侯樹勛

Pellet 培養(yǎng)與纖維蛋白凝膠支架體外成軟骨能力的比較

黃亮節(jié) 翁土軍 張春麗 劉彥 錢隆 侯樹勛

目的比較 Pellet 培養(yǎng)和纖維蛋白凝膠支架兩種培養(yǎng)方式誘導(dǎo)脂肪干細胞向軟骨細胞分化及合成細胞外基質(zhì)的差異。方法 人脂肪組織酶消化分離脂肪干細胞，培養(yǎng)基為 DMEM 含 10% 胎牛血清，利用Pellet 培養(yǎng)和纖維蛋白凝膠支架兩種培養(yǎng)體系將 P3 代脂肪干細胞誘導(dǎo)成軟骨后 21 天取材進行蘇木精－伊紅染色，番紅 O 染色，DMMB 法測定胞外基質(zhì)中 GAG 含量，熒光定量 PCR 測定 II 型膠原基因表達。結(jié)果 蘇木精－伊紅染色與番紅－O 染色顯示，纖維蛋白凝膠實驗組軟骨細胞外基質(zhì)大量分泌，并融合成片，說明纖維蛋白凝膠支架可更好促進干細胞成軟骨分化、維持軟骨細胞表型。GAG / DNA 結(jié)果顯示，纖維蛋白凝膠組促GAG 分泌的能力優(yōu)于其余各組 ( P＜0.05 )，其 II 型膠原 mRNA 表達的能力也最強 ( P＜0.05 )。結(jié)論 利用纖維蛋白凝膠支架誘導(dǎo)人脂肪干細胞成軟骨分化的能力優(yōu)于無支架的 Pellet 三維培養(yǎng)體系。

纖維蛋白；干細胞；組織工程；軟骨；Pellet 培養(yǎng)；脂肪源干細胞

關(guān)節(jié)軟骨自身修復(fù)能力差，如何治療軟骨缺損一直是關(guān)節(jié)外科醫(yī)生所面臨的難題。傳統(tǒng)軟骨缺損修復(fù)的方法有軟骨下骨微骨折術(shù)、鑲嵌式成形術(shù)及同種異體骨軟骨移植等[1-3]。近年來又出現(xiàn)了自體軟骨細胞移植等新技術(shù)[4]。但以上方法常受到供體數(shù)量不足、免疫排斥反應(yīng)的限制，遠期療效并不理想[5]。新興的組織工程技術(shù)利用支架材料聯(lián)合干細胞與誘導(dǎo)因子，在體外或體內(nèi)構(gòu)建組織和器官，為軟骨再生提供了新的思路。脂肪干細胞來源廣泛、數(shù)量豐富、獲取便捷，且具有成軟骨分化潛能，在適宜條件下可向軟骨分化，相比骨髓間充質(zhì)干細胞具有明顯優(yōu)勢，是軟骨組織工程中種子細胞的理想選擇[6]。

軟骨組織工程中種子細胞誘導(dǎo)分化為軟骨細胞一直是研究的熱點。轉(zhuǎn)化生長因子 β ( TGF-β ) 家族因其具有良好的促干細胞成軟骨分化能力，常作為軟骨組織工程中的誘導(dǎo)因子[7-8]，且 TGF-β3 相較于傳統(tǒng)的 TGF-β1，促進人間充質(zhì)干細胞成軟骨分化能力更強[9]。合適的誘導(dǎo)培養(yǎng)體系還包括培養(yǎng)模式、支架材料等，在脂肪干細胞的誘導(dǎo)分化中也起到關(guān)鍵作用。Pellet 培養(yǎng)體系作為無支架培養(yǎng)的代表，在長期培養(yǎng)中軟骨細胞仍可保持較好生物學(xué)活性，同時特異性細胞外基質(zhì)分泌增加，操作簡單，產(chǎn)量較高[10]。近年來基于支架的組織工程技術(shù)也發(fā)展迅速，可注射式細胞支架因其創(chuàng)傷較小、可塑性強、操作方便等優(yōu)勢，成為軟骨組織工程的研究熱點[11]。纖維蛋白凝膠具有來源廣泛、價格低廉、生物相容性好，在凝血酶作用下可形成三維立體多孔細胞支架，為種子細胞的均勻分布提供足夠的空間，促進種子細胞的黏附、生長、增殖、分化[12]，在軟骨再生領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。

本實驗以人脂肪干細胞作為種子細胞，在培養(yǎng)體系中加入 TGF-β3 細胞因子，比較無支架的 Pellet培養(yǎng)和纖維蛋白凝膠支架兩種培養(yǎng)方式成軟骨效果的差異，探索誘導(dǎo)效果更好的軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)體系，為下一步臨床利用脂肪干細胞修復(fù)軟骨損傷奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

本實驗于 2016 年 3 月至 2016 年 9 月在解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院全軍骨科研究所完成。

材料：脂肪來自解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者，所有患者均簽署知情同意書。

一、實驗步驟

1. 實驗相關(guān)試劑的配制：凝血酶溶液及纖維蛋白原溶液：凝血酶溶于氯化鈣，獲得濃度 5 U / ml 溶液 ( A 液 )，用來重懸細胞；纖維蛋白原溶于氯化鈉溶液使?jié)舛葹?100 mg / ml，并含抑酞酶 10000 KIU / ml ( B 液 )，A 液和 B 液混合即可形成纖維蛋白凝膠。DMMB 染色液：1.6 mg DMMB 粉末溶于 100 ml 緩存液中，緩沖液含 3.04 g / L 甘氨酸、2.37 g / L 氯化鈉及 0.01 mmol / L 鹽酸 ( 表1 )。

表1 試驗主要試劑及儀器Tab.1 The main reagent and apparatus

2. 人脂肪干細胞原代培養(yǎng)：收集手術(shù)患者髕骨下脂肪組織 20 ml，PBS 沖洗 3 次，將脂肪剪碎轉(zhuǎn)移到 15 ml 離心管內(nèi)，加入等體積 0.1% I 型膠原酶，37 ℃ 水浴消化 1.5 h，2000 r / min 離心 5 min；棄上清，PBS 重懸，200 目細胞篩過濾懸液至新離心管中，再次 2000 r / min 離心 5 min；棄上清，加入含10% FBS、1% 雙抗的 DMEM / F12 培養(yǎng)基重懸，將細胞打勻后接種于 10 cm 培養(yǎng)皿，于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后 48 h 首次換液，換液后 7 天形成細胞克隆并 80% 融合傳代。

3. 三維培養(yǎng)細胞微球的制備：收集 P3 代脂肪干細胞，重懸計數(shù)，在每個 15 ml 離心管中加入5×105個細胞，300 g 離心 5 min，傾棄上清，加入2 ml 不完全軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。其成分為：高糖DMEM 加入 100 U / ml 青、鏈霉素、10% FBS、10-7mol / L 地塞米松、ITS＋( 含 10 mg / L 胰島素，5 μg / L 硒，5.5 mg / L 轉(zhuǎn)鐵蛋白，4.7 mg / L 亞油酸，0.5 g / L BSA )、110 mg / L 丙酮酸鈉溶液、50 mg / L左旋抗壞血酸-2、40 mg / L 脯氨酸。24 h 后細胞聚集成球，實驗組換用添加 10 ng / ml TGF-β3 的完全培養(yǎng)基，對照組繼續(xù)不完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。每隔 2 天全量換液，實驗組新鮮加入 TGF-β3，第 21 天收獲細胞。

4. 纖維蛋白凝膠復(fù)合脂肪干細胞體外培養(yǎng)：收集 P3 代脂肪干細胞，計數(shù)，在干凈 1.5 ml EP 管中加入 5×105個細胞，棄上清，取 A 液 30 μl 重懸細胞，加入內(nèi)徑 4 mm 的塑料模具內(nèi)，再取 B 液 30 μl加入，搖晃混勻，37 ℃ 反應(yīng) 40 min 后混合液凝固成凝膠，將凝膠取出放入 6 孔板內(nèi)，實驗組加入含TGF-β3 的完全培養(yǎng)基 2 ml，對照組加入不完全培養(yǎng)基 2 ml。每隔 2 天全量換液，第 21 天收獲細胞。

5. 相關(guān)指標(biāo)的檢測：

( 1 ) 組織學(xué)評價：成軟骨誘導(dǎo) 21 天，取各組的細胞微球及纖維蛋白凝膠，PBS 洗 1 次，4% 多聚甲醛 4 ℃ 固定過夜，20%、30% 蔗糖多聚甲醛溶液依次沉底，OTC 膠包埋，行冰凍切片和相應(yīng)染色。

蘇木精－伊紅染色：無水乙醇固定切片數(shù)秒，輕柔水洗 1 次，蘇木精染色 10 min，水洗，1% 鹽酸乙醇分化，返藍液返藍，伊紅染色 20 min 后用雙蒸水洗去多余燃料。脫水、透明、封固。觀察組織結(jié)構(gòu)及胞外基質(zhì)的變化。

番紅－O 染色：無水乙醇固定切片數(shù)秒，輕柔水洗 1 次，0.1% 番紅 O 染色 3 min，水洗 3 次，0.1%醋酸分化 1 s，雙蒸水洗 1 min。脫水、透明、封固。酸性黏蛋白、蛋白聚糖均會被染成紅色。

( 2 ) 細胞微球及水凝膠 DNA 含量檢測：第21 天，各組細胞微球及凝膠以 125 μg / ml 木瓜蛋白酶消化，65 ℃ 水浴 18 h，所得組織消化液一半用于GAG 含量檢測，另一半用于 DNA 提?。航M織消化液中加入 200 μg / ml 蛋白酶 K 繼續(xù)消化，55 ℃ 水浴過夜，飽和氯化鈉 / tris 酚 / 氯仿 / 乙醇提取 DNA，Nanodrop2000 檢測 DNA 濃度。

( 3 ) 細胞微球及水凝膠糖胺聚糖 ( GAG ) 含量檢測：每組留存的組織消化液 50 μl 加入 96 孔板，加入 200 μl 預(yù)先配置好的 DMMB 染色液。另外取0.1 mg / ml 硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)儲存液用雙蒸水稀釋成不同濃度 0.02 mg / ml、0.04 mg / ml、0.06 mg / ml、0.08 mg / ml、0.1 mg / ml 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。室溫靜置2 min，525 nm 波長下測量各孔吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出 GAG 濃度。

( 4 ) 實時定量 PCR 檢測 II 型膠原的表達：利用Trizol 法提取微球及水凝膠中總 RNA。根據(jù)試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄及 q-PCR 反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Biotool 公司 All-in-One cDNA Synthesis SuperMix，貨號 B24403；定量 PCR 試劑盒為康維世紀(jì)公司UltraSYBR Mixture ( Low ROX )，貨號 CW2601S。定量 PCR 所用的儀器為 Thermo Fisher 公司 QuanStudio5型 PCR 儀，反應(yīng)條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，57 ℃、1 min，40 個循環(huán)，57 ℃ 延伸 1 min。檢測目的基因為 II 型膠原，以 GAPDH 為內(nèi)參基因，各引物序列見表2。采用 ΔΔCt 法計算各組基因相對表達量。

表2 PCR 引物序列Tab.2 Primer sequence of each gene

二、統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行分析。組間數(shù)據(jù)比較采用 t 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、細胞微球和纖維蛋白凝膠蘇木精－伊紅染色情況

為描述方便，將無 TGFβ3 的 Pellet 組、添加TGFβ3 誘導(dǎo)的 Pellet 組、無 TGFβ3 的纖維蛋白凝膠組及添加 TGFβ3 誘導(dǎo)的纖維蛋白凝膠組分別以I 組、II 組、III 組、IV 組表示，下同。培養(yǎng) 21 天，III 組、IV 組仍可見凝膠支架。II 組和 IV 組軟骨細胞外基質(zhì)表達較 I 組和 III 組明顯增多，融合成片。III 組、IV 組與 I 組、II 組比較，其結(jié)構(gòu)更加均一，有軟骨陷窩樣結(jié)構(gòu)形成，IV 組較其余各組組胞外基質(zhì)表達更多 ( 圖1 )。

二、細胞微球和纖維蛋白凝膠番紅－O 染色情況

成軟骨誘導(dǎo) 21 天，添加 TGFβ3 誘導(dǎo)的 II 組、IV 組番紅 O 染色呈陽性，證實有大量蛋白聚糖表達。未添加誘導(dǎo)因子的 I 組、III 組，蛋白聚糖表達較弱。IV 組較 II 組異染性著色更強 ( 圖2 )。

三、細胞微球和纖維蛋白凝膠 DNA、GAG 含量檢測

培養(yǎng) 21 天，各組間 DNA 總量差異無統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＞0.05 )，( 圖3a )。添加 TGFβ3 誘導(dǎo)后，II 組、IV 組 GAG 的表達量顯著高于對應(yīng)的 I 組、III 組，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＜0.05 ) ( 圖3b )。采用 GAG 含量與 DNA 含量的比值衡量 GAG 分泌能力的相對大小，并將未添加誘導(dǎo)的 I 組數(shù)值作為 1，其余各組的數(shù)值為相對 I 組的倍數(shù)大小。添加了誘導(dǎo)因子 TGFβ3 后，II 組、IV 組 GAG 的分泌能力均高于 I 組、III 組，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＜0.05 )，II 組、III 組 GAG 分泌能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＞0.05 )，IV 組 GAG 的分泌能力顯著高于其余各組 ( P＜0.05 ) ( 圖3c )。

四、細胞微球和纖維蛋白凝膠成軟骨特異性分子基因表達檢測

培養(yǎng) 21 天，II 組 II 型膠原相對表達量高于I 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＜0.05 ) ( 圖4a )。IV 組II 型膠原相對表達量亦高于 III 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＜0.05 ) ( 圖4b )。比較各組間 II 型膠原相對表達量的高低，將 I 組數(shù)值作為 1，可見凝膠組添加誘導(dǎo)因子 TGFβ3 后 ( IV 組 )，其 II 型膠原相對表達量高于其余各組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 ( P＜0.05 )，II 組、III 組 II 型膠原相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義( P＞0.05 ) ( 圖4c )。

圖1 細胞微球和纖維蛋白凝膠蘇木精 -伊紅染色情況 ( × 400 ) a：為未添加TGFβ3 誘導(dǎo)的 Pellet 組；b：為添加了TGFβ3 誘導(dǎo)的 Pellet 組；c：為未添加TGFβ3 誘導(dǎo)的纖維蛋白凝膠組；d：為添加了 TGFβ3 誘導(dǎo)的纖維蛋白凝膠組。標(biāo)尺 = 25 μm圖2 細胞微球和纖維蛋白凝膠番紅 - O染色情況 ( × 400 ) a：為未添加 TGFβ3誘導(dǎo)的 Pellet 組；b：為添加了 TGFβ3 誘導(dǎo)的 Pellet 組；c：為未添加 TGFβ3 誘導(dǎo)的纖維蛋白凝膠組；d：為添加了 TGFβ3 誘導(dǎo)的纖維蛋白凝膠組。標(biāo)尺 = 25 μmFig.1 Cell microspheres and fi brin gel HE staining ( × 400 ) a: Pellet without TGFβ3 induction; b: Pellet with TGFβ3 induction; c: Fibrin gel without TGFβ3 induction; d: Fibrin gel with TGFβ3 induction. Bar = 25 μmFig.2 Cell microspheres and fi brin gel red-O staining ( × 400 ) a: Pellet without TGFβ3 induction; b: Pellet with TGFβ3 induction; c: Fibrin gel without TGFβ3 induction; d: Fibrin gel with TGFβ3 induction. Bar = 25 μm

討 論

軟骨組織工程利用三維立體支架材料結(jié)合種子細胞體外構(gòu)建有功能的軟骨，修復(fù)缺損，給軟骨損傷的治療帶來了曙光。多項研究已表明，TGF-β 結(jié)合特定的培養(yǎng)條件，可在體外誘導(dǎo)胚胎干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞及脂肪源干細胞成軟骨分化[13]。脂肪干細胞可從全身多處部位提取，來源豐富。與其它來源干細胞相比，還具有增殖快、數(shù)量眾多、免疫源性低、不易造成損傷等優(yōu)點。研究表明，利用瓊脂糖凝膠支架，搭載脂肪源干細胞與搭載骨髓間充質(zhì)干細胞，兩者形成的軟骨組織在力學(xué)性能上差異無統(tǒng)計學(xué)意義[14]，而單位體積脂肪組織內(nèi)的干細胞數(shù)目是同體積骨髓中骨髓間充質(zhì)干細胞數(shù)目的40 倍[15]。脂肪干細胞作為一種優(yōu)秀的種子細胞，具有良好的應(yīng)用前景。

有報道表明，軟骨細胞采用二維培養(yǎng)容易發(fā)生去分化，軟骨相關(guān)細胞外基質(zhì)的合成減少[16]。一個可供細胞黏附、增殖與分化的三維結(jié)構(gòu)是體外誘導(dǎo)干細胞成軟骨所必需的。既往研究表明，細胞通過 Pellet 培養(yǎng)無需支架即可形成類軟骨組織[17]。Pellet 培養(yǎng)能較好地模擬體內(nèi)微環(huán)境，高密度細胞聚集又可增強細胞間相互作用，促進細胞因子的誘導(dǎo)效應(yīng)。纖維蛋白凝膠由機體自身產(chǎn)生，種屬間差異小，免疫源性低，在臨床上應(yīng)用廣泛，常作為止血劑和密封劑[18]，在組織工程領(lǐng)域也被廣泛應(yīng)用。其多孔的網(wǎng)狀微觀結(jié)構(gòu)，是種子細胞的良好載體。有研究也將纖維蛋白作為藥物的緩釋系統(tǒng)[19]，進行藥物投遞。Homminga 等[20]利用纖維蛋白凝膠體外結(jié)合兔軟骨細胞，體外培養(yǎng) 7 天，發(fā)現(xiàn)軟骨細胞可保持良好的形態(tài)與增殖能力并分泌軟骨細胞外基質(zhì)。通常認為，軟骨細胞胞外基質(zhì)成熟需要 6 周，而纖維蛋白凝膠在體內(nèi) 2～3 周已降解完全。王九現(xiàn)等[21]研究表明，在纖維蛋白凝膠中加入少量抑酞酶可抑制其降解。朱立新等[22]利用兔軟骨細胞復(fù)合加入抑酞酶、氨甲環(huán)酸改良的纖維蛋白凝膠支架，植入兔關(guān)節(jié)軟骨損傷處，植入后 12 周取材發(fā)現(xiàn)纖維蛋白凝膠降解速度明顯減緩。改良后的纖維蛋白凝膠，已日益成為軟骨組織工程支架的首選。

圖3 細胞微球和纖維蛋白凝膠 DNA、GAG 含量檢測 a：各組 DNA 含量情況；b：各組 GAG 含量情況；c：各組 GAG / DNA 比值的大小情況Fig.3 Cell microspheres and fi brin gel DNA, GAG content detection a: The DNA content of each group; b: The content of GAG in each group; c: The size of each group GAG / DNA ratio

圖4 細胞微球和纖維蛋白凝膠成軟骨特異性分子基因表達檢測 a：示細胞微球組 II 型膠原相對表達量；b：示纖維蛋白凝膠組 II 型膠原相對表達量；c：示各組間 II 型膠原相對表達量的大小情況Fig.4 Cell microspheres and fi brin gel cartilage-specif i c molecular gene expression detection a: The relative expression of type II collagen in cell microspheres group; b: The relative expression of type II collagen in fi brin gel group; c: The relative amount of type II collagen of each group

本研究結(jié)果表明，在改良的纖維蛋白凝膠中，添加 TGF-β3 誘導(dǎo)因子，可成功誘導(dǎo)人脂肪干細胞向軟骨分化，構(gòu)建軟骨樣組織。蘇木精－伊紅染色顯示，添加誘導(dǎo)的凝膠支架組中細胞已具有軟骨細胞的典型形態(tài)，即圓形或橢圓形的軟骨細胞，番紅－O 染色顯示，添加誘導(dǎo)的凝膠支架組軟骨細胞外基質(zhì)大量分泌，并融合成片，表明纖維蛋白凝膠支架聯(lián)合誘導(dǎo)因子能夠更好地促進干細胞成軟骨分化、維持軟骨細胞表型。糖胺聚糖 ( glycosaminoglycan，GAG ) 是關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)中的特征性物質(zhì)，具有黏滯性，常覆蓋在關(guān)節(jié)面上，具有潤滑和保護作用。本研究通過 DMMB 染色法測定各組中 GAG的含量。研究結(jié)果顯示，添加 TGF-β3 誘導(dǎo)后，纖維蛋白凝膠組和細胞微球組 GAG 表達均升高，而GAG / DNA 結(jié)果顯示，纖維蛋白凝膠組促 GAG 分泌的能力相對更強，從而合成的組織工程軟骨在功能上更接近原生軟骨組織。II 型膠原是軟骨基質(zhì)中最重要的標(biāo)志物，絲狀的膠原蛋白纖維與彈性蛋白及多糖蛋白相互交織形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生一定的機械強度，維持關(guān)節(jié)軟骨的彈性與韌性。本研究通過實時定量 PCR 觀察 II 型膠原 ( Col2a1 ) 基因的表達，結(jié)果顯示，添加 TGFβ3 的纖維蛋白凝膠組誘導(dǎo) II 型膠原 mRNA 表達的能力最強。纖維蛋白凝膠組 Col2a1 mRNA 及 GAG 的表達均顯著高于 Pellet 組，這可能是由于纖維蛋白凝膠具有三維微觀孔隙結(jié)構(gòu)，表面積 / 體積比較大，細胞間交互作用更強[23]；且纖維蛋白凝膠自身亦可釋放血小板生成因子 PDGF 及TGF-β[24]，進一步促進細胞增殖和軟骨基質(zhì)的合成。未添加 TGFβ3 的凝膠支架組，其 GAG 水平及II 型膠原基因表達與添加了 TGFβ3 誘導(dǎo)的 Pellet 組幾乎一致，這可能是由于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的 ITS＋及地塞米松具有一定的誘導(dǎo)成軟骨效應(yīng)[25-26]，在纖維凝膠多孔支架中能較好地發(fā)揮成軟骨誘導(dǎo)效應(yīng)。

本研究表明利用纖維蛋白凝膠支架誘導(dǎo)人脂肪干細胞成軟骨分化的能力優(yōu)于無支架的單純 Pellet培養(yǎng)，所形成的軟骨組織在功能與結(jié)構(gòu)上更接近天然軟骨，說明利用纖維蛋白支架誘導(dǎo)成軟骨效率更高。這為今后利用纖維蛋白凝膠復(fù)合自體脂肪干細胞再生組織工程軟骨提供了實驗依據(jù)，并為軟骨損傷的臨床治療提供了新的思路。

[1]Aichroth PM, Patel DV, Moyes ST. A prospective review of arthroscopic debridement for degenerative joint disease of the knee[J]. Int Orthop, 1991, 15(4):351-355.

[2]Aubin PP, Cheah HK, Davis AM, et al. Long-term follow up of fresh femoral osteochondral allografts for posttraumatic knee defects[J]. Clin Orthop Relat Res, 2001, (391 Suppl):S318-327.

[3]Ghazavi MT, Pritzker KP, Davis AM, et al. Fresh osteochondral allografts for post-traumatic osteochondral defects of the knee[J]. J Bone Joint Surg Br, 1997, 79(6):1008-1013.

[4]Knutsen G, Drogset JO, Engebretsen L, et al. A randomized multicenter trial comparing autologous chondrocyte implantation with microfracture: long-term follow-up at 14 to 15 years[J]. J Bone Joint Surg Am, 2016, 98(16):1332-1339.

[5]Zhu H, Yang F, Tang B, et al. Mesenchymal stem cells attenuated PLGA-induced in fl ammatory responses by inhibiting host DC maturation and function[J]. Biomaterials, 2015, 53:688-698.

[6]Ringe J, Sittinger M. Tissue engineering in the rheumatic diseases[J]. Arthritis Res Ther, 2009, 11(1):211.

[8]Mehlhorn AT, Niemeyer P, Kaschte K, et al. Differential effects of BMP-2 and TGF-beta1 on chondrogenic differentiation of adipose derived stem cells[J]. Cell Prolif, 2007, 40(6):809-823.

[9]Eslaminejad MB, Karimi N, Shahhoseini M. Chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells treated by GSK-3 inhibitors[J]. Histochem Cell Biol, 2013, 140(6):623-633.

[10]An HS, Thonar EJ, Masuda K. Biological repair of intervertebral disc[J]. Spine, 2003, 28(15 Suppl):S86-92.

[11]曹誼林. 組織工程學(xué)研究進展[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報醫(yī)學(xué)版, 2008, 28(7):763-766.

[12]Dare EV, Griffith M, Poitras P, et al. Fibrin sealants from fresh or fresh/frozen plasma as scaffolds for in vitro articular cartilage regeneration[J]. Tissue Eng Part A, 2009, 15(8): 2285-2297.

[13]Lieb E, Milz S, Vogel T, et al. Effects of transforming growth factor beta1 on bonelike tissue formation in three-dimensional cell culture. I. Culture conditions and tissue formation[J]. Tissue Eng, 2004, 10(9-10):1399-1413.

[14]Vinardell T, Buckley CT, Thorpe SD, et al. Compositionfunction relations of cartilaginous tissues engineered from chondrocytes and mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and infrapatellar fat pad[J]. J Tissue Eng Regen Med, 2011, 5(9):673-683.

[15]Zhu Y, Liu T, Song K, et al. Adipose-derived stem cell: a better stem cell than BMSC[J]. Cell Biochem Funct, 2008, 26(6): 664-675.

[16]Cancedda R, Dozin B, Giannoni P, et al. Tissue engineering and cell therapy of cartilage and bone[J]. Matrix Biol, 2003, 22(1):81-91.

[17]Ishihara K, Nakayama K, Akieda S, et al. Simultaneous regeneration of full-thickness cartilage and subchondral bone defects in vivo using a three-dimensional scaffold-free autologous construct derived from high-density bone marrowderived mesenchymal stem cells[J]. J Orthop Surg Res, 2014, 9:98.

[18]Spicer PP, Mikos AG. Fibrin glue as a drug delivery system[J]. J Control Release, 2010, 148(1):49-55.

[19]Ahearne M, Buckley CT, Kelly DJ. A growth factor delivery system for chondrogenic induction of infrapatellar fat padderived stem cells in fibrin hydrogels[J]. Biotechnol Appl Biochem, 2011, 58(5):345-352.

[20]Homminga GN, Buma P, Koot HW, et al. Chondrocyte behavior in fibrin glue in vitro[J]. Acta Orthop Scand, 1993, 64(4):441-445.

[21]王九現(xiàn), 朱立新, 靳安民, 等. 抑肽酶/氨甲環(huán)酸改良可注射性纖維蛋白凝膠的體外實驗[J]. 中國組織工程研究, 2008, 12(49):9703-9708.

[22]朱立新, 李奇, 林荔軍, 等. 改良纖維蛋白膠軟骨膜塊在模擬微重力培養(yǎng)下修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損[J]. 中國骨與關(guān)節(jié)損傷雜志, 2008, 23(9):741-744.

[23]Sheehy EJ, Mesallati T, Vinardell T, et al. Engineering cartilage or endochondral bone: a comparison of different naturally derived hydrogels[J]. Acta Biomaterialia, 2014, 13:245-253.

[24]Sims CD, Butler PE, Cao YL, et al. Tissue engineered neocartilage using plasma derived polymer substrates and chondrocytes[J]. Plastic Reconstr Surg, 1998, 101(6): 1580-1585.

[25]Liu X, Liu J, Kang N, et al. Role of insulin-transferrin-selenium in auricular chondrocyte proliferation and engineered cartilage formation in vitro[J]. Int J Mol Sci, 2014, 15(1):1525-1537.

[26]Sher L, Oquendo MA, Burke AK, et al. Combined dexamethasone suppression-corticotrophin-releasing hormone stimulation test in medication-free major depression and healthy volunteers[J]. J Affect Disord, 2013, 151(3):1108-1112.

( 本文編輯：李貴存 )

Comparison of in vitro chondrogenic ability between two culture modes: pellet culture system and fi brin gel scaffold

HUANG Liang-jie, WENG Tu-jun, ZHANG Chun-li, LIU Yan, QIAN Long, HOU Shu-xun. Xijing Hospital,the fourth Military Medical University, Xi’an, Shanxi, 710032, China

HOU Shu-xun, Email: hsxortho@hotmail.com

ObjectiveTo compare the effects of 2 different culture modes: pellet culture system and fi brin gel scaffold on the chondrocytic differentiation of adipose-derived stem cells ( ADSCs ) and the synthesis of cartilage extracellular matrix. Methods Adipose tissues were used to isolate human ADSCs and grown in Dulbecco’s modif i ed Eagle’s medium ( DMEM ) containing 10% fetal bovine serum ( FBS ). After the human ADSCs were cultured to the 3rd generation, they were induced into cartilage by 2 kinds of culture modes respectively. At the 21st day, the cells were observed by hematoxylin-eosin ( HE ) staining and safranine-O staining. The glycosaminoglycan ( GAG ) content in extracellular matrix was determined by content dimeth-ylmethylene blue ( DMMB ) method. The expression of type II collagen gene was assessed by real-time polymerase chain reaction ( PCR ). Results HE staining and safranine-O staining showed that the extracellular matrix of chondrocytes was strongly secreted in the fi brin gel scaffold group with transforming growth factor β3 ( TGFβ3 ) and fused into a sheet. It’s indicated that the fi brin gel scaffold could better promote cartilage differentiation of stem cells and maintain chondrocyte type. The results of GAG / deoxyribonucleic acid ( DNA ) showed that the ability to secrete GAG in the fi brin gel scaffold group with TGFβ3 was better than that of the other group ( P ＜ 0.05 ), and the expression of type II collagen messenger ribonucleic acid ( mRNA ) was the strongest ( P ＜ 0.05 ). Conclusions The ability of fi brin gel scaffold to differentiate ADSCs into cartilage is better than that of scaffold-free pellet culture system.

Fibrin; Stem cells; Tissue engineering; Cartilage; Pellet culture; Adipose-derived stem cell

10.3969/j.issn.2095-252X.2017.03.008

Q254, R318

710032 西安，第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 ( 黃亮節(jié) )；100048 北京，解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院骨科、北京市骨科植入醫(yī)療器械工程技術(shù)研究中心 ( 翁土軍、張春麗、劉彥、錢隆、侯樹勛 )

侯樹勛，Email: hsxortho@hotmail.com

2016-10-11 )