顏曉麗

(佛山市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)中心, 廣東 佛山 528200)

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食品中4種罌粟殼生物堿

顏曉麗

(佛山市質(zhì)量計(jì)量監(jiān)督檢測(cè)中心, 廣東 佛山 528200)

建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)測(cè)定食品中可卡因、可待因、嗎啡、鹽酸罌粟堿的檢測(cè)方法. 樣品經(jīng)氨化甲醇提取，采用 Capcell Pak C18(250 mm×2.0 mm，MGII 5 μm) 色譜柱，以色譜純乙腈為流動(dòng)相A，以20 mmol/L 乙酸銨和0.1%甲酸緩沖液為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫. 在優(yōu)選條件下，可待因、嗎啡方法線性范圍為5.0～50.0 μg/L，可卡因、鹽酸罌粟堿的方法線性范圍為1.0～20.0 μg/L，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，方法檢出限在0.1～0.8 μg/kg之間，平均回收率為76.0%～111.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD低于10%.

超高液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；可卡因；可待因；嗎啡；鹽酸罌粟堿

罌粟屬罌粟科植物，是制取鴉片的主要原料，同時(shí)其提取物也是多種鎮(zhèn)靜劑的原料，其果實(shí)中含有嗎啡、可卡因、可待因、鹽酸罌粟堿等20多種生物堿. 國(guó)際條約關(guān)于麻醉品和精神藥物管理指導(dǎo)原則中規(guī)定嗎啡、可待因、罌粟堿、可卡因4種生物堿禁止用于食品，國(guó)家衛(wèi)計(jì)委、公安部、國(guó)家藥品監(jiān)督管理局相關(guān)法規(guī)規(guī)定嚴(yán)禁在食品中添加罌粟殼(籽). 通過檢測(cè)嗎啡、可卡因、可待因、鹽酸罌粟堿可實(shí)現(xiàn)對(duì)食品中罌粟殼非法添加情況的監(jiān)測(cè).

目前，嗎啡、可卡因、可待因、鹽酸罌粟堿的檢測(cè)方法主要有薄層色譜法[1]、氣相色譜法[2]、高效液相色譜法[3-4]、極譜法[5]、免疫測(cè)定法[6]、氣相色譜-質(zhì)譜法[7-9]等. 其中氣相色譜方法和氣相色譜-質(zhì)譜法不適用于難揮發(fā)、強(qiáng)極性和易熱解化合物的檢測(cè)，且樣品需要衍生化處理，操作繁瑣. 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法存在交叉反應(yīng)，特異性較差. HPLC法的靈敏度較低. 液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀具有較好的靈敏度和特異性，隨著科學(xué)儀器的不斷發(fā)展，近年來有不少使用液相串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)生物堿的報(bào)道[9-12]. 但是運(yùn)用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)食品中罌粟堿、嗎啡、可待因和可卡因的報(bào)道較少，同時(shí)這些檢測(cè)方法使用直接進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到的峰面積響應(yīng)值對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品目標(biāo)物濃度，這種方法無法排除待檢物基質(zhì)和前處理溶劑提取效率對(duì)于待測(cè)物實(shí)測(cè)濃度的影響. 本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)，通過空白樣品加標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，建立快速準(zhǔn)確測(cè)定食品中鹽酸罌粟堿、嗎啡、可卡因和可待因的方法. 該方法的靈敏度高，可靠性較強(qiáng)，結(jié)果令人滿意.

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent1290II-6470 Triple Quad 超高效液相-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司)，Cenece@ TDZ5-WS離心機(jī)(湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司)，Vortex kylin-bell@5旋渦混合儀(美國(guó))，國(guó)華SHA-C恒溫振蕩器.

乙腈、甲醇和正己烷均為色譜純(Merck, Darmstadt, Germany); 乙酸銨、甲酸為色譜純(恩科化學(xué)有限公司). 試驗(yàn)用水均來自Milli-Q純水系統(tǒng)(法國(guó)Millipore公司). 可待因、可卡因、嗎啡、鹽酸罌粟堿標(biāo)準(zhǔn)品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供. 調(diào)味油、調(diào)味醬、火鍋料樣品來源于超市、生產(chǎn)廠家等市場(chǎng)定期監(jiān)督抽查樣本，共計(jì)15例.

1.2 標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制

準(zhǔn)確稱取4種生物堿標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg于4個(gè)10 mL容量瓶中, 用少量甲醇溶解后, 并用甲醇定容至刻度，做為標(biāo)準(zhǔn)貯備液(1.0 mg/mL).

1.3 色譜條件

色譜柱：Capcell Pak C18(250 mm×2.0 mm，MGII 5 μm)，柱溫：30 ℃，流速：0.2 μL/min；以色譜純乙腈為流動(dòng)相A，以20 mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸緩沖液為流動(dòng)相B，按照表1進(jìn)行梯度洗脫.

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution parameter

離子源：電噴霧電離-正離子模式(AJS ESI+)；檢測(cè)方式：動(dòng)態(tài)多反應(yīng)模式檢測(cè)(DMRM)；噴嘴電壓：500 V；毛細(xì)管電壓：3 500 V； 干燥氣溫度：300 ℃；干燥氣流速：5 L/min；鞘氣溫度：250 ℃；鞘氣流速：11 L/min. 經(jīng)過對(duì)毛細(xì)管出口去簇電壓(DP)、碰撞池能量(CE)等質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，最終確定可待因、可卡因、嗎啡、鹽酸罌粟堿質(zhì)譜條件，如表2所列.

表2 可待因、可卡因、嗎啡、鹽酸罌粟堿的優(yōu)化MRM參數(shù)Table 2 Optimized MRM parameters for cocaine, codeine, morphine and papaverine hydrochloride

1.4 樣品處理

油狀調(diào)味油和調(diào)味醬，可以直接取樣進(jìn)行前處理. 含有顆粒的調(diào)味醬混合均勻后取樣. 半固體和固態(tài)火鍋料樣品，研磨粉碎后均勻取樣.

前處理步驟為，稱取1.00 g均勻樣品于25 mL離心管中，加入5 mL 5%氨化甲醇，渦旋3 min后，振蕩提取20 min，于離心機(jī)2 500 r/min離心5 min，移取有機(jī)相層至另一離心管中，用5 mL 5%氨化甲醇再次按照上述步驟提取殘?jiān)?，合并有機(jī)相，然后用甲醇飽和的正己烷去除有機(jī)相中油脂，除去正己烷層，有機(jī)相在60 ℃揮干，用甲醇定容至500 μL, 過0.22 μm聚四氟乙烯濾膜，待UPLC-MS/MS測(cè)定.

調(diào)味油、調(diào)味醬和火鍋湯料經(jīng)上述方法前處理后，上機(jī)檢測(cè)各生物堿，其響應(yīng)值低于方法檢出限時(shí)，該樣品可以作為空白基質(zhì)，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的配置. 具體步驟為：稱取1.00 g混合均勻的調(diào)味醬空白基質(zhì)樣品，添加不同量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按上述前處理步驟，根據(jù)檢測(cè)需要得到一系列不同濃度的基質(zhì)提取液，用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

在流動(dòng)相A和B的體積比為50∶50和多反應(yīng)監(jiān)控(MRM)模式下，考查了使用Allure PFP Propyl (100 mm×2.1 mm×5 μm)，Capcell Pak C18(250 mm×2.0 mm，MGⅡ 5 μm)，PC HILIC (100 mm×2.0 mm×5 μm) 和Ultra IBD柱(50 mm×2.1 mm×5 μm) 4種色譜柱對(duì)可待因、可卡因、嗎啡、鹽酸罌粟堿進(jìn)行分離. 結(jié)果表明，Capcell Pak C18(250 mm×2.0 mm，MGⅡ 5 μm) 對(duì)于這4種生物堿的分離效果和峰形最好. 究其原因，Capcell Pak C18柱子的填料為硅聚合物覆蓋的連接C18基團(tuán)的硅膠球，具有合適的極性和疏水分離性，可耐受的pH范圍較廣(2～10)，適合堿性較強(qiáng)的化合物的分離，因此后續(xù)的優(yōu)化均采用該色譜柱.

2.1.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

為了達(dá)到最好的分離效果同時(shí)兼顧檢測(cè)效率，在多反應(yīng)監(jiān)控(MRM)模式下分別考查了流動(dòng)相A和B的體積比在20∶80、30∶70、50∶50、80∶20下，4種生物堿的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品(10 μg/L)的分離情況，最終得出如表1所列的梯度洗脫程序. 4種生物堿的MRM色譜圖如圖1所示.

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及檢出限

如果采用外標(biāo)法，直接使用標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度對(duì)響應(yīng)峰面積作圖，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算目標(biāo)物濃度，則無法排除基質(zhì)和溶劑提取效率的影響，得出的回收率低于50%. 因此，為了扣除基質(zhì)干擾，提高定量的準(zhǔn)確性，選擇了基質(zhì)空白加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)前處理步驟后上機(jī)，得出相應(yīng)的峰面積響應(yīng)值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，外標(biāo)法定量. 以空白加標(biāo)后，前處理上機(jī)前，可待因、嗎啡的加標(biāo)質(zhì)量濃度分別為5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L，作為X軸，上述加標(biāo)試驗(yàn)實(shí)際得到的峰面積響應(yīng)值作為Y軸，作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線. 同樣的方法得到可卡因、鹽酸罌粟堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線，所選用的質(zhì)量濃度為1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L. 得到如表3中的各個(gè)生物堿的線性回歸方程，用于計(jì)算實(shí)際樣品中待測(cè)物的濃度.

圖1 4種生物堿的MRM色譜圖Fig.1 MRM extracting spectra of 4 alkaloids

各生物堿最低濃度的添加量通過信噪比S/N = 3時(shí)，對(duì)應(yīng)的目標(biāo)物含量確定儀器檢出限IDL，即0.1或0.5 ng，經(jīng)前處理后，上機(jī)測(cè)定后得出峰面積響應(yīng)值，重復(fù)進(jìn)樣7次， 按照美國(guó)EPA(美國(guó)環(huán)保局)確定的檢出限定義(MDL=t(n-1,1-α=0.99)×S)計(jì)算方法檢出限，結(jié)果如表3所列.

表3 4種生物堿的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、方法檢出限和方法定量限Table 3 Linear range, relative coefficient, method detection limit (MDL) and method quantification limit (MQL) of 4 alkaloids

2.1.4 回收率與精密度

向混合均勻的調(diào)味醬空白樣品中分別加入低、中、高水平的嗎啡、 可待因、鹽酸罌粟堿、可卡因標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)前處理后使得上機(jī)前質(zhì)量濃度分別為低(5 μg/L)、中(8 μg/L)、高(10 μg/L)進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn).由于該方法中鹽酸罌粟堿、可卡因具有較好響應(yīng)值，額外考查了這兩個(gè)物質(zhì)在經(jīng)前處理后、上機(jī)前質(zhì)量濃度分別為0.5和1 μg/L的加標(biāo)回收試驗(yàn). 每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定6次，結(jié)果如表4所列. 由表4可見，該方法的平均回收率為76.0%～111.2%，RSD為0.7%～9.8 %，表明該方法的精密度和準(zhǔn)確度良好，可以滿足食品中4種生物堿的痕量分析要求. 典型的加標(biāo)回收試驗(yàn)MRM模式測(cè)定圖譜如圖2所示.

表4 4種生物堿的回收率與精密度測(cè)定結(jié)果(n=6)Table 4 Determination results for recovery and precision of 4 alkaloids (n=6)

圖2 4種生物堿5 μg/L加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)的MRM圖譜Fig.2 MRM spectra of recovery experiments under 5 μg/L as spiking concentration for 4 alkaloids

2.1.5 樣品測(cè)定

樣品中4種生物堿計(jì)算公式如下：

其中,Co為曲線計(jì)算出的生物堿濃度，V為上機(jī)前稀釋體積，m為樣品稱量質(zhì)量.

隨機(jī)抽取了調(diào)味油、調(diào)味醬、火鍋料樣品共15批進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果如表5所列. 由表5可見，8批次樣品中不同程度地檢出嗎啡、可待因、鹽酸罌粟堿、可卡因，表明食品調(diào)味料中存在添加罌粟殼的問題. 麻辣粉(序號(hào)12)樣品檢測(cè)的MRM色譜圖如圖3所示.

圖3 麻辣粉(序號(hào)12)樣品檢測(cè)的MRM色譜圖Fig.3 MRM spectra for spicy powder (entry 12)

*：BMDL表示低于方法檢出限，BMQL表示低于方法檢定量限.

3 結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定食品中嗎啡、可待因、鹽酸罌粟堿、可卡因等4種罌粟殼生物堿的方法. 該方法檢出限在0.1～0.8 μg/L之間，定量限在0.2～2.5 μg/L之間，平均回收率為76.0%～111.2 %，RSD為0.7%～9.8 %. 方法簡(jiǎn)便快速，精確度、準(zhǔn)確度和靈敏度均較高，可滿足食品中4種罌粟殼生物堿成分同時(shí)定量檢測(cè)的要求，將為食品安全監(jiān)管提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持.

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《分析測(cè)試技術(shù)與儀器》編輯部

Simultaneous Determination of Four Opium Poppy Husk Alkaloids in Residues of Foods Using Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

YAN Xiao-li

(FoshanSupervisonTestingCenterofQualityandMetrology,Foshan, 528200,Guangdong,China)

A method of ultra performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS) was developed for the simultaneous determination of four opium poppy husk alkaloids(i. e., cocaine, codeine, morphine and papaverine hydrochloride) in the residues of foods. The samples were extracted by methanol (containing 5 % ammonia acetate) followed by analyzed on a UPLC-MS/MS system (AJS ESI positive mode) equipped with a Capcell Pak C18(250 mm×2.0 mm，MGII 5 μm) column with the mobile phase of acetonitrile and aqueous solution of ammonium acetate (20 mmol/L) containing formic acid (0.1 %) as the additive. Under optimized conditions, the linear range for codeine and morphine were 5.0～50.0 μg/L, and those for cocaine and papaverine were 1.0～20.0 μg/L, with relative coefficients above 0.999. The limits of detection for the method was in the range of 0.1～0.8 μg/kg, and average spiking recovery was in the range of 76.0%～111.2 % with RSDs below 10%. Key words：UPLC-MS/MS；cocaine; codeine; morphine; papaverine hydrochloride

分析測(cè)試新成果(011～017)

2017-01-15;

2017-03-02.

顏曉麗(1980-)，女，碩士研究生,質(zhì)量工程師，主要從事食品分析，E-mail：junouchem@163.com.

O657.32

B

1006-3757(2017)01-0011-07

10.16495/j.1006-3757.2017.01.003