張海超，馬育松，李 穎，艾連峰*，徐牛生，陳瑞春，郭春海

(1.河北出入境檢驗檢疫局，河北 石家莊 050051；2.賽默飛世爾科技(中國)有限公司，上海 201206)

在線凈化液相色譜-高分辨質(zhì)譜法快速測定動物源性食品中均三嗪類藥物及其代謝產(chǎn)物的殘留量

張海超1，馬育松1，李 穎1，艾連峰1*，徐牛生2，陳瑞春1，郭春海1

(1.河北出入境檢驗檢疫局，河北 石家莊 050051；2.賽默飛世爾科技(中國)有限公司，上海 201206)

基于在線凈化液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)建立了快速測定動物源食品中地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利砜和妥曲珠利亞砜殘留的分析方法。樣品采用乙腈提取，經(jīng)Cyclone在線凈化柱凈化后，將富集的目標(biāo)物洗脫轉(zhuǎn)至C18分析柱，經(jīng)色譜分離后，采用四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜以Full Scan/ddMS2模式進行檢測。4種化合物在0.5～50 ng/mL范圍內(nèi)呈良好線性，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 4，方法的定量下限(LOQ)為 2 μg/kg。待測物在4種基質(zhì)中的加標(biāo)回收率為80.2%～110.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%～9.7%。該方法簡化了前處理過程，消除了基質(zhì)干擾。利用精確質(zhì)量數(shù)、保留時間、同位素峰比、二級碎片多個定性信息能夠?qū)崿F(xiàn)快速確證測定。

在線凈化；靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜；地克珠利；妥曲珠利；妥曲珠利亞砜；妥曲珠利砜；動物源食品

近年來廣譜、高效、低毒性的均三嗪類抗球蟲藥在畜牧業(yè)生產(chǎn)中得到了廣泛使用[1-2]。目前使用的均三嗪類藥物主要有地克珠利和妥曲珠利，二者均可有效殺滅包括球蟲在內(nèi)的多種原蟲，屬高效抗球蟲藥物。地克珠利作用時間短，需要長期用藥才能達到防治目的，導(dǎo)致該藥極易在組織中蓄積。妥曲珠利在動物體內(nèi)代謝為妥曲珠利砜和妥曲珠利亞砜，毒理學(xué)試驗表明妥曲珠利可能有致畸毒性，對人體的健康產(chǎn)生威脅。因此我國對這兩種均三嗪類藥物制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)[3]，但是這4類化合物在日常監(jiān)測中超標(biāo)現(xiàn)象依然時有發(fā)生，不斷威脅著消費者的健康。

目前地克珠利和妥曲珠利的檢測方法中應(yīng)用較多的是液相色譜法[4-6]和液質(zhì)聯(lián)用法[7-11]等。液相色譜法測定這4種化合物在色譜分離上難度很大，而且無法很好地解決雜質(zhì)干擾的問題；采用液質(zhì)聯(lián)用法測定雖可以有效避免色譜分離的問題，但該類化合物的特征碎片離子較少，妥曲珠利和妥曲珠利砜甚至無特征碎片離子而不得不采用母離子定性定量，因此極易受到基質(zhì)干擾，導(dǎo)致結(jié)果判斷不準(zhǔn)確。而具有高靈敏度、高選擇性的高分辨質(zhì)譜技術(shù)在很大程度上彌補了此缺陷。木合他拜爾等[12]利用靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜技術(shù)(Q-Exactive)測定了雞肉中6種抗球蟲藥物，地克珠利和妥曲珠利的定量下限可達5 μg/kg，取得了較好的實驗效果，但該方法采用的QuEChERS凈化手段面對動物源基質(zhì)依然存在著凈化不夠完全的現(xiàn)象。TurboFlow在線凈化技術(shù)與傳統(tǒng)凈化方式相比，具有溶劑消耗少，樣品分析效率高，在線凈化柱可重復(fù)使用等優(yōu)點，在殘留分析領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用[13-17]。本文采用TurboFlow在線凈化液相色譜與四極桿軌道阱高分辨質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)分析了動物源食品中地克珠利和妥曲珠利及其代謝產(chǎn)物的殘留量，方法簡單、快速、準(zhǔn)確。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TurboFlow在線凈化液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀Q-Exactive(美國ThermoFisher公司)，由CTC多功能自動進樣器(配有200 μL定量環(huán))、兩個耐壓1 250 bar的四元梯度液相泵、六通閥切換裝置和Q-Exactive四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜儀組成。液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀8050(日本島津公司)，Sigma 3K-15型離心機(美國Sigma公司)，PT2100型均質(zhì)器(瑞士Kinematica公司)，渦旋混合器(美國Scientific Industries)，Milli-Q純化系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利亞砜和妥曲珠利砜標(biāo)準(zhǔn)品均購于德國Dr.Ehrenstorfer公司，純度大于98%；乙腈、甲醇、丙酮、異丙醇、甲酸為色譜純，氯化鈉為分析純，實驗用水為Milli-Q高純水。

1.2 實驗部分

1.2.1 樣品制備 準(zhǔn)確稱取粉碎均勻樣品5.0 g(精確至0.01 g)于50 mL塑料離心管中，加入2 g氯化鈉和20 mL乙腈，于均質(zhì)器上均質(zhì)1 min，以5 000 r/min離心5 min。取1 mL左右的上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后進樣測定。

1.2.2 在線凈化色譜條件 在線凈化程序由凈化(TFC)和分離(HPLC)兩部分組成。凈化柱為Cyclone聚合物柱(0.5 mm×50 mm，60 μm 粒徑，60 ?孔徑)；上樣泵的流動相A為純水溶液、B為乙腈、C為丙酮+乙腈+異丙醇(1∶1∶1)，進樣量為50 μL；HPLC的分析柱為資生堂CAPCELLPAK(150 mm×2.1 mm，2.7 μm)；流動相:A為0.1%的甲酸水溶液，B為乙腈，其在線凈化梯度洗脫程序見表1。TFC在程序中每步的變化采用瞬變模式，HPLC每步的變化除最后一步采用瞬變模式外其他步驟間改變采用漸變模式。整個運行時間為10 min。

表1 在線凈化梯度洗脫程Table 1 Gradient elution procedure of TurboFlow on-line cleanup

(續(xù)表1)

StepNo.(步驟)Starttime/min(起始時間)Stoptime/min(持續(xù)時間)Loadingpump(上樣泵)Elutionpump(洗脫泵)Function(目的)Flow/(流速,mL·min-1)A(%)B(%)C(%)Function(目的)Flow/(流速,mL·min-1)A(%)B(%)44.003.0Cleaning(淋洗)2.00100Elution(洗脫)0.4455557.001.5Loopfilling(充滿定量環(huán))2.003070Elution(洗脫)0.4109068.501.5Conditioning(條件化)2.00100Conditioning(條件化)0.48020

1.2.3 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)溫度：300 ℃；毛細管電壓:3 200 V；負(fù)離子掃描模式；掃描范圍:m/z350～550；化合物提取精確質(zhì)量數(shù)及二級特征碎片離子見表2；一級質(zhì)譜全掃描分辨率:R=70 000；C-trap最大容量(AGC target):5×105；C-trap最大注入時間:100 ms；數(shù)據(jù)依賴二級子離子全掃描(ddMS2)分辨率:R=17 500；歸一化碰撞能量：35 eV±50%；C-trap最大容量(AGC target):5×104；C-trap最大注入時間:50 ms；動態(tài)排除:5 s。

表2 4種抗球蟲藥的名稱、分子式及部分質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Names，formulaes and some MS parameters of four anticoccidials

* there is no fragment ion

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

圖1 地克珠利(a)、妥曲珠利(b)、妥曲珠利砜(c)及妥曲珠利亞砜(d)優(yōu)化后的在線凈化條件色譜圖(不接分析柱)Fig.1 Chromatograms of diclazuril(a)，toltrazuril(b)，toltrazurilsulfone(c)and toltrazurilsulfoxide(d)under optimized online cleanup conditions(no connected to the analytical column)

考察了乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯和丙酮4種提取劑的提取效率。結(jié)果顯示，乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯為提取劑時回收率均較高，而采用丙酮為提取劑時回收率較低?？紤]到二氯甲烷比重大，提取離心后上清液中仍有樣品殘渣懸浮，轉(zhuǎn)移較為費力且毒性較大；乙酸乙酯在提取目標(biāo)物的同時會提取出較多的脂肪和蛋白質(zhì)，給后續(xù)凈化帶來一定困難。而乙腈則能更有效地沉淀蛋白，減少雜質(zhì)干擾，同時無需轉(zhuǎn)換定容液可直接進儀器分析，因此實驗選擇乙腈作為最佳提取溶劑。

2.2 在線凈化條件的優(yōu)化

TurboFlow在線凈化條件分為3個部分：上樣、轉(zhuǎn)移、淋洗。實驗采用不接分析柱，分流進質(zhì)譜以反相洗脫模式優(yōu)化每一步實驗過程。首先選定純水溶液作為上樣溶液，乙腈作為洗脫溶劑，比較了C18，Cyclone和Cyclone-P作為在線凈化柱對目標(biāo)化合物的保留及洗脫情況，發(fā)現(xiàn)Cyclone對4種化合物均能有效保留且易于洗脫。在此條件下，對不同比例的凈化流動相A相和B相作洗脫溶劑進行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)洗脫劑中B相的比例大于70%時，分析物均能被完全洗脫。其優(yōu)化后的在線凈化過程所得的色譜圖如圖1所示，0～1 min為上樣過程，1～2 min為洗脫轉(zhuǎn)移部分，2 min以后開始進行淋洗和條件化。淋洗過程采用強淋洗溶劑淋洗掉TFC柱上的強保留雜質(zhì)，然后用洗脫溶劑充滿洗脫環(huán)并以TFC流動相A初始化TFC柱，以備下一個樣品的分析。本實驗選用丙酮+乙腈+異丙醇(1∶1∶1)作為強淋洗溶劑，建立了表1的梯度條件。

2.3 分離條件的建立

分析柱是將由TFC柱洗脫下的分析物進行分離。TFC的洗脫液與HPLC流動相的初始比例對分析物及分離影響很大。本實驗分別選擇純水、0.1%甲酸溶液、0.5 mmol/L乙酸銨-0.02%乙酸水溶液作為水相(A)，甲醇和乙腈分別作為有機相(B)，進行流動相的選擇實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以0.1%甲酸溶液為水相，乙腈為有機相，采用時間梯度洗脫條件時，4種化合物的峰形較好。

2.4 質(zhì)譜條件的選擇及定性確證方法的建立

實驗采用正負(fù)同時掃描的模式對4種化合物進行檢測，發(fā)現(xiàn)4種化合物只在ESI-模式下有響應(yīng)，且均出現(xiàn)[M-H]-峰。故采用負(fù)模式下全掃描和數(shù)據(jù)依賴掃描模式(Full Scan/ddMS2)進行化合物的測定。通過全掃描的數(shù)據(jù)可獲得精確質(zhì)量數(shù)、保留時間和同位素峰分布信息。采用35eV±50%的碰撞能量可得到二級質(zhì)譜信息，選用豐度較高的碎片離子作為特征離子。將上述色譜和質(zhì)譜信息在Q-Exactive自帶的Exactfinder軟件上建立了定性確證方法。該方法可通過保留時間、精確質(zhì)量數(shù)、同位素分布、二級碎片等多個信息來實現(xiàn)4種分析物尤其是妥曲珠利和妥曲珠利砜這類無特征子離子化合物的準(zhǔn)確定性分析。與低分辨的三重四極桿質(zhì)譜相比，高分辨質(zhì)譜方法可得到更多的特征質(zhì)譜信息，定性結(jié)果更為準(zhǔn)確。在不同基質(zhì)樣品的應(yīng)用表明，該方法的特異性強，無干擾組分出現(xiàn)，可作為確證方法。

2.5 基質(zhì)影響的消除與方法的線性

Q-Exactive因其高分辨率可有效避免基質(zhì)對定性定量的干擾，尤其對于無特征碎片以母離子→母離子定性定量的化合物優(yōu)越性更為明顯。本文采用LC-MS/MS的MRM模式及Q-Exactive的Full Scan/ddMS2分別進行測定，對比后發(fā)現(xiàn)，相比于低分辨的三重四極桿，Q-Exactive利用精確的質(zhì)量數(shù)定性定量后顯著提高了化合物的選擇性，避免了基質(zhì)造成的干擾，保證了分析測試的靈敏度。如圖2所示，在線凈化高分辨質(zhì)譜得到的雞肉樣品基質(zhì)中妥曲珠利(2 ng/mL)的一級提取離子色譜圖(b1)基線明顯優(yōu)于由三重四極桿質(zhì)譜得到的多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜圖的基線(a1)；從純標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)譜圖對比，在線凈化高分辨質(zhì)譜圖的信噪比(b2)也好于三重四極桿質(zhì)譜圖(a2)，且在線凈化高分辨質(zhì)譜得到的樣品基質(zhì)質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)譜圖基本相當(dāng)，說明基質(zhì)影響較弱，凈化效果滿足測試要求。

圖2 妥曲珠利的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖(MRM)和在線凈化高分辨提取離子色譜圖Fig.2 MRM chromatograms and online clean up HRMS chromatograms of toltrazuril a1：MRM chromatogram of chicken matrix solution；a2：MRM chromatogram of standard solution；b1：online cleanup HRMS chromatogram of chicken matrix solution；b2：online cleanup HRMS chromatogram of standard solution

根據(jù)分析物的靈敏度，選用雞肉、牛肉、雞蛋和牛奶的空白基質(zhì)溶液配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液及乙腈配制純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)溶液并制作校準(zhǔn)曲線，進行斜率比較。結(jié)果顯示，不同基質(zhì)的斜率比均在0.8～1.2之間，說明基質(zhì)效應(yīng)不明顯，可以選用乙腈配制標(biāo)準(zhǔn)工作液對化合物進行校正。用乙腈配制成質(zhì)量濃度分別為0.5，2，5，10，20，50 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，依次進樣測定。結(jié)果顯示，4種待測物在0.5～50 ng/mL范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 4～0.999 5。

2.6 方法的回收率、精密度與定量下限

選取雞肉、牛肉、雞蛋和牛奶空白基質(zhì)樣品，分別在2，5，20 μg/kg 3個濃度水平下做加標(biāo)回收實驗，每個水平平行6次，其回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。由表3可知，方法的回收率在80.2%～110.5%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.8%～9.7%。以能準(zhǔn)確測得空白基質(zhì)最小添加量的方式，確定方法的定量下限(LOQ)為2 μg/kg。

表3 方法的加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of the method(n=6)

圖3 地克珠利陽性樣品的確證圖Fig.3 Confirms of diclazuril in a positive sample A:mass spectrum and isotope ratio of diclazuril[M-H]-m/z 404.971 83 with a mass tolerance of 5 ppm by full scan mode，# theoretical value of isotope peak，*measured values of isotope peak，1:405.975 39,2:406.969 29,3:407.972 17,4:408.966 25，5:409.969 35，6:410.237 56;fragment mass spectrum of [M-H]-m/z 404.97 with 35% NCE by ddMS2 mode of standard solution(B1) and sample(B2)

2.7 實際樣品的測定

采用本方法對12份送檢的樣品進行檢測，樣品經(jīng)過前處理、儀器測定后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入定性確證方法軟件進行分析。其中1份雞肉樣品的地克珠利在篩查中顯示為陽性，該化合物在5 ppm質(zhì)量數(shù)偏差范圍內(nèi)獲得的離子色譜圖的保留時間與定性確證方法中該化合物保留時間一致，而后對其進一步進行同位素峰形匹配和精確碎片離子分析。圖3A為該化合物所獲得的母離子精確質(zhì)量數(shù)(404.971 83)及其同位素峰(405.975 39，406.969 29，407.972 17，408.966 25和409.969 35)，將其與地克珠利理論同位素峰的分布進行比較，完全匹配。而圖3B則為該化合物在質(zhì)量數(shù)為404.97下所觸發(fā)的ddMS2掃描，在35%的高能量碰撞下獲得該化合物的二級質(zhì)譜圖，從圖中可看出具有該化合物的特征二級質(zhì)譜碎片離子(333.97和404.97)，且離子比符合相關(guān)規(guī)定要求，因此定性判斷為陽性。對于該樣品采用地克珠利標(biāo)準(zhǔn)溶液重新定量校正，定量結(jié)果為22 μg/kg。

3 結(jié) 論

本文采用TurboFlow在線凈化技術(shù)與高分辨率質(zhì)譜聯(lián)用手段建立了動物源性食品中地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利亞砜和妥曲珠利砜的殘留檢測方法。方法采用在線凈化技術(shù)簡化了前處理過程，提取后即可進樣，操作簡單、快速。四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜可通過精確母離子分子量、保留時間、同位素分布以及二級特征碎片等信息定性分析，實現(xiàn)對化合物的有效確證。該方法大大提高了檢測效率，且選擇性和抗干擾能力強，避免了假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，可用于動物源性食品中地克珠利、妥曲珠利及其代謝產(chǎn)物的快速檢測。

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Rapid Determination of Diclazuril,Toltrazuril and Their Metabolite Residues in Foods of Animal Origin by On-line Cleanup Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry

ZHANG Hai-chao1，MA Yu-song1,LI Ying1，AI Lian-feng1*，XU Niu-sheng2，CHEN Rui-chun1，GUO Chun-hai1

(1.Hebei Entry and Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shijiazhuang 050051,China；2.Thermo Fisher Scientific (China),Shanghai 201206,China)

A new method was developed for the rapid determination of diclazuril，toltrazuril，toltrazurilsulfone and toltrazurilsulfoxide residues in foods of animal origin by on-line cleanup liquid chromatography-high resolution benchtop quadropole/obitrap mass spectrometry(HRMS) .The samples were extracted with acetonitrile，and purified on a Cyclone column.The analytes were eluted from the exaction column and put into a C18analytical column prior to chromatographic separation and detection in full scan/ddMS2mode.The calibration curves were linear in the range of 0.5-50 ng/mL with correlation coefficients more than 0.999 4.The limits of quantitation(LOQ) were 2 μg/kg.Average recoveries of the analytes in four matrices ranged from 80.2% to 110.5%，with relative standard deviations of 2.8%-9.7%.With simple pretreatment，low matrix effects,this method could be used for the rapid confirmation with accurate mass of quasi-molecular ion，retention time，isotope ratio and qualitative fragments.

on-line cleanup;obitrap high-resolution mass spectrometry;diclazuril;toltrazuril;toltrazurilsulfone;toltrazuril sulfoxide；foods of animal origin

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.03.006

2016-08-25；

2016-11-20

國家質(zhì)檢總局科技計劃項目(2013IK154)

O657.63;TQ460.72

A

1004-4957(2017)03-0331-06

*通訊作者：艾連峰，博士，高級工程師，研究方向：食品安全分析，Tel：0311-85980742，E-mail：ai_lianfeng@126.com