孫艷偉，張澤生，2，3，王田心，2，*，李雨蒙，秦程廣

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457；2.天津科技大學食品工程與生物技術學院食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津300457；3.天津食品安全低碳制造協同創(chuàng)新中心，天津300457）

十字花科植物中黑芥子酶的研究進展

孫艷偉1，張澤生1，2，3，王田心1，2，*，李雨蒙1，秦程廣1

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津300457；2.天津科技大學食品工程與生物技術學院食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津300457；3.天津食品安全低碳制造協同創(chuàng)新中心，天津300457）

黑芥子酶是一種存在于十字花科植物中用以水解硫代葡萄糖苷的酶，且水解產物因具有抗癌作用而受到廣泛關注。對黑芥子酶的分布、結構及活性等方面進行了概述，著重介紹了十字花科植物中黑芥子酶的提取及活性測定方法，并簡述了黑芥子酶的應用。

十字花科植物；黑芥子酶；硫代葡萄糖苷；研究進展

隨著人們生活水平的提高，居民膳食結構中高糖、高脂食品攝入逐漸增多，過多的能量攝入可能導致癌癥、動脈硬化等慢性病的發(fā)生，因此近年來防癌抗癌及慢性病防治一直是醫(yī)學界及營養(yǎng)界的研究熱點。十字花科蔬菜是我國常見的八大蔬菜之一，品種繁多，因其普遍含有天然抗癌物質而受到廣泛關注。十字花科植物中含有的硫代葡萄糖苷可被黑芥子酶高效降解得到異硫氰酸酯等代謝產物[1]，研究表明異硫氰酸酯類物質不僅是形成十字花科蔬菜特有風味的化合物，還具有參與植物防御及人類癌癥預防等生物活性[2-5]。近年來，黑芥子酶作為降解硫代葡萄糖苷的重要酶源，成為抗癌研究的新方向。本文主要綜述了國內外十字花科植物中黑芥子酶的研究進展，旨在為黑芥子酶的進一步研究和應用提供參考。

1 黑芥子酶概述

1.1 黑芥子酶及其分布

黑芥子酶（myrosinase，EC3.2.1），又稱 β-硫代葡萄糖苷酶，是一種普遍存在于十字花科植物中可將硫代葡萄糖苷高效降解的酶類[6-7]。它性質穩(wěn)定，在十字花科植物的根、莖、葉、幼苗及種子中普遍存在，分布在特定的黑芥子酶細胞中[4]。另外，在一些以十字花科蔬菜為食的昆蟲、哺乳動物組織、真菌及其多型擬桿菌等腸道細菌中都有黑芥子酶的存在[8-11]，研究表明胃腸道細菌來源的黑芥子酶水解硫代葡萄糖苷產生異硫氰酸酯的轉化量較低（1%～40%）[12-13]。國內外對黑芥子酶的基因方面也進行了大量研究，其中擬南芥的黑芥子酶基因研究最多，并進行了相關黑芥子酶基因的克隆方面的研究[14-15]。

1.2 黑芥子酶的結構及同工酶

黑芥子酶的本質是一種糖蛋白，十字花科植物中存在多種黑芥子酶，不同來源的黑芥子酶其表觀分子質量、亞基數目和側鏈中糖鏈含量的高低不同[16-17]，導致不同來源的黑芥子酶對相同硫苷的降解率[18]和硫苷的降解產物組分[19]存在差異。黑芥子酶通常以同工酶的形式存在，據報道，大多數黑芥子酶同工酶是二聚物，其子單位的分子量介于65 kDa～75 kDa之間[20-23]，但相關研究表明山葵來源的黑芥子酶是由12個子單位構成，每個子單位的分子量大約是45 kDa[24]。迄今為止，黑芥子酶被認為是由MA、MB和MC 3種基因所編碼，其中MA基因編碼的黑芥子酶是以游離的二聚體形式存在，MB和MC基因編碼的黑芥子酶與其他的蛋白質混合在一起，以復合體的形式存在。黑芥子酶復合體主要包括黑芥子酶、黑芥子酶結合蛋白（Myrosinase-binding protein，MBP）、黑芥子酶協助蛋白（Myrosinase-associated protein，MyAP）[25]。

1.3 黑芥子酶的活性及影響因素

不同來源的黑芥子酶活性存在很大差異，丁艷等[26]在體外研究不同來源黑芥子酶的添加對油菜籽餅粕中硫代葡萄糖苷降解產物的影響，研究表明，來源于西蘭花的黑芥子酶可導致硫苷的降解產物增加，尤其是抗營養(yǎng)物質種類的增加；而來源于芥藍的黑芥子酶會大大提升異硫氰酸類化合物的產量。也有研究表明即使同一來源的黑芥子酶對不同結構的硫代葡萄糖苷同樣存在著反應底物的選擇性和活性差異[27]。黑芥子酶在植物的不同組織和發(fā)育階段有不同的生物活性，研究表明種子及幼苗時期黑芥子酶的活性最高[28]。另外，不同發(fā)育階段黑芥子酶的活性也有所差別，王志英等[29]研究兩種甘藍種子的發(fā)芽過程，發(fā)現黑芥子酶的活性分別在發(fā)芽第一天和第三天達到最高，且隨著種子發(fā)芽黑芥子酶的含量先上升后下降。

pH值、溫度、維生素C、壓力及光照等因素都會影響黑芥子酶的活性。研究表明，在pH值5～8的范圍內，黑芥子酶可將硫代葡萄糖苷水解為異硫氰酸酯，而pH值酸性環(huán)境中，黑芥子酶會誘導硫代葡萄糖苷水解成硫氰酸酯、腈類等抗營養(yǎng)物質[30]；黑芥子酶在高溫條件易變性失活，不同來源的黑芥子酶最適溫度不同，研究表明，甘藍源的黑芥子酶最適溫度為60℃，而辣根源的黑芥子酶最適溫度是35℃[31]；維生素C能夠激活黑芥子酶，不同來源的黑芥子酶最適的維生素C濃度不同[32]，丁艷等研究油菜籽餅粕中硫代葡萄糖苷的酶解條件時發(fā)現，低濃度的維生素C有激活黑芥子酶的功能，濃度增加后，異硫氰酸酯的生成量反而降低[33]；最新的研究表明，施加適度的壓力（200 MPa～400 MPa）可以有效保持黑芥子酶的活性，以便將其用于后續(xù)的硫代葡萄糖苷水解過程[34]；光照對黑芥子酶活性起著正調控作用[35]；另外，酶的底物也是影響黑芥子酶活性的重要因素[36]。

1.4 硫代葡萄糖苷-黑芥子酶系統(tǒng)

在植物細胞內，硫代葡萄糖苷和黑芥子酶是彼此分離的，硫代葡萄糖苷存在于液泡中，而黑芥子酶以黑芥子酶蛋白顆粒的形式存在于黑芥子酶細胞中。當植物組織受到損傷或者病蟲侵害時，黑芥子酶被釋放出來，與硫代葡萄糖苷直接接觸，并使其降解為異硫氰酸酯、硫氰酸根離子、腈類、惡唑烷硫酮等有生物活性的物質[37]。其中一些降解產物表現出毒素作用，可以抗病或抵御蟲的侵害，因此，硫代葡萄糖苷-黑芥子酶系統(tǒng)被認為是十字花科植物重要的防御系統(tǒng)，能調節(jié)十字花科植物與環(huán)境之間的相互作用，研究表明昆蟲、病原體、酸雨、干旱、鹽及重金屬脅迫會引起硫代葡萄糖苷-黑芥子酶系統(tǒng)的變化，從而影響植物防御[38]；硫代葡萄糖苷的降解產物還可以影響十字花科蔬菜的品質，賦予其特有的氣味；另外，異硫氰酸酯具有殺菌、防癌等生物活性，目前的研究主要集中于其肺癌、血癌、食道癌及乳腺癌等方面的功效[39-42]。

2 黑芥子酶的提取及分離純化

現在應用較普遍的是從十字花科種子中提取黑芥子酶，Ghawi等[43]在芥菜籽中提取出了黑芥子酶，提取方法為：首先將十字花科蔬菜的種子粉碎，取種子粉末加入緩沖溶液（pH為7.5，0.2 mol/L Tris-HCl，包含0.5 mmol/L EDTA、1.5 mmol/L二硫蘇糖醇、0.4 g交聯聚維酮），冰浴提取15 min后，低溫離心取上清，采用硫酸銨沉淀，冰浴30 min，使其飽和度達到90%，低溫離心，沉淀復溶于Tris-HCl緩沖液中，混合物采用纖維素膜和Tris-HCl緩沖液在4℃條件下透析24 h，以去除多余的硫酸銨等鹽類，離心去除不溶性雜質，制備粗酶液，樣品冷凍干燥備用。

另外，也可以從十字花科植物的食用部分提取黑芥子酶。Jwannyd等[44]在辣根中分離出2種黑芥子酶；Okunade[34]在蘿卜根中提取出了黑芥子酶，并研究了在冷藏過程中的蘿卜中黑芥子酶的活性；從食用部分提取黑芥子酶大致的步驟與上述方法相同，只是前面的處理有些差異。提取方法[14]如下：取食用部分的組織用榨汁機榨汁，加入pH 7.2的提取緩沖液（10 mmol/L磷酸鉀，3 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA 和 5%甘油），在冰上以最大速度攪拌，用紗布過濾，再用低溫離心40 min，棄去沉淀，在上清液中加入適量硫酸銨以達到55%～85%飽和度，之后過Sephadex G-50凝膠色譜柱，用33 mmol/L磷酸鉀緩沖液洗脫，最后將得到的黑芥子酶提取物濃縮后于-80℃放置，備用。

3 黑芥子酶的活性測定

黑芥子酶的活性主要通過測定葡萄糖的生成量或底物濃度變化來決定的，測定葡萄糖生成量可以用葡萄糖試劑盒、分光光度計和氣相色譜等方法。測量底物濃度的方法有：分光光度計和高效液相色譜等方法[45]。

3.1 測定葡萄糖的生成量

通過測定葡萄糖生成量來決定黑芥子酶的活性，最簡單常用的方法是采用葡萄糖試劑盒，反應完成后，在340 nm處測吸光度。黑芥子酶活力單位定義為：在pH7.5，25℃且底物為黑芥子硫苷酸鉀（sinigrin）的條件下，每分鐘催化底物得到1 μmol葡萄糖所需要黑芥子酶的量[34]。Ghawi等[46]用試劑盒測定綠色卷心菜中黑芥子酶活性時，采用的D-葡萄糖試劑盒，試劑盒反應液為 1.51 mL，組成為：0.5 mL NADP 和 ATP、10 μL己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸鹽脫氫酶、0.9 mL 7 mmol/L抗壞血酸水溶液及50 μL黑芥子酶樣品。之后讓反應液平衡5 min，加入50 μL 0.6 mol/L黑芥子硫苷酸鉀溶液，此過程會生成NADP，導致吸光度的變化，最后在340 nm處測吸光度。Sooyeon等[47]測定蘿卜中黑芥子酶的活性也是采用葡萄糖試劑盒法。另外，通過分光光度計法及氣相色譜法測定葡萄糖的生成量是國內外普遍的測量方法。需要注意的是，通過測定葡萄糖生成量來決定黑芥子酶活性的方法簡便快速、容易操作，但需防止樣品中其他葡萄糖和糖苷鍵的干擾[48-49]。

3.2 測定底物濃度變化

測量底物濃度變化來決定黑芥子酶活性時，酶活力單位的定義為：在pH6.5，37℃條件下，每分鐘催化1 μmol的底物所需要酶的量[50]。測量底物濃度的方法有分光光度計法和高效液相色譜法等[45]。Li等[51]在研究從辣根中提取的黑芥子酶活性時，采用的是分光光度計法：反應液由33.3 mmol/L pH6.5的磷酸緩沖液及0.2 mmol/L黑芥子硫苷酸鉀溶液組成，將反應液加入到石英比色皿里，之后把比色皿放到37℃的分光光度計平衡1 min后，加入100 μL黑芥子酶提取液，每隔3 min在227 nm處測吸光度，之后以時間為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖，計算酶的活性。另外，也有人采用高效液相色譜法來測定底物濃度。但由于植物可能存在多種形式的硫代葡萄糖苷，所以采用測定底物濃度來決定黑芥子酶活性的方法在測量時容易遺漏部分硫代葡萄糖苷，從而影響結果的準確性[48-49]。

4 黑芥子酶的應用

4.1 在人體抗癌方面的應用

雖然十字花科植物中含有的硫代葡萄糖苷及其代謝產物異硫氰酸酯，可以發(fā)揮體內抗氧化作用，有效降低多種癌癥的發(fā)病幾率[52]，但是我們日常食用的十字花科蔬菜都是加熱烹調的，會使得可以將硫代葡萄糖苷高效降解的黑芥子酶變性失活，且硫代葡萄糖苷也有一定的損失，所以日常通過食物攝入的硫代葡萄糖苷利用率極低[53-55]。為了保證每日這種抗癌物質的攝入，可以利用黑芥子酶在體外對硫代葡萄糖苷進行高效降解，得到異硫氰酸酯等抗癌成分，制備成純制劑，每日進行適當補充[56-57]。因此，對黑芥子酶的深入研究及利用，對于更好地進行人體抗癌防癌有很重要的意義。

4.2 油菜籽餅粕脫毒

油菜籽餅粕富含蛋白質和氨基酸，但硫代葡萄糖苷的存在限制了其在食品及飼料方面的應用，大量的油菜籽餅粕被用作肥料，造成了資源的浪費。硫代葡萄糖苷雖然本身無毒，但油菜籽餅粕及牲畜腸道微生物中都含有黑芥子酶，能夠將硫代葡萄糖苷降解生成抗營養(yǎng)物質，容易造成毒副作用[58]。因此，要想促進油菜籽餅粕的利用，必須對其進行脫毒，但如果采取強酸、高溫等條件，又會造成油菜籽餅粕中其他營養(yǎng)成分的損失。采用外源黑芥子酶，對油菜籽餅粕進行脫毒處理，條件溫和，既能降低硫代葡萄糖苷的含量，又能保護其他營養(yǎng)成分不被破壞[25]。丁艷等[26]比較分析了7種黑芥子酶降解油菜籽餅粕中的硫代葡萄糖苷，結果發(fā)現，油菜籽黑芥子酶是較好的降解油菜籽餅粕中硫苷的酶源，雖然油菜籽黑芥子酶活性略低于西蘭花黑芥子酶，但其降解產物中腈類、惡唑類等有害物質含量最低。

4.3 形成風味物質

黑芥子酶水解硫代葡萄糖苷產生的次級代謝產物是形成十字花科植物風味物質的主要成分。研究表明，黑芥子硫苷酸鉀存在于雪菜中，本身并沒有味道，它是雪菜的風味前體物質。在雪菜的腌制過程中，由于植物組織細胞被破壞，使得黑芥子酶與硫代葡萄糖苷接觸，水解產生了異硫氰酸酯，具有辛辣味和芳香味。是形成雪菜典型風味的主要物質[59]。另外，芥末和辣根的辣味也是在黑芥子酶作用下產生的異硫氰酸酯類所形成的；榨菜的香味成分比較復雜，但經鑒定其中由黑芥子酶與硫代葡萄糖苷作用下的水解產物所產生的睛類、異硫氰酸酯類等是使榨菜具有其特征香氣的主要成分[60-61]。

5 展望

近年來，國內外對黑芥子酶的研究日漸深入，不僅僅是黑芥子酶的結構及性質方面，還有黑芥子酶基因的研究及克隆方面，都取得了大量的研究成果。但在以下兩個方面的研究有待加強：

1）酶的活性位點不同導致不同來源黑芥子酶對底物的選擇性存在明顯差異。酶活性位點結構不同，造成了其在與硫代葡萄糖苷接觸反應時，水解的能力存在差異，酶的活力也就不同。因此十字花科植物中黑芥子酶的活性位點的空間結構有待進一步研究。

2）據目前的研究，黑芥子酶主要是從十字花科植物中來提取，工藝比較復雜，產量低，經濟效益不高，并不能滿足產品生產的需要，迫切需要研究開發(fā)新的方法去大量生產所需的酶，比如利用轉基因技術構建合適的工程菌等方法。

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The Research Progress of Myrosinase in Cruciferous Plants

SUN Yan-wei1，ZHANG Ze-sheng1，2，3，WANG Tian-xin1，2，*，LI Yu-meng1，QIN Cheng-guang1
（1.College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education，College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China；3.Tianjin Food Safety&Low Carbon Manufacturing Collaborative Innovation Center，Tianjin 300457，China）

Myrosinase exists in cruciferous plants extensively and it catalyses the hydrolysis of glucosinolates.The myrosinase-mediated breakdown products of glucosinolates have been considered as promising compounds for fighting cancer，which has attracted much attention.In this review，myrosinase was firstly overviewed，including its distribution，structure，activity and so on.Then an introduction was made on the methods of myrosinase extraction and myrosinase activity array，followed by outlooks of its application and future direction in the research.

cruciferous plant；myrosinase；glucosinolate；research progress

2016-08-30

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.048

天津科技大學青年教師創(chuàng)新基金（2015lG24）

孫艷偉（1992—），女（漢），碩士研究生，研究方向：天然產物活性成分。

*通信作者：王田心（1985—），男（漢），博士，講師，研究方向：天然產物活性成分。