牛玉靜，曹紅，黃曉林，童軍茂*，隋佳慧，楊雨鑫

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832003；2.嘉興學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江嘉興314001；3.浙江師范大學(xué)物理化學(xué)研究所，浙江金華321004）

復(fù)合誘變PenicilliumpurpurogenumLi-3選育高產(chǎn)紅色素及其生物活性研究

牛玉靜1，曹紅2，黃曉林3，童軍茂1*，隋佳慧2，楊雨鑫2

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子832003；2.嘉興學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江嘉興314001；3.浙江師范大學(xué)物理化學(xué)研究所，浙江金華321004）

以產(chǎn)紫青霉菌(Penicillium purpurogenum)Li-3為出發(fā)菌株，采用紫外-氯化鋰復(fù)合誘變方法選育高產(chǎn)紅色素菌株；并對紅色素進(jìn)行生物活性研究，選取1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)體系評價抗氧化活性；采用濾紙片擴(kuò)散法研究產(chǎn)紫青霉菌突變株紅色素對金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和大腸桿菌(Escherichia coli)的抑制作用。結(jié)果表明，最佳紫外照射時間為120 s，最佳氯化鋰質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.28%，篩選得到一株高產(chǎn)菌株P(guān).purpurogenumLi-3-9，接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，32℃、150 r/min培養(yǎng)168 h后，測定其紅色素色價最高值達(dá)到3.28 U/mL，比出發(fā)菌株提高了83%。且該菌株連續(xù)傳代5次，其遺傳穩(wěn)定性較好。P.purpurogenumLi-3-9代謝產(chǎn)生的紅色素具有較好的DPPH自由基清除能力和抑制金黃色葡萄球菌的能力。

產(chǎn)紫青霉菌；復(fù)合誘變；紅色素；生物活性

由于消費(fèi)者對健康、營養(yǎng)、藥理作用的重視，天然色素因無毒害作用已經(jīng)被越來越多地應(yīng)用為添加劑、染色劑、抗氧化劑及抗生素[1]。天然色素可以從植物、動物、微生物中提取，而利用微生物生產(chǎn)天然色素可以不受環(huán)境制約、易于培養(yǎng)、降低生產(chǎn)成本[2]，因此，微生物色素成為了研究開發(fā)熱點(diǎn)。

自然界中真菌種類的多樣性，使其成為研究各種天然色素的重要資源庫。大多數(shù)真菌產(chǎn)生的色素屬于醌類，類黃酮，聚酮類和嗜氮酮類[3]，并且真菌色素具有著色性好、穩(wěn)定性強(qiáng)、生物活性高等作用[4-5]。如今，已有研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Monascusspp.、Epicoccumspp.、Paecilomycesspp.、Penicilliumspp.等[6]多種屬的絲狀真菌能產(chǎn)種類豐富的天然色素，其中，一些不產(chǎn)真菌毒素的種屬，如產(chǎn)紫青霉菌（Penicillium purpurogenum）和附球菌（Epicoccum）具有生產(chǎn)安全性好的食品級色素的潛力。青霉屬和其相近的種屬，如黃曲霉（Talaromyces）能產(chǎn)生類紅曲霉色素，并且不產(chǎn)生真菌毒素。MéNDEZA等[7]以產(chǎn)紫青霉菌（P.purpurogenum）GH2菌株為試驗(yàn)菌株，從其發(fā)酵液中分離獲得一種水溶性紅色素，產(chǎn)色素量達(dá)到（2.46g/L）。SANTOS-EBINUMAVC等[8]報道，產(chǎn)紫青霉菌（P.purpurogenum）DPUA 1275有生產(chǎn)一種具有抗菌活性的天然色素的潛力且不生產(chǎn)真菌毒素。

因產(chǎn)紫青霉菌（P.purpurogenum）合成色素產(chǎn)量低不能直接用于工業(yè)化生產(chǎn)。目前，提高色素產(chǎn)量的措施主要通過培養(yǎng)條件的優(yōu)化、誘變選育、構(gòu)建基因工程菌等方法實(shí)現(xiàn)[9]。在產(chǎn)紫青霉合成色素機(jī)制尚未清晰之前，對其進(jìn)行定向改造存在較大難度。針對提高產(chǎn)紫青霉菌色素產(chǎn)量的研究主要集中在培養(yǎng)條件的優(yōu)化[10-12]，而誘變育種也是提高色素產(chǎn)量的重要方法之一[13-15]，且操作簡單、速度快。因此，本研究采用紫外（ultraviolet，UV）-氯化鋰（LiCl）復(fù)合誘變選育產(chǎn)紫青霉高產(chǎn)菌（P.purpurogenum），并考察紅色素對1,1-二苯基-2-苦肼基（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力及對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌活性，為該天然來源的真菌紅色素在食品、保健品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與方法

1.1.1 菌株與試劑

產(chǎn)紫青霉菌（P.purpurogenum）Li-3、大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）：本實(shí)驗(yàn)室保存；葡萄糖、K2HPO4、MgSO4·7H2O、KCl、FeSO4·7H2O、氯化鋰和乙醇等均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖2g/L，NH4NO33g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，蒸餾水1 L。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：將300 g馬鈴薯切成小塊并熬成汁，把馬鈴薯汁與20 g葡萄糖溶于1 L水中，加入17 g瓊脂。

馬鈴薯葡萄糖液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KCl 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，蒸餾水1 L。

上述培養(yǎng)基121℃滅菌20 min，冷卻至室溫使用。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent Carry60型紫外可見分光光度計：美國安捷倫科技有限公司；SKY-211B型恒溫?fù)u床：蘇州賽恩斯儀器有限公司；VD-850型超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；LGJ-18A冷凍干燥機(jī)：上海百典儀器設(shè)備有限公司；DSX-280B型手提式壓力蒸氣滅菌器：上海申安醫(yī)療器械公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌懸液的制備

將保藏的菌株接種到種子培養(yǎng)基32℃恒溫培養(yǎng)72 h，取對數(shù)生長期菌液5 mL，5 000 r/min離心10 min，用無菌生理鹽水洗滌菌體兩次后，再用生理鹽水重懸后適當(dāng)稀釋，即得菌懸液。

1.3.2 紫外誘變

打開自制紫外誘變箱，預(yù)熱20 min穩(wěn)定波長。分別取5 mL菌懸液于無菌培養(yǎng)皿（9 cm）中，在磁力攪拌器上低速攪拌，置于20 W紫外燈下15 cm處分別照射0、30 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s、210 s、240 s、270 s、300 s，以未進(jìn)行紫外照射為對照組。黑暗條件下，將處理的菌懸液稀釋，取10-3、10-4、10-5稀釋液100 μL涂布PDA培養(yǎng)基，每個梯度3個平行。32℃條件下避光倒置培養(yǎng)4 d后計數(shù)，統(tǒng)計平板中菌落數(shù)。計算其致死率，確定最佳紫外照射時間。

1.3.3 氯化鋰誘變

吸取經(jīng)最佳紫外照射時間誘變且等梯度稀釋過的菌懸液100 μL涂布于氯化鋰質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0、0.12%、0.16%、0.20%、0.24%、0.28%、0.32%、0.36%、0.40%的平板上，以未加氯化鋰作為對照組。每個處理3次重復(fù)。倒置于培養(yǎng)箱中32℃恒溫避光培養(yǎng)4 d。待平板長出菌落后計數(shù)，計算其致死率，確定最佳氯化鋰誘變濃度。

1.3.4 紫外-氯化鋰復(fù)合誘變

在最佳紫外照射時間對菌懸液誘變，涂布于最佳氯化鋰濃度平板上，32℃恒溫避光培養(yǎng)4 d。

1.3.5 篩選方法

經(jīng)過紫外-氯化鋰復(fù)合誘變后的菌懸液于32℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)4 d，待菌落長出。選取菌落生長較快、直徑大且顏色較深的單菌落，挑取菌絲接種于種子培養(yǎng)基中（裝液量100 mL/250 mL），32℃、150 r/min條件下培養(yǎng)3 d。將培養(yǎng)好的種子按1%接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中（裝液量75 mL/250 mL），32℃、150 r/min培養(yǎng)50 h后，溫度調(diào)至20℃培養(yǎng)118 h[10]。發(fā)酵完成后在波長500 nm處測定其吸光度值。與出發(fā)菌株的紅色素含量進(jìn)行比較，選取紅色素含量高于出發(fā)菌株的誘變菌斜面低溫保存。

1.3.6 紅色素色價的測定

取5 mL紅色素發(fā)酵液，加入5 mL體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇溶液，加塞置于搖床32℃，150 r/min萃取30 min，7 000 r/min離心10min，上清液經(jīng)定性濾紙過濾，稀釋適當(dāng)倍數(shù)，用分光光度計在波長500nm處測定吸光度值，紅色素色價（U/mL）計算公式如下[16]：

紅色素色價（U/mL）=OD500nm×稀釋倍數(shù)

1.3.7 突變株遺傳性鑒定

將正突變株連續(xù)傳代5次，每代進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，并檢測其發(fā)酵液中產(chǎn)色素能力，以確定正突變株的遺傳穩(wěn)定性。

1.3.8 紅色素生物活性實(shí)驗(yàn)

（1）色素粗品的制備

待液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，采用減壓抽濾的方式，實(shí)現(xiàn)菌絲與濾液的分離。將收集的紅色發(fā)酵液冷凍干燥后于干燥器中保存，備用。

（2）紅色素抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

取0.1 mmol/LDPPH乙醇溶液4.0 mL，加入質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL的樣品溶液1.0mL，室溫放置30min，在517nm波長條件下，以無水乙醇為參比，測定吸光度值（Ai）；另取0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液4.0 mL，加入無水乙醇1.0 mL，室溫放置30 min，測其吸光度值（A0）；取無水乙醇4.0 mL加入不同濃度樣品溶液1.0mL，室溫放置30min，測其吸光度值（Aj）。以抗壞血酸（vitamin C，VC）作為對照[17]，考察紅色素對DPPH自由基的清除率，其計算公式如下：

（3）紅色素抑菌性實(shí)驗(yàn)

選取革蘭氏陰性菌大腸桿菌（E.coli）、革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌（S.aureus）兩種菌作為供試菌株，供試菌在蛋白胨牛肉膏培養(yǎng)基中37℃恒溫培養(yǎng)24 h，菌濃度為108CFU/mL。選取6 mm濾紙片[18]用4 mg/mL的紅色素粗品溶液浸泡24 h，濾干后進(jìn)行平板抑菌實(shí)驗(yàn)。以蒸餾水作為對照，記錄抑菌圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外誘變最佳條件的確定

P.purpurogenumLi-3菌懸液經(jīng)紫外分別照射不同時間后，統(tǒng)計培養(yǎng)皿中菌落數(shù)，計算其致死率。由圖1紫外誘變致死曲線可知，隨著紫外照射時間的增加，菌體致死率逐漸增高，成正相關(guān)關(guān)系。在0～150 s時，菌體致死率急劇上升；在150～275 s時，菌體致死率增長速率減緩。根據(jù)文獻(xiàn)報道[13，19]，一般選取致死率在80%左右作為紫外誘變最佳時間。紫外照射時間為120 s時致死率為79%，因此選取120 s為紫外誘變的最佳照射時間。

圖1 菌株紫外誘變致死曲線Fig.1 Lethal curves of strains by ultraviolet mutagenesis

2.2 氯化鋰質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定

圖2 菌株氯化鋰誘變致死曲線Fig.2 Lethal curves of strains by LiCl mutagenesis

P.purpurogenumLi-3菌懸液經(jīng)最佳紫外照射時間處理后，于不同含量氯化鋰的PDA培養(yǎng)基中涂布后避光培養(yǎng)4d，統(tǒng)計培養(yǎng)皿中菌落數(shù)。得到氯化鋰誘變致死率曲線。如圖2所示，隨著氯化鋰質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，致死率逐漸增加。當(dāng)氯化鋰質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%時，致死率為98%。當(dāng)氯化鋰質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.28%時對P.purpurogenumLi-3菌懸液的致死率在80%左右。

2.3 復(fù)合誘變篩選P.purpurogenumLi-3高產(chǎn)菌

P.purpurogenumLi-3菌懸液經(jīng)紫外線照射120 s后涂布于含0.28%氯化鋰的PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行復(fù)合誘變，培養(yǎng)4 d結(jié)束。挑選20株顏色較深、生長較快的單菌落，按上述1.3.5方法進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，結(jié)果如圖3所示。經(jīng)過復(fù)合誘變后，篩選到的P.purpurogenumLi-3突變株在生長速度、色素產(chǎn)量方面都存在一定差異，其中一部分產(chǎn)生負(fù)變異。通過紫外照射、氯化鋰復(fù)合誘變后，20個突變株中發(fā)酵液色價明顯高于出發(fā)菌株的有：P5、P8、P9，其中菌株P(guān)9的發(fā)酵液色價值最高，達(dá)到了3.09 U/mL。經(jīng)最佳紫外照射時間和最佳氯化鋰濃度復(fù)合誘變后，色素產(chǎn)量比出發(fā)菌株提高了72%。因此，通過對P.purpurogenumLi-3進(jìn)行誘變選育后，突變株P(guān)9效果較好，被命名為P.purpurogenumLi-3-9。

圖3 復(fù)合誘變突變株產(chǎn)色素比較Fig.3 Comparison of pigments produced by compound mutagenese mutant strains

2.4 穩(wěn)定性檢測

由表1可知，在5次傳代中，P.purpurogenumLi-3-9液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅色素最高色價達(dá)到了3.28 U/mL，與文獻(xiàn)中其他青霉屬液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅色素水平相比相對較高[12，20]。表明經(jīng)過復(fù)合誘變后得到的產(chǎn)紫青霉菌突變株P(guān).purpurogenum Li-3-9產(chǎn)紅色素的遺傳穩(wěn)定性較好，有望作為工業(yè)生產(chǎn)菌株來發(fā)酵生產(chǎn)紫霉菌紅色素。

表1 突變株P(guān).purpurogenumLi-3-9遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of genetic stability experiments of mutant strain P.purpurogenumLi-3-9

2.5 出發(fā)菌株與突變株P(guān).purpurogenumLi-3-9的比較

把產(chǎn)紫青霉出發(fā)菌株P(guān).purpurogenumLi-3和經(jīng)復(fù)合誘變突變株P(guān).purpurogenumLi-3-9分別接種到PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)4 d結(jié)束后，其菌落形態(tài)如圖4所示。由圖4可知，突變株菌落直徑比出發(fā)菌株要大，菌落底部顏色明顯高于出發(fā)菌株，并且隨著培養(yǎng)時間的延長，紅色素產(chǎn)量越來越大。

圖4 出發(fā)菌株(a)與突變株(b)菌落形態(tài)比較Fig.4 Comparison of colony morphology of original strain(a)and mutant strain(b)

將P.purpurogenumLi-3和P.purpurogenumLi-3-9發(fā)酵液分別稀釋相同倍數(shù)，使用分光光度計進(jìn)行紫外-可見光譜吸收峰的掃描，結(jié)果見圖5。由圖5可知，在波長500 nm處誘變株的吸光度值大于出發(fā)菌株，表明誘變后紅色素產(chǎn)量明顯增加。

圖5 出發(fā)菌株(a)與突變株(b)色素產(chǎn)量比較Fig.5 Comparison of pigment yield of original strain(a)and mutant strain(b)

2.6 P.purpurogenumLi-3-9紅色素生物活性研究

2.6.1 抗氧化實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)通過清除DPPH自由基法來考察紅色素的抗氧化性。由圖6可知，紅色素溶液中DPPH自由基清除能力隨著色素質(zhì)量濃度的增大而增大，說明P.purpurogenumLi-3-9紅色素具有給電子的能力，即DPPH自由基清除的能力。樣品中含有的抗氧化物質(zhì)能終止自由基鏈之間相互反應(yīng)，最終形成穩(wěn)定的化合物，從而防止細(xì)胞受到自由基和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的損害。結(jié)果表明，P.purpurogenumLi-3-9紅色素的半抑制濃度（halfmaximalinhibitoryconcentration，IC50）為1.83 mg/mL，并且P.purpurogenumLi-3-9紅色素質(zhì)量濃度為4.0mg/mL時，DPPH自由基清除能力達(dá)（92.50±2.58）%。在紅色素質(zhì)量濃度為4.0 mg/mL時，紅色素溶液對DPPH自由基的清除能力與VC基本一致。屈炯等[21]測定了從紅曲中分離得到的13個色素組分的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)其中紅色色素組份和橙色色素組份具有較高的抗氧化活性。

圖6 P.purpurogenumLi-3-9產(chǎn)紅色素對DPPH自由基清除能力Fig.6 Scavenging ability of red pigment produced by P.purpurogenumLi-3-9 on DPPH free radical

2.6.2 抑菌實(shí)驗(yàn)

采用濾紙片擴(kuò)散法測試了P.purpurogenumLi-3-9紅色素質(zhì)量濃度為4 mg/mL時對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的體外抑菌作用，結(jié)果見圖7。由圖7可知，P.purpurogenum Li-3-9紅色素對金黃色葡萄球菌具有一定程度的抑制作用（抑菌圈達(dá)到10 mm），對大腸桿菌抑制作用較弱（無明顯抑菌圈）。MUKHERJEE G等[22]從紫紅曲霉發(fā)酵液中分離純化出一種新的色素，經(jīng)過結(jié)構(gòu)鑒定發(fā)現(xiàn)，它的波譜數(shù)據(jù)與紅曲色素中紅斑胺和紅曲紅胺的波譜數(shù)據(jù)很吻合，抑菌實(shí)驗(yàn)表明，該色素對革蘭氏陽性菌有較強(qiáng)的抑菌性。P.purpurogenumLi-3-9紅色素抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其相符。產(chǎn)紫青霉紅色素對不同菌種的抑菌現(xiàn)象的不同，與革蘭氏陰（陽）性菌細(xì)胞壁中脂多糖的結(jié)構(gòu)、電荷密度及細(xì)胞質(zhì)脂質(zhì)成分的不同有關(guān)[23-24]，同時，P.purpurogenumLi-3-9紅色素對微生物生長的抑制作用還取決于色素與細(xì)胞表面之間可能有特異性反應(yīng)發(fā)生，從而破壞細(xì)菌的細(xì)胞壁達(dá)到抑菌目的[25]。

圖7 P.purpurogenumLi-3-9紅色素對大腸桿菌(a)和金黃色葡萄球菌(b)的抑菌效果Fig.7 Inhibition effect of red pigment produced byP.purpurogenum Li-3-9 onS.aureus(a)andE.coli(b)

3 結(jié)論

通過對P.purpurogenumLi-3進(jìn)行紫外-氯化鋰復(fù)合誘變，在紫外照射時間為120 s，氯化鋰添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.28%條件下處理P.purpurogenumLi-3，經(jīng)篩選得到一株高產(chǎn)紅色素突變株P(guān).purpurogenumLi-3-9，其紅色素最高色價達(dá)到了3.28 U/mL；經(jīng)傳代培養(yǎng)該菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性。產(chǎn)紫青霉菌紅色素生物活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該紅色素具有一定的DPPH自由基清除能力和抑制金黃色葡萄球菌的能力。因此，該色素在新型抗氧化藥物和抑菌劑的開發(fā)方面表現(xiàn)出潛在的應(yīng)用前景。

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Screening of high red pigment-producingPenicillium purpurogenumLi-3 by compound mutagenese and its biological activity

NIU Yujing1,CAO Hong2,HUANG Xiaolin3,TONG Junmao1*,SUI Jiahui2,YANG Yuxin2
(1.College of Food Science,Shihezi University,Shihezi 832003,China;2.College of Biology,and Chemical Engineering, Jiaxing University,Jiaxing 314001,China;3.Institute of Physical Chemistry,Zhejiang Normal University,Jinhua 321004,China)

UsingPenicillium purpurogenumLi-3 as original strain,the strain with high red pigment-producing ability was screened by ultraviolet(UV)-LiCl compound mutagenesis,and the biological activities of red pigment were researched and evaluated by 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH) system.The inhibitory effects of red pigment produced by mutant strain onStaphylococcus aureusandEscherichia coliwere studied by filter paper diffusion method.The results showed that optimal UV radiation time was 120 s and the optimal concentration of LiCl was 0.28%,theP.purpurogenumLi-3-9 with high red pigment-producing was obtained,inoculated into liquid fermentation medium and cultured at 32℃,150 r/min for 168 h. The color value of red pigment reached the maximum value 3.28 U/ml,which was 83%higher than that of the original strain.After subculture of 5 successive generations,the strain had good genetic stability.The red pigment produced byP.purpurogenumLi-3-9 had better DPPH free radical scavenging capacity and inhibiting ability onS.aureus.

Penicillium purpurogenum;compound mutagenesis;red pigment;biological activity

Q815

0254-5071（2017）03-0030-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.03.007

2017-01-10

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（21266029）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LY17B060011）

牛玉靜（1990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及果蔬貯藏。

*通訊作者：童軍茂（1963-），男，教授，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及果蔬貯藏。