郭萌萌，李兆新*，王 智，潘明軒,3，吳海燕，邢麗紅，孫曉杰

(1.中國水產科學研究院 黃海水產研究所 農業(yè)部水產品質量安全檢測與評價重點實驗室，山東 青島 266071；2.青島市產品質量監(jiān)督檢驗研究院 青島市產品質量檢驗技術研究所，山東 青島 266061；3.上海海洋大學，上海 201306)

通過式固相萃取凈化/液相色譜-串聯(lián)質譜法快速檢測水產品中11種青霉素殘留

郭萌萌1，李兆新1*，王 智2，潘明軒1,3，吳海燕1，邢麗紅1，孫曉杰1

(1.中國水產科學研究院 黃海水產研究所 農業(yè)部水產品質量安全檢測與評價重點實驗室，山東 青島 266071；2.青島市產品質量監(jiān)督檢驗研究院 青島市產品質量檢驗技術研究所，山東 青島 266061；3.上海海洋大學，上海 201306)

采用通過式固相萃取凈化策略去除樣品基質中的脂肪和磷脂等雜質干擾，結合液相色譜-串聯(lián)質譜檢測，建立了水產品中11種青霉素殘留的同時快速分析方法。樣品經80%乙腈水溶液提取，Oasis PRiME HLB通過式固相萃取柱凈化，C18色譜柱分離，0.05%甲酸乙腈溶液和0.05%甲酸水溶液梯度洗脫，多反應監(jiān)測正離子模式掃描，內標法定量。11種目標物在相應濃度范圍內線性關系良好，相關系數(shù)不低于0.99，檢出限為0.30～1.5 μg/kg。基質加標回收率為85.5%～110%，相對標準偏差(RSD)為5.9%～14.3%。該方法前處理操作簡便，靈敏度和準確度高，可實現(xiàn)水產品中多種青霉素藥物殘留的同時快速測定。

青霉素；通過式固相萃取；液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)；水產品

青霉素類藥物屬β-內酰胺抗生素，為預防和治療細菌感染的首選抗生素，是臨床最常用的抗生素之一，也被廣泛應用于畜牧、水產等養(yǎng)殖業(yè)。在水產養(yǎng)殖中，有些不法養(yǎng)殖業(yè)者在飼料中違規(guī)添加青霉素類藥物或用藥不規(guī)范將導致藥物在水產品中殘留，不僅對消費者造成直接的健康危害，還增加了人畜共患細菌耐藥菌株泛濫的可能。許多國家和地區(qū)對青霉素類藥物在動物源性食品中的殘留進行了嚴格限制，我國農業(yè)部235號公告[1]規(guī)定動物肌肉中阿莫西林、氨芐西林、青霉素G、氯唑西林、苯唑西林的最高殘留限量分別為50，50，50，300，300 μg/kg；歐盟指令No.2377/90/EEC[2]規(guī)定動物肌肉中阿莫西林、氨芐西林、青霉素G、苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林、萘夫西林的最高殘留限量分別為50，50，50，300，300，300，300 μg/kg。

青霉素類藥物多殘留的分析方法以高效液相色譜法(HPLC)[3-4]和液相色譜-串聯(lián)質譜法(LC-MS/MS)[5-8]為主，其中LC-MS/MS法因定性能力更強而成為目前國際上廣泛采用的青霉素殘留分析方法?，F(xiàn)有方法多采用固相萃取(SPE)技術凈化樣品，步驟繁瑣，且部分化合物的回收率不高，如Macarov等[9]采用ENV+Isolute固相萃取柱凈化結合LC-MS/MS分析方法實現(xiàn)了畜禽肉中9種青霉素的多殘留分析；Junza等[10]采用HLB和Strata固相萃取柱凈化結合UPLC-MS/MS分析方法測定了牛奶中7種青霉素殘留，以上方法均以哌拉西林為內標進行內標法校正，但阿莫西林的回收率僅為50%左右；也有研究采用基質固相分散萃取[11]和分散固相萃取[12]凈化，使用LC-MS/MS法檢測豬肉或水產品中的8～12種青霉素，簡化了樣品前處理方法，以青霉素G-d7為內標，采用內標法定量獲得了較好的回收率(>70%)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Prominence UFLC超快速液相色譜(日本Shimadzu公司)；5500 QTRAP四極桿-線性離子阱復合質譜檢測系統(tǒng)(美國AB SCIEX公司)；T18 Basic均質機(德國IKA公司)；XW-80A旋渦混合器(上海醫(yī)大儀器廠)；Himac CR 22GⅡ高速離心機(日本Hitachi公司)；N-EVAP112氮吹儀(美國Organomation公司)；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)。

標準品：阿莫西林、氨芐西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、雙氯西林、哌拉西林(德國Dr.Ehrensorfer公司)；阿洛西林、甲氧西林、阿莫西林-d4、氨芐西林-d5、青霉素G-d7、萘夫西林-d6(加拿大Toronto Research Chemicals公司)；乙腈(HPLC級，美國Merck公司)；甲酸(HPLC級，美國Fluka公司)；超純水(18.2 MΩ·cm)；Oasis PRiME HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL，美國Waters公司)，其他未作特殊說明的試劑均為分析純。

1.2 樣品預處理

準確稱取2.5 g勻漿試樣于15 mL聚丙烯離心管中，加入內標物(各10 ng)，靜置10 min后加入9 mL 80%乙腈水溶液，渦旋混合1 min，超聲提取10 min，在4 ℃下10 000 r/min離心5 min，移取上清液至10 mL比色管中，再用 80%乙腈水溶液定容至10 mL。

取約1 mL上述提取液潤洗Oasis PRiME HLB固相萃取柱，自然流速流干，棄去，再準確移取2.0 mL提取液加載至SPE小柱上，保持流速為1滴/s，收集流出液。將流出液于35 ℃氮氣吹至略低于0.5 mL，用水定容至0.5 mL，超濾管以12 000 r/min高速離心10 min，供LC-MS/MS測試。

1.3 儀器分析條件

液相色譜條件：Kinetex XB-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，2.6 μm)；柱溫：35 ℃；流速：0.40 mL/min；進樣量：10 μL；流動相：A為0.05%的甲酸水溶液，B為0.05%的甲酸乙腈溶液；洗脫梯度：0～1.0 min，2% B；1.0～3.0 min，2%～50% B；3.0～6.0 min，50%～100%B；6.0～8.0 min，100%B；8.1～10.0 min，2%B。

第四，落實防疫成本費，穩(wěn)定防疫團隊。畜禽動物防疫工作費用需要財政預算頒布，費用有工作人員薪資、免疫藥物費用、疫苗費用等。這一方面穩(wěn)定防疫團隊，一方面減輕防疫團隊和養(yǎng)殖戶的負擔。完善動物防疫系統(tǒng)，讓各級鄉(xiāng)、村均有專業(yè)防疫人員，讓動物防疫工作真正落實到各個角落，從而做到“無不漏”防疫原則。

質譜條件：電噴霧離子源(ESI)，多反應監(jiān)測(MRM)，正離子模式；噴霧電壓：5.5 kV；氣簾氣壓力：0.24 MPa；碰撞氣壓力：0.02 MPa；溫度500 ℃；碰撞室入口電壓：10 V；碰撞室出口電壓：12 V；駐留時間：50 ms；離子源Gas1：0.34 MPa；Gas2：0.34 MPa。其它參數(shù)見表1。

表1 11種目標物的質譜分析參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters for 11 target compounds

*quantitative ion

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

圖1 11種青霉素混合標準溶液的總離子流色譜圖(10.0 μg/L)Fig.1 Total ion chromatogram of 11 penicillins mixed standard solution(10.0 μg/L)mobile phase：acetonitrile(0.005% formic acid)-water(0.005% formic acid)

考慮到青霉素藥物化學結構中含有羧基，而甲醇的化學結構含有羥基，會加速青霉素降解為青霉噻唑酸酯，因此本方法選擇乙腈-水作為流動相體系。已有關于青霉素檢測方法的文獻[9-13]多采用乙腈(0.1%甲酸)-水(0.1%甲酸)進行梯度洗脫，可獲得較好的分離效果和色譜峰形，也有文獻報道[14]采用極少量的甲酸(0.005%)能獲得更高的靈敏度。本研究進一步優(yōu)化了乙腈-水流動相體系中不同甲酸濃度(0.005%，0.02%，0.05%，0.1%)對青霉素藥物色譜分離的影響。實驗發(fā)現(xiàn)甲酸添加濃度為0.005%時，各化合物的響應值較高、分離度較好，僅阿莫西林出峰較快、峰形較寬(圖1)，且在樣品溶液中無法與雜質分離(圖2A)；隨著甲酸濃度增加至0.1%時，阿莫西林的保留能力增強，峰形變窄、響應值增強，但出峰較慢的雙氯西林等其他化合物的保留能力減弱，影響了色譜分離效果。兼顧上述影響因素，本方法最終選擇在乙腈-水體系中各添加0.05%的甲酸作為流動相，不僅獲得了較佳的色譜峰形、分離效果和靈敏度，且在復雜基質溶液中實現(xiàn)了11種青霉素藥物殘留與雜質的良好分離(以阿莫西林為例，見圖2B)。

2.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的選擇 青霉素類藥物易溶于水，且分子結構中含β-內酰胺環(huán)，易受酸堿、重金屬、羥胺基等影響發(fā)生環(huán)的裂解而穩(wěn)定性較差。本方法兼顧青霉素類藥物的溶解性和穩(wěn)定性，選取乙腈水溶液為提取溶劑，同時分別考察了不同濃度(70%，80%，90%)乙腈水溶液對目標物的提取效果。結果表明，以平均回收率計算，其提取率的大小順序為80%乙腈水溶液(～90%)>90%乙腈水溶液(～83%)>70%乙腈水溶液(～70%)，與文獻報道的80%乙腈水溶液對藥物殘留的萃取率較高的實驗結果一致[15]，可能原因是水產品含豐富的蛋白質，80%乙腈水溶液可使蛋白質發(fā)生緩慢且徹底的變性，釋放基質中的藥物殘留，而小于80%的乙腈不能引起蛋白質的完全變性，高于80%的乙腈使蛋白質迅速凝聚而包裹藥物導致萃取率偏低。因此本方法選用80%乙腈水溶液為提取劑。

2.2.2 樣品凈化方法的優(yōu)化 脂肪和磷脂類化合物是水產品基質中藥物殘留分析的主要干擾因素，這些物質不僅干擾LC-MS/MS分析，還會影響色譜柱固定相的活性位點并降低其分辨率[16]，甚至污染質譜儀。本研究為提高方法的準確度和延長色譜柱、質譜儀的使用壽命，擬增加快速、有效的凈化除脂步驟。采用通過式固相萃取凈化策略，以Oasis PRiME HLB固相萃取柱凈化樣品，上樣前先用約1 mL樣品溶液潤洗小柱，然后直接將樣品溶液加載至SPE柱以吸附脂肪和磷脂等雜質，整個凈化過程不損失目標組分，不僅有效凈化了樣品溶液，顯著提高了前處理效率，還增加了目標物和樣品的分析通量。通過比較Oasis PRiME HLB柱凈化前后空白魚肉樣品的全掃描總離子流圖(圖3)，可以看出，Oasis PRiME HLB凈化后的魚肉樣品，以基質成分的強度估算，基質成分明顯減少。

本實驗還考察了上樣量對目標物回收率的影響。分別選取1，2，3，4 mL不同的上樣體積，通過比較平均回收率優(yōu)化最佳的上樣量。實驗結果表明，上樣體積為1 mL和2 mL時，青霉素藥物的平均回收率高于90%且樣品凈化溶液較澄清。從方法的靈敏度考慮，本方法選取2 mL為最佳上樣體積。

2.2.3 樣品濃縮條件的優(yōu)化 采用氮氣吹掃的方式對樣品溶液進行濃縮，因樣品溶液含水量約為20%，實驗發(fā)現(xiàn)乙腈揮發(fā)后，少量的水溶液較難揮發(fā)，使得氮吹濃縮時間延長，氮吹至干時部分目標物的回收率不足60%。因此，本方法濃縮樣品溶液時，氮吹至略小于0.5 mL即取出定容，不僅縮短了濃縮時間，同時也保證了較高的回收率。

2.3 基質效應的評價

為評估本方法的基質效應，實驗考察了用青霉素混合標準系列溶液校正和基質標準系列溶液校正對目標物測定結果的影響，移取10 μg/L的青霉素混合標準溶液0.5 mL，于35 ℃氮氣吹干，加入按“1.2”步驟制備的空白基質溶液溶解并定容至0.5 mL，此時樣品溶液中各目標物的含量為10 μg/kg，作為考察定量結果的理論值，實驗結果見表2。結果表明，本方法經有效的前處理凈化及內標法校正，用青霉素標準系列溶液校正的定量結果與用基質標準系列溶液校正的定量結果基本一致，均與理論值吻合較好，無明顯基質效應。

表2 不同校正方法對目標物定量結果的影響(n=3)Table 2 Quantitative results of 11 target compounds by different calibration methods(n=3)

*the calibration curves were prepared using penicillins standard solutions；**the calculation curves were prepared using matrix-matched standard solution

2.4 靈敏度、準確度與精密度

取適量青霉素藥物混合標準溶液和內標溶液，配制一系列濃度梯度的標準溶液，在“1.3”條件下依次測定，以各組分和內標物的峰面積比值為縱坐標(y)，各組分的質量濃度為橫坐標(x,μg/L)進行線性回歸分析。在空白樣品中添加低濃度的標準溶液，按“1.2”步驟進行樣品前處理后進樣測定，以信噪比S/N≥3和S/N≥10分別確定檢出限(LOD)及定量下限(LOQ)。11種目標物的線性范圍、回歸方程、相關系數(shù)、檢出限及定量下限見表3。結果表明，11種青霉素的線性關系良好，檢出限為0.30～1.5 μg/kg，方法的靈敏度適用于多組分青霉素藥物殘留的高靈敏定量分析。

表3 11種青霉素的線性范圍、回歸方程、相關系數(shù)、檢出限及定量下限Table 3 Linear ranges，regression equations，correlation coefficients，limits of detection and quantitation of 11 penicillins

選取陰性鯉魚、甲魚和蝦的肌肉為測試基質，分別添加相當于5，50,300 μg/kg濃度的混合標準溶液進行測定，每個濃度設6個平行。結果顯示，11種目標物在鯉魚肌肉中的加標回收率為85.5%～105%，相對標準偏差為5.9%～12.1%；在甲魚肌肉中的加標回收率為87.8%～110%，相對標準偏差為7.6%～14.3%；在蝦肌肉中的加標回收率為89.0%～102%，相對標準偏差為7.7%～13.0%。以上結果說明，該方法的準確度高，精密度好，可滿足藥物殘留的日常監(jiān)測要求。

2.5 實際樣品的測定

應用本方法檢測了30個水產品(鯉魚、甲魚、對蝦、鰻魚等)的青霉素藥物殘留情況，其中1個鰻魚樣品檢出青霉素G，含量為3.75 μg/kg，遠低于我國動物肌肉中標準限量50 μg/kg，其他青霉素藥物均未檢出。

3 結 論

本文利用通過式Oasis PRiME HLB固相萃取凈化策略，省去了常規(guī)固相萃取凈化方法的活化和淋洗步驟，采用直接上樣吸附雜質成分，簡化了樣品前處理步驟，且不損失目標組分，實現(xiàn)了11種青霉素藥物的同步提??；同時采用同位素內標法定量，解決了大多數(shù)青霉素殘留方法中阿莫西林回收率不高的難題，提高了青霉素多殘留測定方法的準確度。該方法的建立為同時分析生物基質中多種青霉素藥物殘留提供了新的技術手段。

[1] Ministry of Agriculture.No.235 Bulletin of the Ministry of Agriculture of the People’s Republic of China(農業(yè)部.中華人民共和國農業(yè)部公告第235號).[2002-12-24].http://www.moa.gov.cn/zwllm/nybz/index_2.htm.

[2] Council Regulation(EEC) No 2337/90 of 26 June 1990 Laying Dowm a Community Procedure for the Establishment of Maximum Residue Limits of Veterinary Medicinal Products in Foodstuffs of Animal Origin.Official Journal of the European Communities，1997，L67:1.

[3] GB 29682-2013.Multi Residue Determination of the Penicillins in Aquatic Products by High Performance Liquid Chromatographic Method.National Food Safety Standards(水產品中青霉素類藥物多殘留的測定 高效液相色譜法.食品安全國家標準).

[4] Ye N S，Gu X X，Zhang Q.Chin.J.Anal.Lab.(葉能勝，谷學新，張琦.分析試驗室)，2010，29(6)：73-77.

[5] Dorival-García N，Junza A，Zafra-Gómez A，Barrón D，Navalón A.FoodControl，2016，60：382-393.

[6] Chico J，Rúbies A，Centrich F，Companyó R，Prat M D，Granados M.J.Chromatogr.A，2008，1213(2)：189-199.

[7] GB/T 22952-2008.Determination of Amoxicillin，Ampicillin，Piperacillin，Penicillin G，Penicillin V，Oxacillin，Cloxacillin，Nafcillin，Dicloxacillin Residues in Fugu and Eel——LC-MS/MS Method.National Standards of the People’s Republic of China(河豚魚和鰻魚中阿莫西林、氨芐西林、哌拉西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、萘夫西林、雙氯西林殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質譜法.中華人民共和國國家標準).

[8] GB/T 21315-2007.Determination of Penicillins Residues in Foodstuffs of Animal Origin—LC-MS/MS Method.National Standards of the People’s Republic of China(動物源性食品中青霉素族抗生素殘留量檢測方法 液相色譜-質譜/質譜法.中華人民共和國國家標準).

[9] Macarov C A，Tong L，Martínez-Huélamo M，Hermo M P，Chirila E，Wang Y X，Barrón D，Barbosa J.FoodChem.，2012，135：2612-2621.

[10] Junza A，Amatya R，Barrón D，Barbosa J.J.Chromatogr.B，2011，879：2601-2610.

[11] Huang Z，Pan X D，Huang B F，Xu J J，Wang L M，Ren Y P.FoodControl，2016，66：145-150.

[12] Guo M M，Li Z X，Tan Z J，Wu H Y，Han X Q，Leng K L，Zhai Y X.J.Instrum.Anal.(郭萌萌，李兆新，譚志軍，吳海燕，韓現(xiàn)芹，冷凱良，翟毓秀.分析測試學報)，2011，30(9)：969-975.

[13] Liu Y，Zhu K，Wang J F，Huang X Y，Wang G L，Li C Y，Cao J，Ding S Y.J.Chromatogr.B，2016，1008：74-80.

[14] Becker M，Zittlau E，Petz M.Anal.Chim.Acta，2004，520：19-32.

[15] Jia F Y，Wang W W，Liu Z B，Yin J G，Liu Y M.ActaChim.Sin.(賈風燕，王文文，劉振波，殷軍港，劉永明.化學學報)，2012,70(4):485-491.

[16] Pensado L，Casais M C，Mejuto M C，Cela R.J.Chromatogr.A，2005，1077(2)：103-109.

Rapid and Simultaneous Determination of 11 Penicillin Residues in Fishery Products by Pass-through SPE Purification and Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

GUO Meng-meng1，LI Zhao-xin1*，WANG Zhi2，PAN Ming-xuan1,3，WU Hai-yan1，XING Li-hong1，SUN Xiao-jie1

(1.Key Laboratory of Testing and Evaluation for Aquatic Product Safety and Quality，Ministry of Agriculture，Yellow Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Qingdao 266071，China；2.Qingdao Institute of Product Quality Inspection and Technical Research，Qingdao Product Quality Supervision and Testing Research，Qingdao 266061，China；3.Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China)

A method was developed for the rapid and simultaneous determination of 11 penicillins in fishery products by pass-through SPE purification with liquid chromatography tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)．The samples were extracted with acetonitrile-water(80∶20，by volume)，and then cleaned up with an Oasis PRiME HLB pass-through SPE column.The separation of 11 penicillins were performed on a Kinetex XB-C18(2.1 mm×100 mm，2.6 μm) column by using a mixture of 0.05% formic acid and acetonitrile containing 0.05% formic acid as mobile phase.Qualitative and quantitative analyses of the analyte were carried out under the multiple reaction monitoring(MRM) mode with positive electrospray ionization．And the isotope internal standards were employed for the quantification.The calibration curves were linear well in corresponding concentration ranges,with correlation coefficient over 0.99.The detection limits ranged from 0.30 μg/kg to 1.5 μg/kg.The average spiked recoveries for 11 penicillins were between 85.5%and 110% with relative standard deviations(RSDs) of 5.9%-14.3%．The proposed method is accurate，sensitive and high-efficient，and is practical for the determination of penicillins in fishery products．

penicillins；pass-through solid-phase extraction；liquid chromatography tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)；fishery products

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.03.007

2016-10-10；

2016-11-20

農業(yè)行業(yè)標準修訂項目(2015-439)

O657.63；TQ465.1

A

1004-4957(2017)03-0337-06

*通訊作者：李兆新，博士，研究員，研究方向：水產品安全與質量控制，Tel:0532-85836348，E-mail：lizx@ysfri.ac.cn