酸性功能多糖的發(fā)酵關(guān)鍵技術(shù)研究

多糖是糖天然存在的重要形式，包括結(jié)構(gòu)多糖、儲存多糖和生物活性多糖。其中含有酸性基團的多糖一般稱為酸性多糖。酸性多糖具有增強機體免疫功能、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗衰老等重要生物活性，在功能性食品、生物醫(yī)藥、生物材料等領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。

目前，酸性功能多糖的發(fā)酵關(guān)鍵技術(shù)的研究主要集中在以下四個方面：（1）建立酸性多糖高產(chǎn)菌株篩選及安全生產(chǎn)菌株改造的新方法。如于軍華（2002）通過用不同pH條件下的亞硝基胍處理出發(fā)菌種E.coli-K235J4，得到突變菌株JYⅡ-74；搖瓶培養(yǎng)，發(fā)酵液中聚唾液酸的產(chǎn)量達2 500 μg/mL，比出發(fā)菌株提高了1 000 ug/mL，且生產(chǎn)能力穩(wěn)定。CN201210098057.0公開了一種高產(chǎn)莢膜多糖的大腸桿菌基因工程菌，并以此莢膜多糖制備軟骨素的方法。通過在大腸桿菌中過量表達莢膜多糖合成基因簇轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子slyA蛋白，促進大腸桿菌莢膜多糖合成基因簇的表達，從而增加大腸桿菌K4生產(chǎn)莢膜多糖。發(fā)酵培養(yǎng)該大腸桿菌工程菌后莢膜多糖產(chǎn)量比原菌提高112%，并收集制備獲得純度大于93%的軟骨素。(2)提出強化酸性多糖合成能力的代謝調(diào)控新策略。如楊愛華等（2015）利用基因工程手段過量表達E．coli K4莢膜多糖（K4CPS）合成途徑中相關(guān)代謝調(diào)控因子SlyA和RfaH，以構(gòu)建高效合成K4CPS的菌株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：調(diào)控蛋白SlyA和RfaH的過量表達能夠大幅度提高E.coli K4的K4CPS合成，并增強菌體對甘油的利用率，而乙酸合成明顯降低。與單獨表達策略相比，共表達策略能夠更加有效地增強菌體合成K4CPS的能力。（3）發(fā)展酸性多糖結(jié)構(gòu)改造、修飾及活性調(diào)控新技術(shù)。如CN201210464123.1利用實驗室保藏的分別攜帶2-O位脫硫酸化酶基因、3-O位硫酸基轉(zhuǎn)移酶基因的兩種質(zhì)粒，首先通過轉(zhuǎn)化得到重組工程菌；然后在搖瓶中優(yōu)化了重組菌的生長和誘導(dǎo)產(chǎn)酶等條件，得到大量的2-O位脫硫酸化酶與3-O位硫酸基轉(zhuǎn)移酶；最后將粗酶通過鎳柱進行純化，快速得到了純度高達90%的純酶。謝觀蓮等（2013）以酶法合成肝素/HS為目的,對硫酸化修飾酶硫酸乙酰肝素2-O硫酸基轉(zhuǎn)移酶Hs2st進行了克隆表達、純化及其表達條件的優(yōu)化。（4）開發(fā)新型高附加值酸性多糖產(chǎn)品及其應(yīng)用。如曹璐娟、施瑜（2014）分別制備了經(jīng)β-環(huán)糊精修飾的透明質(zhì)酸主體大分子(HA-CD)，用2-萘乙酸(2-NAA)修飾的葡聚糖客體大分子(Dex-NAA)，其結(jié)構(gòu)均經(jīng)核磁共振氫譜進行確認，接枝率分別為15.53%和7.38%。利用β-環(huán)糊精和2-萘乙酸間的主客體識別作用，制備得到超分子水凝膠。這種由天然多糖構(gòu)建的超分子水凝膠有望作為細胞支架應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域。劉文、張苗等（2015）利用肝素前體K5多糖，通過腙鍵（Hydrazone bond）連接抗腫瘤藥物阿霉素（DOX），制備具有pH敏感性的K5-hydrazone-DOX（KHD）前體藥物。對其載藥量、形貌和體外藥物釋放等性質(zhì)進行了研究，并通過HeLa細胞對其體外細胞毒性和細胞攝取進行了評價。細胞實驗表明，KHD前體藥物可迅速被細胞攝取，并且具有腫瘤細胞抑制作用。CN201280022676.X公開了自未硫酸化的軟骨素骨架開始，經(jīng)化學(xué)硫酸化，生產(chǎn)具有10 000～30 000平均相對分子質(zhì)量(Mw)的硫酸軟骨素的方法，所述未硫酸化的軟骨素骨架經(jīng)大腸桿菌(E.coli)菌株O5:K4:H4直接產(chǎn)生的莢膜多糖K4的酸水解得到或者由基因改造的大腸桿菌(E.coli)菌株直接生產(chǎn)。陳芳（2013）通過對工程菌細胞培養(yǎng)和全細胞生物轉(zhuǎn)化的各種條件的摸索，建立了全細胞催化法生產(chǎn)Neu5Ac的小試工藝流程，使Neu5Ac的產(chǎn)量提高到294.39 mmol/L，該方法具有操作簡便、高效和經(jīng)濟的優(yōu)勢，為Neu5Ac的規(guī)?；a(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

（江南大學(xué)圖書館 張群）