武鳳潔　朱曄榮**　姬曉櫞　楊　琳劉苗苗　李亞輝　白艷玲　王　勇**

（1南開大學生命科學學院　天津　300071　2天津師范大學生命科學學院　天津　300384）

浮萍（Lemna minor）屬于浮萍科（lemnaceae），為最簡單的單子葉水生漂浮植物，雖然小而簡單，但是多年來，圍繞浮萍在植物生理學、遺傳學、生態(tài)學等領(lǐng)域展開了眾多理論研究，同時被廣泛應(yīng)用于除草劑的篩選、水環(huán)境污染程度監(jiān)測、重要藥用蛋白的生產(chǎn)和水體污染的修復，同時因為浮萍的淀粉和蛋白含量高而被開發(fā)為生物質(zhì)能和優(yōu)質(zhì)蛋白生產(chǎn)的優(yōu)勢原料［1-5］，使得浮萍成為研究、開發(fā)和應(yīng)用領(lǐng)域的熱點和焦點。遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)是理論研究和拓寬應(yīng)用開發(fā)領(lǐng)域最重要且最有效的手段之一，特別是浮萍藥用蛋白生物反應(yīng)器的建立，高產(chǎn)淀粉或蛋白優(yōu)質(zhì)浮萍株系的獲得等，都離不開穩(wěn)定高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

相對于其他重要農(nóng)作物和模式植物的遺傳轉(zhuǎn)化體系，浮萍侵染體系的研究報道相對甚少［6-7］。此外，針對不同的浮萍屬，其再生和侵染體系的特異性較強，因此不同屬浮萍遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立，對于通過轉(zhuǎn)基因進行浮萍的相關(guān)機理研究和生產(chǎn)開發(fā)應(yīng)用至關(guān)重要。本研究是在課題組建立和優(yōu)化了浮萍組培體系的基礎(chǔ)上［8］，通過不同條件的摸索和優(yōu)化，建立了浮萍穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為通過基因轉(zhuǎn)化對浮萍進行理論研究和開發(fā)應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1.1實驗材料供試材料浮萍由本實驗室保存；轉(zhuǎn)化載體含有擬南芥絲氨酸：乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因（Serine：Glyoxylate Aminotransferase,AtAGT1），由本實驗室構(gòu)建（圖1，見封四）；供試農(nóng)桿菌菌株為EHA105、LBA4404 和 C58C1。

1.2實驗方法

1.2.1浮萍轉(zhuǎn)化體系的建立浮萍遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立根據(jù)文獻6、文獻7進行摸索，首先將浮萍葉狀體放于誘導培養(yǎng)基上3周后形成愈傷組織，然后轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基中進行繼代培養(yǎng)，以繼代培養(yǎng)后的浮萍愈傷為原材料進行浮萍的遺傳轉(zhuǎn)化，包括共培養(yǎng)和篩選及再生培養(yǎng)。其中，誘導和繼代培養(yǎng)基與文獻8相同，共培養(yǎng)培養(yǎng)基是在B5基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加了100 μmol/L乙酰丁香酮，篩選培養(yǎng)基是在繼代培養(yǎng)基中加入抑菌抗生素和潮霉素，再生培養(yǎng)基是在文獻8中的再生培養(yǎng)基中加入抑菌抗生素和潮霉素。

1.2.2浮萍轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化使用不同種類的農(nóng)桿菌（農(nóng)桿堿型 EHA105、胭脂堿型 GV3101和C58C1）對浮萍進行侵染，統(tǒng)計侵染3 d后浮萍愈傷的GUS瞬時表達率確定哪種農(nóng)桿菌對浮萍的侵染效率最高。

采 用 0、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L的乙酰丁香酮侵染同一批浮萍愈傷，統(tǒng)計侵染3 d后浮萍愈傷組織的GUS瞬時表達率確定乙酰丁香酮的最適作用濃度。

將農(nóng)桿菌活化于分別含有頭孢霉素和羧芐青霉素（0、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L、250 mg/L、300 mg/L）的培養(yǎng)基中，通過測定其OD值觀察其抑菌效果。

將野生型愈傷組織和葉狀體放于不同濃度的潮霉素篩選培養(yǎng)基中，觀察野生型愈傷組織和葉狀體的狀態(tài)確定篩選濃度。

1.2.3轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定將再生的轉(zhuǎn)基因植株在液體培養(yǎng)基中進行抗性篩選，選擇生長較好的抗性植株，進行GUS染色，并采用SDS法提取基因組DNA，采用RNA提取試劑盒提取抗性植株RNA進行PCR檢測，PCR檢測出具有目的條帶的為陽性植株。其中，RNA提取試劑盒為TaKaRaMiniBEST，來源于北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司；PCR引物為：

2　結(jié)果與分析

2.1不同類型的農(nóng)桿菌對浮萍侵染效率的比較

使用不同農(nóng)桿菌對抗性浮萍愈傷組織的GUS瞬時表達率檢測結(jié)果顯示，農(nóng)桿菌EHA105的侵染效率要高于GV3101和C58C1，因此浮萍遺傳轉(zhuǎn)化確定選用農(nóng)桿菌EHA105（圖2）。

圖2　不同類型的農(nóng)桿菌對浮萍愈傷組織侵染的瞬時表達率比較

2.2乙酰丁香酮濃度對侵染效率的影響本實驗使用添加不同濃度乙酰丁香酮（0、50 μmol/L、100 μmol/L、150 μmol/L、200 μmol/L）的菌液侵染浮萍，發(fā)現(xiàn)隨著乙酰丁香酮濃度的升高，侵染效率先升高后降低，當乙酰丁香酮濃度為100 μmol/L時，浮萍的侵染效率最高（圖3）。

圖3　不同濃度乙酰丁香酮對EHA105介導的浮萍愈傷組織瞬時轉(zhuǎn)化率的影響

2.3抗生素濃度的確定頭孢霉素（Cef）和羧芐青霉素（Carb）都具有抑制農(nóng)桿菌生長的作用，在侵染過程中抑制農(nóng)桿菌過度生長是轉(zhuǎn)基因成敗的關(guān)鍵，因此抗生素濃度的選擇至關(guān)重要。本實驗采用檢測OD值觀察抗生素對農(nóng)桿菌的抑制效果，由圖4可知，頭孢霉素和羧芐青霉素對農(nóng)桿菌EHA105都有很好的抑制效果，濃度為300 mg/L時可以完全抑制農(nóng)桿菌的生長，所以在侵染浮萍愈傷組織時選擇頭孢霉素或羧芐青霉素作為抑菌的抗生素，其最佳濃度都選用300 mg/L。

圖4　頭孢霉素和羧芐青霉素對農(nóng)桿菌EHA105生長的影響

2.4潮霉素篩選濃度的確定

2.4.1固體潮霉素篩選濃度的確定在篩選培養(yǎng)過程中，隨著潮霉素濃度的增加，野生型浮萍愈傷組織的存活率不斷下降，當潮霉素濃度為60 mg/L時，愈傷組織的存活率為0，因此，固體潮霉素篩選的最佳濃度為60 mg/L，結(jié)果見表1。

表1　固體潮霉素篩選濃度的確定

2.4.2液體潮霉素篩選濃度的確定使用野生型（WT）和轉(zhuǎn)潮霉素篩選基因的浮萍（OE1）作為實驗材料，當用不同濃度的潮霉素進行處理后，其表型變化如圖 5～圖 7（見封四），當 Hyg濃度為1 mg/L時，WT植株的根變?yōu)榘咨~狀體生長明顯受到抑制，當Hyg濃度大于1 mg/L時，WT植株根掉落，葉狀體逐漸變白直至死亡。因此篩選轉(zhuǎn)基因植株的最低Hyg濃度為1 mg/L。當Hyg濃度為10 mg/L時，OE1轉(zhuǎn)基因植株的生長明顯受到抑制，當Hyg濃度大于10 mg/L時，OE1植株的葉狀體變小，而且葉狀體上葉脈凸顯，且根全部變白，因此篩選轉(zhuǎn)基因植株的最高Hyg濃度選用10mg/L。

2.5浮萍轉(zhuǎn)化體系的建立經(jīng)過反復摸索，建立了浮萍的遺傳轉(zhuǎn)化體系。首先用含有OD值為0.5～0.8的農(nóng)桿菌YEP培養(yǎng)液侵染浮萍愈傷組織，于28℃暗培養(yǎng)3 d，超聲清洗愈傷組織后將其放于含有抗性的篩選培養(yǎng)基中進行篩選培養(yǎng)2～3周，直至長出綠色抗性愈傷組織，隨后將其轉(zhuǎn)接到再生培養(yǎng)基中進行再生培養(yǎng)3周，將再生出的苗轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中進行擴繁鑒定。

2.6轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

2.6.1抗性苗的篩選將再生出的苗選取單株接入含有潮霉素的篩選培養(yǎng)基中進行篩選，5 d后觀察結(jié)果如（圖6），非轉(zhuǎn)基因植株變白死亡，轉(zhuǎn)基因植株能適應(yīng)液體環(huán)境并進行擴繁。

2.6.2GUS染色鑒定將已經(jīng)擴繁的植株取一部分進行GUS染色鑒定,鑒定結(jié)果如（圖7）。由圖7可知,經(jīng)過潮霉素篩選后的植株全為轉(zhuǎn)基因植株，但是不同轉(zhuǎn)基因株系的基因表達量存在一定的差異。

2.6.3分子鑒定選取長勢良好、基因表達量高的3株抗性株系提取DNA和RNA，進行PCR檢測，檢測結(jié)果顯示PCR片段大小符合實驗設(shè)計（圖8），初步結(jié)果表明已經(jīng)獲得轉(zhuǎn)基因植株。

圖8　轉(zhuǎn)基因植株分子鑒定圖

3　討論

自從本課題組開始建立浮萍再生體系的同時，也在開始摸索建立浮萍的遺傳轉(zhuǎn)化體系，因為可參閱的浮萍轉(zhuǎn)化方面的文獻較少，期間發(fā)現(xiàn)有很多因素影響該體系的穩(wěn)定性，通過多方面的不斷摸索和優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)除需要注意培養(yǎng)溫度和光周期外，以下幾個因素的確定也很關(guān)鍵。

3.1侵染方法結(jié)合浮萍的結(jié)構(gòu)特點，可以選擇的植物轉(zhuǎn)化技術(shù)主要包括基因槍法、化學藥劑誘導法、顯微注射法、激光微束穿刺法、多聚陽離子基因?qū)敕?、農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法等。鑒于成本、技術(shù)等問題，選擇農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法進行轉(zhuǎn)基因植株的獲得較為普遍，應(yīng)用也比較廣泛，而且前期課題組已經(jīng)建立了浮萍的再生體系。有研究表明不同植物對農(nóng)桿菌的敏感性不同，且不同的農(nóng)桿菌對植物的侵染能力也不同，因此對于浮萍來說，選擇侵染效率高的農(nóng)桿菌至關(guān)重要。本研究顯示EHA105菌株對浮萍的侵染效率較其他菌株高。

3.2乙酰丁香酮的使用乙酰丁香酮AS是雙子葉植物細胞壁合成的前體，通常單子葉植物在轉(zhuǎn)化過程中不產(chǎn)生AS，所以在轉(zhuǎn)化過程中外源添加AS可以促進根癌農(nóng)桿菌感染單子葉植物。因為浮萍屬于單子葉水生植物，因此，在侵染過程中加入AS是必需的，且合適濃度的AS對侵染效率很重要，本研究顯示當AS濃度為100 μmol/L時，外源基因?qū)Ω∑嫉那秩拘首罡摺?/p>

3.3篩選抗生素濃度的確定當共培養(yǎng)結(jié)束后，植株在篩選培養(yǎng)基中篩選時，首先需要抑制農(nóng)桿菌的生長，因此選擇合適的抑菌抗生素和濃度很關(guān)鍵。本實驗顯示頭孢霉素和羧芐青霉素都可以在300 mg/L時發(fā)揮很好的抑菌作用。在抑菌之后的篩選過程中，篩選具有抗性的轉(zhuǎn)化材料是獲得轉(zhuǎn)基因植株的首要前提，因此植株抗性濃度的確定很重要，如果抗生素濃度過低，起不到篩選的作用，會出現(xiàn)大量假陽性植株，加大后期的工作量；若抗生素濃度太高，會將抗性植株也殺死，導致遺傳轉(zhuǎn)化不能順利進行，本實驗以潮霉素的研究顯示，60 mg/L和10 mg/L分別是浮萍固體和液體潮霉素篩選的最佳濃度。

［1］朱曄榮,馬榮,劉清岱,等.浮萍相關(guān)研究的幾方面重要進展.生物學通報，2010，45（4）:4.

［2］朱曄榮,李亞輝,劉苗苗,等.新型能源植物浮萍生物質(zhì)能的研究與開發(fā).自然雜志，2013，35（5）:1.

［3］朱曄榮,劉苗苗,李亞輝,等.植物淀粉生物合成調(diào)節(jié)機制的研究進展.植物生理學報，2013,49(12):1.

［4］Verma R， Suthar S.Utility of Duckweeds as Source of Biomass Energy:a Review.Bioenerg.Res.2015(8):1589.

［5］Stomp A M,Rajbhandari N.Method for producing stablytransformedduckweedusingmicroprojectilebombardment.United States Patent 7161064.Publication Date.2007(1):9.

［6］Suk Min Ko,Hyeon Jin Sun,Myung Jin Oh,et al.Expression of the Protective Antigen for PEDVin Transgenic Duckweed,Lemna minor.Environment Biotechnology.2011,52(5):511.

［7］Aleksey Firsov Irina Tarasenko,Tatiana Mitiouchkinaet al.High Yield Expression of M2e Peptide of Avian Influenza VirusH5N1 in Transgenic Duckweed Plants.Biotechnology,2015(57):653.

［8］王勇,楊琳,朱曄榮,等.高效浮萍再生體系的建立:中國,CN102487827A[P]2013-5-6.