呂亞豐 楊建林 秦宇 王艷林

（三峽大學醫(yī)學院 腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點實驗室，宜昌 443002）

人抗酶抑制因子-1的原核表達純化及多克隆抗體的制備

呂亞豐 楊建林 秦宇 王艷林

（三峽大學醫(yī)學院 腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點實驗室，宜昌 443002）

原核表達純化人抗酶抑制因子-1（（antizyme inhibition factor-1，AZIN1），制備并鑒定抗AZIN1多克隆抗體。pET-28a/AZIN1表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）后，IPTG誘導蛋白表達，利用Ni-NTA 樹脂于變性條件下親和層析純化人AZIN1蛋白。將重組AZIN1蛋白用作抗原免疫BALB/c小鼠以制備多克隆抗體，ELISA檢測抗AZIN1抗體效價，Western bloting、細胞免疫熒光、細胞免疫化學方法檢測抗體的應用。結(jié)果顯示，重組pET-28a/AZIN1表達質(zhì)粒經(jīng)酶切及測序鑒定構(gòu)建正確。細菌內(nèi)重組AZIN1蛋白可被IPTG誘導表達并以包涵體的形式存在。用親和層析法能有效純化原核表達的AZIN1蛋白，該蛋白在小鼠體內(nèi)能夠誘導抗AZIN1特異性抗體產(chǎn)生，血清效價達到1∶640 000。制備抗體能夠特異性識別和結(jié)合人及小鼠瘤細胞中表達的AZIN1蛋白，并可有效用于AZIN1的Western blotting、細胞免疫熒光和細胞免疫化學分析。成功原核表達和純化了人AZIN1蛋白并制備了抗AZIN1多克隆抗體，為深入研究AZIN1在調(diào)控細胞增殖及在疾病防治中的作用提供了研究基礎。

抗酶抑制因子；原核表達；抗體

多胺（腐胺、精脒和精胺）是一類帶正電荷的烷基類小分子化合物，廣泛存在于真核細胞并參與細胞的增值、分化及凋亡等重要的生理過程，其在細胞內(nèi)的合成、分解及攝取受到嚴密的調(diào)控以維持體內(nèi)的多胺代謝穩(wěn)衡［1，2］?？姑敢种埔蜃?1（antizyme inhibition factor-1，AZIN1）是細胞內(nèi)參與多胺代謝調(diào)節(jié)的重要蛋白因子，它通過與鳥氨酸脫羧酶抗酶（Ornithine decarboxylase antizyme，OAZ）結(jié)合而解除后者對多胺合成途徑限速酶鳥氨酸脫羧酶（ornithine decarboxylase，ODC）的抑制作用，從而上調(diào)細胞內(nèi)的多胺合成速度［3，4］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，除參與調(diào)控多胺代謝外，AZIN1還可以通過干擾中心體的復制以及直接與細胞周期相關蛋白相互作用而影響細胞的分裂和增殖［5，6］，AZIN1表達異常也被發(fā)現(xiàn)與細胞增殖異常性疾病，如腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關［7］。鑒于AZIN1在維持多種正常生理功能中的重要性和與疾病發(fā)生的密切相關性，本研究旨在建立人AZIN1蛋白原核表達純化的實驗技術，并用原核表達的AZIN1蛋白為抗原制備抗AZIN1多克隆抗體，以期為進一步研究AZIN1在調(diào)控細胞增殖及在疾病防治中的作用奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

pET-28a/AZIN1表達質(zhì)粒、大腸桿菌菌株DH5α和BL21（DE3）由作者實驗室保存，限制性核酸內(nèi)切酶購自美國 Fermentas 公司，兔抗His多克隆抗體為美國Proteintech公司產(chǎn)品；HRP標記的羊抗兔IgG 由北京中杉金橋生物技術有限公司提供；Cy3標記的羊抗鼠IgG購自武漢博士德生物工程有限公司，ECL顯色液為美國 Thermo Scientific公司產(chǎn)品；Ni-NTA 樹脂為德國 Novagen 公司產(chǎn)品；弗氏不完全佐劑和弗式完全佐劑為購自美國 Sigma-aldrich 公司，其它化學試劑由美國Sigma等公司提供，DNA測序由上海生工公司完成。

1.2 方法

1.2.1 pET-28a/AZIN1質(zhì)粒鑒定 pET-28a/AZIN1表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，在含有卡拉霉素的瓊脂平板內(nèi)篩選后，挑取單克隆菌落，接種到含有卡拉霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后，用限制性酶切及DNA測序鑒定。

1.2.2 人AZIN1蛋白原核表達 將測序正確的重組pET-28a/AZIN1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株BL21（DE3）中，在含有卡拉霉素的瓊脂平板篩選陽性克隆，挑取陽性克隆接種到3 mL含有卡拉霉素的LB液體培養(yǎng)基中，待菌液OD值達到0.6-0.8時，加入IPTG（終濃度為0.5 mmol/L）于37℃振蕩培養(yǎng)，分別在IPTG誘導0 h、2 h、4 h、6 h和8 h后取樣，700×g離心5 min，收集菌體并重懸于PBS 中（NaCl 137 mmol/L，KH2PO42 mmol/L，Na2HPO410 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L），超聲裂解細菌后，11 000×g離心，分別取上清和沉淀制樣，經(jīng)SDS-PAGE分析AZIN1融合蛋白的表達情況，由此確定最佳外源蛋白誘導表達條件。

1.2.3 人AZIN1蛋白的純化及復性 將成功轉(zhuǎn)化pET-28a/AZIN1的BL21（DE3）陽性單克隆菌放大培養(yǎng)（1 000 mL培養(yǎng)液）。待菌液OD值達到0.6-0.8時，IPTG（終濃度為0.5 mmol/L）誘導表達6 h后，700×g離心10 min收集菌體，經(jīng)高濃度尿素（8 mol/L 尿素，0.1 mol/L Na2HPO4，0.01 mol/L Tris-HCl，pH 8.0）裂解細菌，37℃振蕩裂解1 h，離心30 min去不溶性碎片。上清與Ni-NTA樹脂雜交2 h后上柱，用洗脫液A（8 mol/L 尿素，100 mmol/L Na2HPO4，10 mmol/L Tris，pH6.3）洗脫雜蛋白，再用洗脫液B（8 mol/L 尿素，100 mmol/L Na2HPO4，10 mmol/L Tris，pH4.3）洗脫目的蛋白。純化后的蛋白用遞減尿素濃度的PBS緩沖液（pH7.4）透析復性，每12 h換1次透析液，透析后的蛋白于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 多克隆抗體制備 純化后的AZIN1蛋白用作抗原免疫Balb/c小鼠，首次免疫取100 g抗原與弗氏完全佐劑等體積乳化，背部皮下多點注射。兩周后做3次加強免疫，每次間隔時間兩周，加強免疫采用50 g AZIN1蛋白與弗氏不完全佐劑等體積乳化，背部皮下多點注射。末次免疫后1周摘小鼠眼球取血，37℃靜置1 h后，4℃，12 000 r/min離心收集血清，加入等體積甘油后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 制備的抗血清抗體效價檢測 間接ELISA法被用于檢測本研究制備的抗血清中AZIN1多克隆抗體效價。純化的人AZIN1蛋白用包被緩沖液稀釋至終濃度為10 g/mL后，加入96孔酶標板，每孔100μL，4℃包被16 h，1%的BSA于37℃封閉2 h，然后加入系列稀釋的血清，100 μL/孔，以未免疫小鼠血清為陰性對照，PBS為空白對照，37℃孵育1 h；再加入HRP標記的羊抗兔IgG（1∶5 000 稀釋），100 μL/孔，37℃孵育1 h；TMB法顯色，2 mol/L硫酸終止反應后，酶標儀檢測各孔A450值。以空白對照調(diào)零，待測孔A450值與陰性對照孔A450值的比值≥2. 1即判為陽性，以能獲得陽性的最大稀釋度作為待檢血清的抗體效價。

1.2.6 Western blot法鑒定制備的AZIN1抗體 以本實驗制備的抗血清為一抗，Western blot法檢測人A549肺癌細胞、人Hela宮頸癌細胞以及小鼠B16-F1黑色素瘤細胞中AZIN1蛋白的表達。收集培養(yǎng)細胞，加全細胞裂解液冰上裂解細胞30 min，4℃12 000 r/min離心10 min后收集上清（細胞總蛋白）制樣，蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后以200 mA恒流電轉(zhuǎn)移到PVDF膜，膜采用含5%脫脂牛奶的TBST室溫封閉2 h。用本實驗制備的多克隆抗體為一抗（1∶3 000稀釋）4℃孵育過夜，羊抗鼠IgG為二抗室溫孵育1 h后TBST漂洗，ECL法顯色并記錄結(jié)果。

1.2.7 細胞免疫熒光法鑒定制備的AZIN1抗體B16-F1細胞置玻片培養(yǎng)，PBS洗滌3次，4%甲醛4℃固定細胞15 min，0.5%的TritonX-100室溫通透20 min，PBS洗滌玻片3次后，正常山羊血清室溫封閉30 min，每張玻片滴加本實驗制備的抗血清（1∶200稀釋）后放入濕盒，4℃孵育過夜，PBS洗滌玻片后滴加熒光二抗（1∶200稀釋），濕盒中室溫避光孵育1 h，洗滌未結(jié)合的二抗后，滴加DAPI避光孵育10-15 min（復染細胞核），PBS洗去多余的DAPI，用含有抗熒光淬滅劑的封片劑封片，熒光顯微鏡觀測結(jié)果。

1.2.8 細胞免疫化學鑒定抗AZIN1抗體 實驗步驟與前述細胞免疫熒光法類似，不同之處為，一抗孵育過夜后，每張玻片滴加辣根過氧化物酶標記的小鼠IgG二抗（1∶200稀釋），37℃孵育30 min，PBS洗滌玻片3次，每次5 min。DAB顯色1-2 min后自來水清洗，吸干玻片上的水分后加蘇木精染色2 min，自來水沖洗，吸干玻片水分后樹脂封片，顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 原核表達質(zhì)粒鑒定

pET-28a/AZIN1質(zhì)粒經(jīng)Xho I+Nde I酶切后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，可見1 350 bp和5 400 bp兩個限制性片段（圖1），結(jié)果與預期一致。酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒經(jīng)DNA測序，證實質(zhì)粒中插入序列正確，閱讀框架對接無誤。

圖1 pET-28a/AZIN1質(zhì)粒的酶切鑒定

2.2 人AZIN1蛋白的原核表達和純化

將重組pET-28a/AZIN1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）中，IPTG（終濃度為0.5 mmol/L）誘導0-6 h，在不同的時間點取樣，經(jīng)12%的SDS-PAGE分析，結(jié)果（圖2）顯示IPTG誘導后，在相對分子質(zhì)量50 kD附近有一新蛋白產(chǎn)生，與預期重組蛋白AZIN1的相對分子質(zhì)量一致，誘導4 h時重組蛋白的表達量最高。超聲裂解誘導后的細菌，上清、沉淀分別制樣，經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果（圖3）顯示AZIN1蛋白主要存在于超聲后沉淀中，提示表達的重組蛋白主要以包涵體的形式存在。由于誘導表達的AZIN1蛋白帶有6× His標簽，實驗采用Ni-NTA親和層析法對表達菌中的AZIN1蛋白進行純化。純化后的蛋白經(jīng)透析復性后，用SDS-PAGE和Western blotting（抗His標簽抗體作為一抗）對其進行純度和特異性鑒定。結(jié)果（圖4）顯示，大腸桿菌中誘導表達的AZIN1能被Ni-NTA高效純化。

2.3 抗AZIN1多克隆抗體鑒定

2.3.1 血清效價檢測 將純化的AZIN1蛋白用作抗原包被酶標板，免疫血清等比稀釋后作為一抗，ELISA法檢測制備抗血清的效價，結(jié)果（圖5）顯示血清抗體效價可達到1∶640 000。

圖2 SDS-PAGE分析AZIN1蛋白的誘導表達

圖3 SDS-PAGE分析誘導表達的AZIN1蛋白在細菌內(nèi)的溶解性

圖4 SDS-PAGE分析人AZIN1蛋白的純化

圖5 ELISA分析制備抗血清的效價

2.3.2 制備抗體用于AZIN1的Western bloting檢測

以人宮頸癌HeLa細胞、小鼠黑素瘤B16-F1細胞、L929小鼠成纖維細胞裂解物及原核表達的人AZIN1蛋白為抗原，以制備的多克隆抗體為一抗，Western blotting檢測樣品中的AZIN1蛋白，結(jié)果（圖6）表明，制備的多克隆抗體能有效識別和結(jié)合人和小鼠的的AZIN1蛋白，可用于細胞內(nèi)源性和原核表達AZIN1蛋白的Western blot檢測。

圖6 制備抗體用于AZIN1的Western bloting檢測

2.3.3 制備抗體用于AZIN1的細胞免疫熒光分析 B16-F1黑色素瘤細胞置玻片培養(yǎng)后，以制備的多克隆抗體為一抗，以Cy3標記的羊抗鼠IgG為二抗，免疫熒光法檢測B16-F1細胞內(nèi)AZIN1蛋白的表達。結(jié)果（圖7）顯示，制備抗體能有效用于AZIN1的細胞免疫熒光分析。

2.3.4 制備抗體用于AZIN1的細胞免疫化學分析 B16-F1黑色素瘤細胞置玻片培養(yǎng)后，以制備的多克隆抗體為一抗，陰性小鼠血清為對照，HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗，免疫細胞化學法檢測B16-F1細胞內(nèi)AZIN1蛋白的表達。結(jié)果（圖8）顯示，制備抗體能有效用于AZIN1的細胞免疫化學分析。

3 討論

天然多胺為所有活細胞的必需組分，參與多種重要的生理功能。研究表明，耗竭多胺將引起細胞生長抑制，而多胺水平異常升高則會導致癌癥發(fā)生［8，9］，因此維持細胞內(nèi)多胺自穩(wěn)對正常細胞生命活動意義重大。AZIN1起初作為細胞內(nèi)調(diào)節(jié)多胺含量的蛋白質(zhì)因子而被廣泛關注［10］，隨后研究發(fā)現(xiàn)，AZIN1除了通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)多胺水平而影響細胞增殖外，還可以通過干擾中心體的復制以及與細胞周期蛋白Cyclin D1相互作用而調(diào)控細胞增殖［5，6］，由此AZIN1有望成為抗腫瘤治療的新靶點。

圖7 制備抗體用于AZIN1的細胞免疫熒光檢測（×400）

圖8 制備抗體用于AZIN1的細胞免疫化學檢測（×400）

為獲得大量可用作抗原免疫小鼠的AZIN1蛋白，我們將構(gòu)建的pET-28a/AZIN1原核表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株BL21（DE3）中。分析發(fā)現(xiàn)，細菌內(nèi)AZIN1重組蛋白能被IPTG誘導性表達，且主要以包涵體的形式存在，這可能與AZIN1重組蛋白誘導性表達的速度過快和細菌內(nèi)濃度過高有關。由于重組AZIN1蛋白的N端帶有6×His標簽，我們在尿素變性的條件下利用Ni-NTA樹脂親和層析法成功獲得高純度的AZIN1蛋白。為制備抗AZIN1多克隆抗體，我們將純化后的AZIN1重組蛋白用做抗原免疫BALB/c小鼠，經(jīng)過1次啟動免疫和3次加強免疫后，獲得高效價的抗AZIN1多克隆抗體。該多克隆抗體能特異性識別和結(jié)合人和小鼠真核細胞中表達的AZIN1蛋白，可有效用于AZIN1的免疫印跡、細胞免疫熒光和免疫細胞化學分析。

4 結(jié)論

本實驗建立了人AZIN1原核表達純化技術，成功制備了抗AZIN1多克隆抗體，上述研究結(jié)果有助于進一步探索AZIN1在調(diào)控細胞增殖中的作用以及作為抗腫瘤藥物分子靶點的潛在價值。

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（責任編輯 狄艷紅）

Prokaryotic Expression，Purification and Polyclonal Antibody Preparation of Human Antizyme Inhibition Factor-1

Lü Ya-feng YANG Jian-lin QIN Yu WANG Yan-lin
（Hubei Key Laboratory of Tumor Microenvironment and Immunotherapy，Three Gorges University Medical College，Yichang 443002）

We aim to carry out prokaryotic expression and purification of human antizyme inhibition factor-1（AZIN1），and to prepare as well as identify polyclonal antibody against AZIN1. Prokaryotic expression vector pET-28a/AZIN1 was transformed into Escherichia coli BL21（DE3），in which the recombinant AZIN1 was expressed by IPTG induction and purified by affinity chromatography with Ni-NTA resin under denaturing condition. The purified recombinant AZIN1 was used as the antigen to prepare the antibody in the BALB/c mice. The titer and specificity of anti-sera were detected by ELISA，Western blot，cell immunofluorescence，and immunochemistry. As results，restriction analysis and DNA sequencing proved that the plasmid pET-28a/AZIN1 was constructed successfully. In E. coli，recombinant AZIN1 protein was expressed by IPTG induction and mainly existed in a form of inclusion body. The AZIN1 protein expressed in the E. coli was effectively purified using affinity chromatography. When used as the antigen to immune mice，this protein induced the production of specific antibody against AZIN1 with serum titer of 1∶640 000. The prepared antiserum specifically recognized and bound to the AZIN1 protein expressed in human or mouse tumor cells. And this antiserum was efficiently used in the analysis for AZIN1 by Western blot，cell immunofluorescence，and cell immunochemistry. In conclusion，the prokaryotic expression and purification of human AZIN1 protein and preparation of polyclonal antibody against AZIN1 were successfully performed in this study. These results provide a basis for further research on the roles of AZIN1 in regulating cell proliferation and in disease prevention and treatment.

antizyme inhibition factor-1；prokaryotic expression；antibody

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.028

2016-07-19

國家自然科學基金項目（81372265）

呂亞豐，男，碩士研究生，研究方向：腫瘤分子生物學；E-mail：yafenglv@yahoo.com

王艷林，男，博士，研究方向：腫瘤分子生物學；E-mail：fzswangyl@ctgu.edu.cn