唐 祥,趙立軍,羅 成,吳彩梅*,閆珊珊,劉光芒,林 燕,吳 德
(1.四川農業(yè)大學 動物營養(yǎng)研究所,四川省動物抗病營養(yǎng)重點實驗室,農業(yè)部動物抗病營養(yǎng)與飼料重點實驗室,四川 成都 611130;2.農業(yè)部畜禽產(chǎn)品質量安全風險評估實驗室(成都),四川 成都 610041;3.四川大學 化學工程學院,四川 成都 610065)
液相色譜-串聯(lián)質譜法測定育肥豬配合飼料中的阿奇霉素
唐 祥1,趙立軍2,3,羅 成1,吳彩梅1*,閆珊珊1,劉光芒1,林 燕1,吳 德1
(1.四川農業(yè)大學 動物營養(yǎng)研究所,四川省動物抗病營養(yǎng)重點實驗室,農業(yè)部動物抗病營養(yǎng)與飼料重點實驗室,四川 成都 611130;2.農業(yè)部畜禽產(chǎn)品質量安全風險評估實驗室(成都),四川 成都 610041;3.四川大學 化學工程學院,四川 成都 610065)
通過對提取溶劑、凈化方法及色譜-質譜條件的優(yōu)化,建立了配合飼料中阿奇霉素(AZM)的液相色譜-串聯(lián)質譜測定方法。樣品經(jīng)乙腈超聲波提取,MCX固相萃取柱凈化,BDS Hypersil C18(2.4 μm,100 mm×2.1 mm)色譜柱分離,以甲醇-0.05 mol/L乙酸銨水溶液為流動相梯度洗脫,正離子模式電離,多反應監(jiān)測模式檢測,同位素內標法定量。在優(yōu)化條件下,AZM在1~250 μg/L范圍內線性關系良好,相關系數(shù)(r2)為0.999 1,檢出限(S/N≥3)為2.8 μg/kg,定量下限(S/N≥10)為8.4 μg/kg;在0.5,1,5,10 mg/kg加標水平下,回收率為87.0%~106.6%,批內相對標準偏差為0.58%~5.4%,批間相對標準偏差為3.1%~5.4%。該方法準確、靈敏,選擇性強,基質干擾小,可用于配合飼料中AZM的測定。
液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS);阿奇霉素;育肥豬;配合飼料
阿奇霉素(Azithromycin,AZM)是結構類似于紅霉素的15元環(huán)大環(huán)內酯(Macrolide,MAL)抗生素[1],廣泛用于人上下呼吸道、泌尿道、皮膚及軟組織感染和性傳播疾病的預防和治療[2-3]。地方獸藥標準曾收錄AZM用于獸醫(yī)臨床治療,但人用抗菌藥物用于食品動物,會產(chǎn)生耐藥性問題,從而影響動物疫病控制、食品安全和人類健康。2005年8月農業(yè)部發(fā)布第560號公告,AZM不符合獸藥安全有效審批原則,取消收錄AZM等MALs為獸藥的地方標準,將AZM列為禁用獸藥[4]。雖然國家明令禁止,但養(yǎng)殖環(huán)節(jié)帶來的經(jīng)濟效益受損,養(yǎng)殖戶將抗生素添加于飼料或針劑注射等方式給藥,導致人用抗生素仍被濫用于畜禽,已成為威脅畜禽產(chǎn)品安全的新隱患。因此,建立飼料中AZM準確、靈敏的檢測方法是加快實現(xiàn)無抗養(yǎng)殖,保證食品安全的重要任務。
目前AZM的檢測研究主要集中在AZM制藥原料、人和動物的血液等基質,檢測技術主要有微生物法[5-6]、電化學法[7-8]、液相色譜法(LC)、液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)等。其中,微生物法操作繁瑣、費時、精密度差、檢出限高,無法滿足殘留分析要求。美國藥典使用安培電化學檢測器測定AZM含量,其要求流動相pH值達到11和使用價格昂貴的氧化鋁色譜柱[9]。AZM的紫外吸收弱,采用配備紫外檢測器的LC法[10-12]進行測定時,會導致峰形不對稱和柱效降低。配備熒光檢測器的檢測方法[13-14]可提高檢測靈敏度,但樣品需衍生,其處理過程費時,結果易受衍生條件影響。而高效液相色譜-串聯(lián)質譜(HPLC-MS/MS)法無需衍生、選擇性好、靈敏度高、應用范圍廣。
由于飼料中AZM的檢測方法未見研究報道,國內及國際有關AZM的檢測標準亦未見報道,因此本研究通過對提取溶劑、凈化方法及色譜-質譜條件的優(yōu)化首次建立了配合飼料中阿奇霉素的HPLC-MS/MS法。通過對方法的選擇性、精密度和準確度、檢出限和定量下限、基質效應和提取效率的測試,對方法的可行性進行了分析。并將該方法用于育肥豬配合飼料樣品中AZM的測定,相關數(shù)據(jù)為配合飼料中AZM的風險評估以及檢測標準的制定奠定了基礎。
1.1 儀器與試劑
液相色譜-串聯(lián)質譜儀(Agilent 1200-6430 Triple Quad,美國Agilent公司);渦旋振蕩混合器(德國IKA公司);低溫離心機(日本Hitachi公司);旋轉蒸發(fā)儀(美國Organomation公司);固相萃取裝置(美國Agilent公司);超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)。
阿奇霉素標準對照品(純度≥97.0%,德國Dr.Ehrenstorfer公司);阿奇霉素同位素內標(Azithromycin-d3,純度≥98.0%,加拿大Toronto Research Chemicals公司);Oasis MCX固相萃取柱、Oasis HLB固相萃取柱、C18固相萃取柱(3 mL,60 mg;美國Waters公司);甲醇、乙腈、叔丁基甲醚、乙酸銨(色譜純,美國Sigma公司);乙酸乙酯、乙醚(分析純,中國川東化工有限公司);氨水(分析純,中國西隴化工有限公司)。實驗用水為純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)制備的超純水18.2 MΩ·cm。
1.2 標準溶液配制
精密稱取適量的AZM和AZM-d3對照品,用甲醇溶解稀釋,分別制成1 mg/mL和0.1 mg/mL的標準儲備液,于-20 ℃條件下保存。使用時,用初始流動相逐級稀釋至所需濃度。
1.3 HPLC-MS/MS條件
1.3.1 色譜條件 色譜柱:BDS Hypersil C18(2.4 μm,100 mm×2.1 mm);流動相為甲醇(A)和50 mmol/L乙酸銨水溶液(B);流速:0.2 mL/min;進樣體積:5 μL;柱溫:30 ℃;梯度洗脫程序:0~3 min,90% A;3~3.5 min,線性變化至100% A;3.5~5 min,100% A;5~5.5 min,線性變回至90% A;5.5~8.5 min,90% A;分析總時間為12 min。
1.3.2 質譜條件 采用電噴霧離子源(ESI),正離子模式,多反應監(jiān)測模式(MRM)檢測。離子源溫度:300 ℃;脫溶劑溫度:350 ℃;氮氣作為去溶劑氣體,流速:10 L/min;霧化器壓力:40 psi;輔助氣壓力:15 psi;毛細管電壓:4 000 kV;錐孔電壓:4 000 kV;碰撞氣體為氬氣。定性、定量離子對及碰撞能量等參數(shù)見表1。
表1 AZM和AZM-d3的質譜參數(shù)Table 1 MS parameters for AZM and AZM-d3
1.4 樣品前處理
稱取1 g(精確至0.000 1 g)飼料樣品,置于50 mL帶蓋離心管中,加入1 mL水浸潤,加入1 μg/mL內標25 μL,加入10 mL乙腈超聲提取30 min,8 000 r/min離心10 min,收集上清液于50 mL聚丙烯離心管,沉淀物加入10 mL乙腈重復提取1次,合并上清液,45 ℃水浴氮氣濃縮至3 mL,待凈化。
將MCX柱置于固相萃取裝置上,分別用3 mL甲醇、3 mL水活化,上樣量2 mL,依次用3 mL水和3 mL甲醇淋洗,負壓抽干,3 mL 15%的氨化甲醇洗脫,氮氣吹干,2 mL 90%的甲醇水溶液溶解殘渣,0.22 μm濾膜過濾,上機測定。
2.1 定性、定量離子對的確定
正離子模式條件下,對AZM和AZM-d3進行母離子掃描和子離子掃描,由所得質譜圖確定AZM和AZM-d3的MRM通道分別為m/z749.6>591.3,m/z749.6>158.0和m/z752.5>594.2,AZM和AZM-d3的MRM通道與Filist等[15]報道一致。因此AZM的定性離子對為m/z749.6>591.3和m/z749.6>158.0,由于m/z749.6>591.3的相對豐度高,被確定為AZM的定量離子對。根據(jù)歐盟2002/EC/657[16]指令要求,該方法的定性需要滿足以下條件:①全掃描時,所選擇的離子的相對豐度超過濃度相當?shù)臉藴嗜芤弘x子相對豐度的10%;②特征離子色譜峰的信噪比(S/N)應在 3∶1 以上;③針對HPLC-MS/MS的檢測方法,1個母離子為1.0個識別點,2個對應的子離子為2×1.5個識別點,方法應滿足4個識別點的要求。在同時滿足上述3個條件時,可判斷樣品中存在AZM。而定量分析是采用內標法,以標準品MRM色譜峰面積/同位素內標MRM色譜峰面積對標準品AZM濃度/同位素內標濃度作標準曲線進行。本實驗對AZM添加量為1 mg/kg的飼料樣品測定,發(fā)現(xiàn)AZM的出峰時間與標準品一致,特征離子的豐度與標準品基本一致,因此本方法可用于配合飼料中AZM的確證檢測。
2.2 流動相的選擇
分別選用乙腈-0.2%甲酸水溶液、乙腈-50 mmol/L乙酸銨水溶液、甲醇-0.2%甲酸水溶液和甲醇-50 mmol/L乙酸銨水溶液作流動相,其他色譜-質譜條件同“1.3”所述,對質量濃度為50 ng/mL的混合標準品進行測定,以標準品的響應值和分離效果為評判依據(jù),確定最佳流動相組成。結果表明,采用甲醇-50 mmol/L乙酸銨水溶液作流動相時的信號響應值最高,分離效果最好。實驗結果與文獻[15,17-18]一致。由于流動相組成會顯著影響分析物的離子化效率,添加一定量的乙酸銨和甲酸有利于化合物的離子化和峰形的改善,本實驗以甲醇-50 mmol/L乙酸銨水溶液作為流動相時,能提高信號的響應值,提高方法的靈敏度,且色譜峰無拖尾,因此本方法選其作為流動相。
2.3 樣品提取試劑的確定
AZM屬于親脂類化合物,極性小,不溶于水,易溶于甲醇、乙酸乙酯、乙腈、乙醚等有機溶劑。實驗分別選擇甲醇、乙腈、叔丁基甲醚、乙酸乙酯作為提取溶劑,以響應值為評判依據(jù),確定最佳的提取試劑。按照“1.4”前處理方法和“1.3”色譜-質譜條件,對添加濃度為1 mg/kg的質控樣品進行測定。結果表明,使用乙腈提取AZM的回收率最高,且提取液澄清,濃縮時間最短,滿足提取和后續(xù)凈化的要求,而與Filist等[15]采用叔丁基甲醚-正己烷(50∶50)為提取溶劑的處理方法相比,本方法更環(huán)保和安全。
表2 不同SPE柱的保留率與回收率Table 2 Retention rates and recoveries of different SPE column
2.4 樣品凈化方法的優(yōu)化
2.4.1 固相萃取柱的選擇 SPE能有效去除樣品中的雜質,根據(jù) SPE 柱填料的種類不同,可分為正相柱、反相柱、離子交換柱、吸附柱和混合柱等。實驗以MCX,C18,HLB 3種SPE柱分別凈化1 mg/kg的質控樣品,考察其保留和絕對回收率,結果見表2。結果表明HLB柱未能全部富集樣品中AZM,出現(xiàn)穿漏現(xiàn)象,絕對回收率最低,MCX和C18柱的絕對回收率差別小,均能較好富集樣品中的AZM,但是吳獻花、張紅等[19-20]使用C18柱凈化尿液、血漿中的AZM時,發(fā)現(xiàn)柱中液體流干會嚴重影響回收率??紤]到AZM屬于弱堿性化合物[21],MCX萃取柱具有反相陽離子交換雙重保留性能,對弱堿性化合物具有良好的保留能力,絕對回收率最高,因此,本實驗最終選擇MCX萃取柱為固相萃取柱。
2.4.2 洗脫溶劑中氨水比例和洗脫體積的選擇 選擇氨化甲醇為洗脫溶劑,以AZM絕對響應值為評價依據(jù),確定MCX柱氨化甲醇最佳洗脫比例和洗脫液的洗脫體積。結果表明,當甲醇中氨水濃度為15%時,AZM的響應值最高。采用MCX凈化,洗脫液pH值應大于AZM的pKa 2個值,AZM的pKa為8.795,本實驗使用的10%,15%,20%,25%氨化甲醇的pH值分別為9.86,11.93,13.75和14.00,隨著洗脫液pH值的升高,AZM的響應值逐漸降低,可能是由于AZM在高pH值的溶液中發(fā)生了降解。當洗脫液體積從3 mL增至6 mL時,AZM的響應值差異不顯著(P>0.05),說明3 mL氨化甲醇溶液可將AZM洗脫完全。因此本實驗選擇3 mL的15%氨化甲醇作為洗脫液。
2.5 方法學驗證
2.5.1 方法的選擇性 采用已建立的HPLC/MS/MS法分別測定空白育肥豬配合飼料樣品、空白樣品加入AZM標準品和AZM-d3的質控樣品,平行測定6次,進行方法選擇性評估,結果如圖1。結果表明,AZM和AZM-d3保留時間處未見干擾色譜峰。因此方法能準確鑒別配合飼料中AZM和其他雜質,無潛在干擾物質,選擇性強。
2.5.2 方法的遺留影響 為考察高濃度樣品先于低濃度樣品上機對低濃度樣品MRM的影響,本實驗先分析高濃度(225 μg/L)的質控樣品后再對空白飼料樣品進行分析,重復6次。結果表明,先分析高濃度樣品再分析低濃度樣品時,低濃度樣品未發(fā)現(xiàn)高濃度樣品的AZM的干擾峰,因此,本方法無高濃度樣品遺留分析物的影響。
2.5.3 方法的基質效應 分別采用空白飼料的基質液和流動相制備0.5,1,5,10 mg/kg質控樣品(n=6),測定的AZM峰面積分別標識為Am和Ar,按照ME=Am/Ar×100%計算AZM的基質效應。分別采用空白飼料的基質液和流動相配制25 ng/mL 的AZM-d3(n=6),計算AZM-d3的基質效應。
AZM和AZM-d3的基質效應計算值分別為(99.1± 1.4)%和(102.7± 1.2)%,RSD分別為1.4%和1.2%。結果表明,AZM和AZM-d3的基質效應和RSD值滿足歐盟 2002/657/EC 規(guī)定的要求,方法的基質干擾小。
2.5.4 方法的線性、檢出限及定量下限 為使標準溶液與樣品溶液具有相似的離子化環(huán)境和消除基質效應的影響,本實驗采用基質匹配標準曲線法進行定量,以空白樣品提取液作為標準溶液的稀釋液,配制標準溶液,并繪制標準曲線進行定量分析。在樣品提取液中分別添加1,10,50,125,150,200,250 μg/L的AZM標準工作液,AZM-d3濃度為25 μg/L,以標準品的MRM色譜峰面積/內標MRM色譜峰面積(y)對標準品質量濃度/內標質量濃度(x)繪制標準曲線(內標法)。得到AZM的線性范圍為1~250 μg/L,線性方程為y=1.833x-0.144,相關系數(shù)(r2)為0.999 1。
制備0.5 mg/kg的質控樣品,按照“1.4”過程處理,稀釋上機液,上機測定,以分析樣品的信噪比(S/N)≥3和信噪比(S/N)≥10分別確定本方法的檢出限(LOD)和定量下限(LOQ)。結果表明,育肥豬配合飼料中AZM的LOD為2.8 μg/kg,LOQ為8.4 μg/kg。譚亞亞[22]、賈有志等[23]采用HPLC-MS/MS法分別測定人血漿、雞肉中AZM,其LOD分別為2.37 ng/mL和0.3 μg/kg。本文建立的飼料中AZM測定方法的檢出限與人血漿的HPLC-MS/MS法相當,且前者的基質雜質繁多,測定難度大于血液樣品。
2.5.5 方法的回收率與精密度 本實驗以空白飼料為樣品,設計了0.5,1,5,10 mg/kg 4個添加水平,每個添加水平重復測定6 個樣品,分別處理兩批,測定AZM的回收率和相對標準偏差,結果見表3。結果表明,育肥豬配合飼料樣品的加標回收率為90.7%~106.6%,批內和批間精密度分別為0.58%~5.4%和3.1%~5.4%,其回收率和精密度滿足歐盟2002/657/EC規(guī)定的回收率應為85%~115%、相對標準偏差(RSD)應小于15%的要求。因此,本方法能準確測定飼料中的AZM。
表3 飼料中AZM批內、批間的回收率及相對標準偏差Table 3 Recovery and RSD of calibration samples for azithromycin in formula feed for fattening pig
2.6 方法的應用
應用本文建立的方法,分析了四川省育肥豬配合飼料中的AZM。按照NY/T1897-2010標準采集四川省1個省會城市,14個地級市,地域涵蓋了四川省東、西、南、北部共54個育肥豬養(yǎng)殖場的飼料樣品,其中成都市6份,內江市9份,南充市1份,綿陽市10份,廣元市1份,達州市3份,樂山市5份,資陽市2份,德陽市2份,宜賓市2份,眉山市9份,瀘州市3份,廣安市1份,每個養(yǎng)殖場取商品飼料(槽料)樣品1份(約500g)。分析結果表明54份配合飼料樣品中均未檢出AZM。其原因可能為采集到的飼料中未添加AZM,但不排除養(yǎng)殖戶通過其他方式違規(guī)使用AZM,例如肌肉注射[24]和飲水或飼喂時小范圍拌料。因此,可通過增加樣本數(shù)及覆蓋面,擴大采樣途徑,從而更全面地評價飼料中AZM的安全性。
本文通過對提取溶劑、凈化方法以及色譜-質譜檢測條件的優(yōu)化,建立了飼料中AZM的HPLC-MS/MS檢測方法。該方法靈敏度高,選擇性強、基質干擾小,使用同位素內標定量,進一步提高了方法的準確性,可用于配合飼料中AZM的測定。
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Determination of Azithromycin in Formula Feed for Fattening Pigs by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
TANG Xiang1,ZHAO Li-jun2,3,LUO Cheng1,WU Cai-mei1*,YAN Shan-shan1,LIU Guang-mang1,LIN Yan1,WU De1
( 1.Key Laboratory for Animal Disease-Resistance Nutrition and Feedstuffs of China Ministry of Agriculture,Key Laboratory for Animal Disease-Resistance Nutrition of Sichuan Province,Institute of Animal Nutrition,Sichuan Agricultural University,Chengdu 611130,China;2.Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Livestock and Poultry Products (Chengdu) 610041,China;3.College of Chemical Engineering,Sichuan University,Chengdu 610065,China)
A method was developed for the determination of azithromycin in formula feed for fattening pigs by liquid chromatography-tandem mass spectrometry(HPLC-MS/MS).The sample was extracted with acetonitrile under ultrasonic assistance.Oasis MCX solid-phase extraction column was used for purification,and the chromatographic separation was performed on a Hypersil BDS C18column(2.4 μm,100 mm×2.1 mm) with gradient elution using 0.05 mol/L ammonium acetate-methanol(1∶9) as mobile phase.The detection of azithromycin was performed with positive ion under multiple reaction monitoring(MRM) mode.The internal standard isotope dilution method was used for quantification.A good linearity(r2=0.999 1) was obtained for azithromycin in the range of 1-250 μg/L.The limit of detection(LOD,S/N≥3) and the limit of quantitation(LOQ,S/N≥10) of azithromycin in the formula feed were 2.8 μg/kg and 8.4 μg/kg,respectively.Average recoveries ranged from 87.0% to 106.6% for the formula feed at spike levels of 0.5,1,5,10 mg/kg.The intra-RSDs for azithromycin were 0.58%-5.4% and the inter-RSDs were 3.1%-5.4%.The method is accurate and sensitive,and the matrix interference is small.The method could be applied in the determination of azithromycin in formula feed.
liquid chromatography tandem mass spectrometry(LC-MS/MS);azithromycin;fattening pig;formula feed
10.3969/j.issn.1004-4957.2017.03.011
2016-09-20;
2016-10-19
四川科創(chuàng)飼料產(chǎn)業(yè)技術研究院(2013NZ0054);四川飼料產(chǎn)業(yè)分析檢測公共服務平臺(009Z0811)資助項目
O657.63;O629.5
A
1004-4957(2017)03-0361-06
*通訊作者:吳彩梅,碩士,高級實驗師,研究方向:飼料安全檢測技術及飼料資源開發(fā)利用,Tel:028-86291592,E-mail:zhuomuniao278@163.com