殷朝敏 范秀芝 史徳芳 高虹

（1. 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，武漢 430064；2. 國(guó)家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心，武漢 430064）

CRISPR/Cas基因編輯技術(shù)及其在真菌中的應(yīng)用

殷朝敏 范秀芝 史徳芳 高虹

（1. 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，武漢 430064；2. 國(guó)家食用菌加工技術(shù)研發(fā)分中心，武漢 430064）

CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古生菌中抵抗外源病毒或質(zhì)粒入侵的獲得性免疫系統(tǒng)。其中II型CRISPR/Cas系統(tǒng)已被改造成為一個(gè)簡(jiǎn)便、高效的基因編輯工具，并在動(dòng)物、植物和微生物基因功能研究和遺傳改良中得到廣泛應(yīng)用。簡(jiǎn)述了CRISPR/ Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、作用機(jī)理及分類情況，歸納總結(jié)了CRISPR/Cas9系統(tǒng)在釀酒酵母和其他絲狀真菌中的應(yīng)用，并對(duì)該技術(shù)可能出現(xiàn)的問題及應(yīng)用前景進(jìn)行了展望，以期為真菌基因編輯研究提供參考。

真菌；基因組編輯技術(shù)；CRISPR/Cas9；基因功能

真菌是真核生物中一支龐大而種類繁多的物種，目前已知的約10多萬種［1］。自從1996年釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）基因組被測(cè)定以來［2］，越來越多的真菌基因組被解析和公布。截至目前，測(cè)序完成且公開的真菌基因組達(dá)800多個(gè)（NCBI Genome數(shù)據(jù)庫）。測(cè)序獲得了大量功能未知的真菌DNA序列，鑒定這些基因的功能，解析這些序列的生物學(xué)特性己成為后基因組時(shí)代的研究熱點(diǎn)。目前，人們開發(fā)了多種基因功能研究方法，如轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法［3］、T-DNA插入法［4］、RNA干擾［5］、超表達(dá)［6］和microRNA［7］等技術(shù)。這些技術(shù)雖然都能對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，但是不能對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行定點(diǎn)修飾，因而還不能稱為基因編輯技術(shù)［8］。最初，人們主要采用同源重組介導(dǎo)的基因打靶技術(shù)對(duì)模式生物的基因組進(jìn)行編輯，但因篩選標(biāo)記物有限且效率不高，嚴(yán)重限制了該技術(shù)的應(yīng)用［9］。近年來，人們發(fā)明了鋅指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFN）［10］、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALEN）［11］及 CRISPR/Cas（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeat/CRISPR-associated proteins）［12］基因編輯技術(shù)。目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)以其設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、操作方便、精確、效率高等優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用于動(dòng)物、植物和微生物等基因組的定點(diǎn)編輯，正在給功能基因組學(xué)帶來一場(chǎng)革命性的改變。本文綜述了CRISPR/Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、作用機(jī)理、分類情況及其在釀酒酵母和其他絲狀真菌中的應(yīng)用，并對(duì)該技術(shù)可能出現(xiàn)的問題及應(yīng)用前景進(jìn)行了展望，以期為真菌基因編輯研究提供參考。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)

一個(gè)典型的CRISPR/Cas基因座由一個(gè)編碼Cas蛋白的操縱子和一個(gè)CRISPR重復(fù)間隔序列組成，大部分生物體含有1-2個(gè)CRISPR/Cas基因座。典型的CRISPR重復(fù)間隔序列由一系列短的高度保守的正向重復(fù)序列（repeats）和長(zhǎng)度相似的間隔序列（spacers）按一定順序排列組成［13］（圖1）。其中，重復(fù)序列是一類長(zhǎng)度約21-48 bp的具有回文結(jié)構(gòu)或者發(fā)夾樣二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列，按相似性不同被分為12個(gè)簇。間隔序列來源于外源基因片段，長(zhǎng)度一般為26-72 bp，間隔序列與重復(fù)序列依次串聯(lián)排列，可以擁有2-375個(gè)重復(fù)［14］。CRISPR重復(fù)間隔序列5'端連接著一段富含A/T堿基并且包含啟動(dòng)子的前導(dǎo)序列（leader sequence），長(zhǎng)度約20-534 bp［15］。Cas 基因是一類保守的基因家族，主要編碼核酸酶、DNA解旋酶、聚合酶等與切割、修飾核酸相關(guān)的蛋白。一個(gè)CRISPR/Cas基因座通常包含4-20個(gè)不同的Cas 基因，這些基因可以位于CRISPR重復(fù)間隔序列的上游或者下游［15，16］。

圖1 CRISPR基因座［16］

2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用原理

CRISPR/Cas系統(tǒng)作用機(jī)理可以大致分為獲得、表達(dá)和干擾3個(gè)步驟［17］（圖2）。（1）CRISPR間隔序列的獲得（spacer acquisition）：當(dāng)外源噬菌體或質(zhì)粒等的遺傳物質(zhì)進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞后，Cas1和Cas2蛋白及其復(fù)合體對(duì)外源DNA序列中的PAM（protospacer adjacent motif）序列進(jìn)行識(shí)別。然后特定的Cas蛋白將PAM序列旁的原型間隔序列（proto-spacer）加工成為間隔序列并整合插入到前導(dǎo)序列與間隔重復(fù)序列之間［18］。因此，CRISPR 基因座中的間隔序列從5'-3'的排列也記錄了外源遺傳物質(zhì)入侵的時(shí)間順序。此外，PAM序列長(zhǎng)2-5 bp，一般與proto-spacer 相隔 1-4 bp，被認(rèn)為是CRISPR系統(tǒng)對(duì)自身序列和外源序列正確識(shí)別的關(guān)鍵機(jī)制［19］。（2）CRISPR位點(diǎn)的表達(dá)：CRISPR重復(fù)間隔序列被轉(zhuǎn)錄為pre-crRNA后，特異的核酸內(nèi)切酶對(duì)pre-crRNA進(jìn)行切割，形成小的crRNAs（由一個(gè)間隔序列與部分重復(fù)序列組成），也被稱為guide RNAs［18］。研究發(fā)現(xiàn)，在沒有受到外界壓力時(shí)，CRISPR基因座表達(dá)水平較低；當(dāng)外源的質(zhì)?；蚴删w入侵宿主菌時(shí)，CRISPR的表達(dá)很快被誘導(dǎo)上調(diào)［20］。（3）CRISPR/Cas系統(tǒng)對(duì)外源遺傳物質(zhì)的識(shí)別與降解，即免疫干擾：當(dāng)宿主細(xì)胞再次受到相同的外源DNA入侵時(shí)，crRNAs和Cas蛋白等形成的復(fù)合物體會(huì)在靶序列上尋找PAM序列，隨后crRNAs通過堿基配對(duì)識(shí)別靶序列上相應(yīng)的互補(bǔ)序列，外源DNA在配對(duì)的特定位置被具有核酸酶活性的Cas蛋白切割［21］。DNA損傷會(huì)觸發(fā)細(xì)胞自身的DNA修復(fù)機(jī)制，同源定向修復(fù)（homology-directed repair，HDR）以外源供體DNA（donor DNA）為模板，修復(fù)后會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)基因的失活或外源片段的插入［22］；非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ），無需修復(fù)模板，可能出錯(cuò)）修復(fù)會(huì)在雙鏈斷裂（double-stranded break，DSB）位置隨機(jī)插入或刪除部分堿基對(duì)，導(dǎo)致目標(biāo)基因移碼突變或關(guān)鍵區(qū)域被破壞［23］。

3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類

根據(jù)所含特征基因（signature genes）及作用機(jī)制的不同，CRISPR/Cas系統(tǒng)可分為Typle I、Typle II和Typle III 3個(gè)大的類型，每一類型又分為許多亞型［24］（圖3）。隨著研究的深入，人們還發(fā)現(xiàn)了其他類型的CRISPR/Cas系統(tǒng)，但是其具體作用機(jī)制尚不清楚［24，25］。I型CRISPR/Cas系統(tǒng)的特征基因是Cas3基因，該基因編碼的蛋白質(zhì)具有核酸酶和DNA解旋酶活性［26］。當(dāng)CRISPR重復(fù)間隔序列被轉(zhuǎn)錄為pre-crRNA后，具有核酸內(nèi)切酶活性的Cas6蛋白在間隔序列上游8 bp位置對(duì)重復(fù)序列進(jìn)行切割，形成兩頭是部分重復(fù)序列、中間是間隔序列的crRNAs，隨后crRNAs和其他Cas蛋白形成防御復(fù)合體Cascade（CRISPR-associated complex for antiviral defense）。Cascade中crRNAs識(shí) 別 外 源DNA后，召集Cas3蛋白對(duì)靶序列進(jìn)行切割降解［27］。II型CRISPR/Cas系統(tǒng)的特征基因是Cas9基因，編碼的蛋白具有核酸內(nèi)切酶活性并且受RNA的引導(dǎo)［28］。在表達(dá)階段，CRISPR/Cas基因座上游的轉(zhuǎn)錄活化RNA（Trans-activating crRNA，tracrRNA）與Cas9結(jié)合形成復(fù)合體，該復(fù)合體通過tracrRNA與pre-crRNA中重復(fù)序列互補(bǔ)配對(duì)緊密結(jié)合，隨后RNase III將含有crRNA的復(fù)合體切下。由tracrRNA、crRNA和Cas9蛋白組成的復(fù)合體識(shí)別外源DNA并對(duì)其切割降解［28，29］。III型CRISPR/Cas系統(tǒng)比較復(fù)雜，該系統(tǒng)由特征基因Cas10以及重復(fù)相關(guān)可疑蛋白（repeatassociated mysterious protein，RAMP）Csm/Cmr組成［30］。與I型CRISPR/Cas系統(tǒng)類似，pre-crRNA首先被Cas6蛋白切割成小的crRNAs，隨后Csm/Cmr-Cas10蛋白復(fù)合體與crRNAs結(jié)合并切除crRNAs 3’末端的重復(fù)序列形成成熟crRNAs。隨后該復(fù)合體對(duì)外源DNA及其轉(zhuǎn)錄的RNA進(jìn)行識(shí)別切割［31］。

圖2 CRISPR/Cas系統(tǒng)作用機(jī)理［17］

圖3 不同類型的CRISPR/Cas系統(tǒng)［24］

4 CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在真菌中的應(yīng)用

作為一種功能強(qiáng)大的基因組編輯工具，CRISPR/ Cas9基因編輯系統(tǒng)已成功應(yīng)用于人類細(xì)胞、線蟲、斑馬魚、果蠅、水稻、擬南芥等模式生物［32］。2013年，DiCarlo等［33］首次將CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)應(yīng)用于真菌釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），成功敲除了細(xì)胞膜精氨酸透性酶CAN1基因，目前該系統(tǒng)已廣泛應(yīng)用于多種真菌基因功能研究。

4.1 在酵母菌中的應(yīng)用

釀酒酵母是代謝工程研究最受關(guān)注的模式種，也是功能基因組學(xué)、蛋白質(zhì)相互作用、細(xì)胞周期、細(xì)胞衰老凋亡等研究的優(yōu)選模式生物［34］。近年來，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的誕生為酵母基因功能、代謝調(diào)控等研究提供了簡(jiǎn)單、快速和高效的方法。

DiCarlo等［33］首先將CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)引入釀酒酵母，隨后人們針對(duì)酵母菌自身特點(diǎn)，在載體構(gòu)建、篩選程序等方面進(jìn)行了大量改進(jìn)，如Laughery 等［35］利用Bcl I 和Swa I 限制性內(nèi)切酶特性，使得20 bp crRNA插入sgRNA表達(dá)盒變得簡(jiǎn)單高效；Zhang等［36］首先將Cas9基因?qū)虢湍妇蚪M獲得Cas9蛋白表達(dá)工程菌，然后構(gòu)建含有sgRNA載體和供體DNA轉(zhuǎn)化上述工程菌，降低了載體構(gòu)建的難度；Jako?iūnas等［37］在此基礎(chǔ)上利用USER克隆技術(shù)，將多個(gè)sgRNA串聯(lián)，一次性敲除了多個(gè)基因，大大提高了敲除效率；Tsarmpopoulos等［38］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因敲除時(shí)，設(shè)計(jì)了90 bp的供體DNA，該DNA與靶標(biāo)基因上下游同源，轉(zhuǎn)化后直接利用PCR篩選轉(zhuǎn)化子，簡(jiǎn)化了篩選程序；Bao等［39］將供體DNA（100 bp）與20 bp crRNA嵌合連接片段、tracrRNA 與Cas9基因分別進(jìn)行表達(dá)，有效避免了脫靶的問題；2016年，Smith等［40］利用dCas9蛋白特性，設(shè)計(jì)了一種誘導(dǎo)型單鏈CRISPR干涉（CRISPRi）系統(tǒng)，大大擴(kuò)展了CRISPR系統(tǒng)在酵母中的應(yīng)用。

除了基因敲除，利用供體DNA與目標(biāo)基因的同源性，CRISPR/Cas9系統(tǒng)還能介導(dǎo)基因插入。Ryan等［41］將Sp Cas9基因和自我裂解型肝炎病毒（HDV）核酸酶與sgRNA嵌合片段克隆至pCAS質(zhì)粒骨架中，構(gòu)建了多重CRISPR系統(tǒng)（Multiplex CRISPR，CRISPRm），利用CRISPRm系統(tǒng)將粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）纖維糊精轉(zhuǎn)運(yùn)子（cdt-1）和胞內(nèi)β-葡糖苷酶基因（gh1-1）分別插入酵母菌ura3和lyp1基因位點(diǎn)，通過CRISPRm系統(tǒng)對(duì)cdt-1和gh1-1基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，使得酵母菌利用纖維二糖的能力提高了10倍。Ronda等［42］將含有3個(gè)sgRNA串聯(lián)的載體和3個(gè)分別含有β-胡蘿卜素合成基因BTS1、crtYB、crtI的供體DNA一起轉(zhuǎn)化已經(jīng)獲得Cas9基因插入的酵母工程菌，使得酵母工程菌具有合成β-胡蘿卜素能力。類似的，Tsai等［43］利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)將畢赤酵母（Scheffersomyces stipitis）木糖還原酶（XYL1）、木糖醇脫氫酶（XYL2）和木酮糖激酶（XYL3）基因分別插入酵母PHO13和ALD6基因位點(diǎn)，獲得了具有分解木糖能力的酵母工程菌；Mans等［44］利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)構(gòu)建了具有糞腸球菌（Enterococcus faecalis）丙酮酸脫氫酶復(fù)合體合成能力的酵母工程菌。此外，Horwitz等［45］和Shi等［46］分別利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)構(gòu)建酵母工程菌時(shí)均實(shí)現(xiàn)了大片段的插入，插入的片段達(dá)到24 kb。更令人驚奇的是，EauClaire及其團(tuán)隊(duì)［47］利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在酵母菌細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建了一條β-胡蘿卜素生物合成途徑，該生物合成途徑包含的關(guān)鍵基因多達(dá)17個(gè)。除了模式種釀酒酵母，目前CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)也應(yīng)用到其他酵母菌，如布拉酵母（Saccharomyces boulardii）［48］、裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）［49］、致病菌白色假絲酵母（Candida albicans）［50］等的研究。

4.2 在絲狀真菌中的應(yīng)用

絲狀真菌廣泛分布于自然界，與人類的生產(chǎn)、生活密切相關(guān)。目前，許多絲狀真菌基因組已經(jīng)測(cè)序完畢，對(duì)絲狀真菌的研究已步入后基因組時(shí)代。2015年，Liu及其團(tuán)隊(duì)［51］首先將CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)應(yīng)用于里氏木霉（Trichoderma reesei）的研究。該團(tuán)隊(duì)首先構(gòu)建了優(yōu)化密碼子的Cas9蛋白表達(dá)載體，利用根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）AGL-1介導(dǎo)轉(zhuǎn)化里氏木霉菌絲體，形成里氏木霉Cas9表達(dá)平臺(tái)（Cas9-expressing chassis）。然后構(gòu)建sgRNA載體，對(duì)乳酸核糖轉(zhuǎn)移酶ura5基因進(jìn)行了敲除，敲除率幾乎達(dá)到100%。但是同時(shí)對(duì)甲基轉(zhuǎn)移酶lae1基因、葡萄糖信號(hào)相關(guān)基因vib1和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子clr2進(jìn)行敲除時(shí)，敲除率只有4.2%。此外，該團(tuán)隊(duì)還構(gòu)建了具有同源臂的供體DNA，將斜臥青霉菌（Penicillium decumbens）乳酸核糖轉(zhuǎn)移酶poura5基因插入到自身甲基轉(zhuǎn)移酶lae1基因位點(diǎn)，并且發(fā)現(xiàn)同源臂≥600 bp，重組率幾乎達(dá)到100%；同源臂長(zhǎng)200 bp時(shí)重組率也可以達(dá)到93%。

隨后，Matsu-ura等［52］在研究粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）時(shí)，構(gòu)建了以構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）tripC啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cas9蛋白基因、釀酒酵母SNR52啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)sgRNA的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，成功將β-tubulin 啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子clr-2融合片段、糖原合酶1啟動(dòng)子與熒光素酶基因融合片段分別插入粗糙脈孢菌clr-2和clr-1基因位點(diǎn)，結(jié)果表明強(qiáng)啟動(dòng)子的插入使得clr-2基因表達(dá)量提高了200倍；而熒光素酶基因的插入使得粗糙脈孢菌轉(zhuǎn)化子的篩選更簡(jiǎn)單。與此同時(shí)N?dvig團(tuán)隊(duì)［53］也將其利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)絲狀真菌進(jìn)行基因編輯的研究結(jié)果發(fā)表在PLoS One雜志上。該團(tuán)隊(duì)采用單質(zhì)粒構(gòu)建策略將sgRNA和Cas9蛋白基因置于一個(gè)表達(dá)質(zhì)粒上，其中sgRNA由構(gòu)巢曲霉gpdA啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，Cas9基因由構(gòu)巢曲霉tef1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。利用該載體成功敲除了構(gòu)巢曲霉yA基因、棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）albA和pyrG基因、黑曲霉（Aspergillus niger）、炭黑曲霉（Aspergillus carbonarius）、泡盛曲霉（Aspergillus luchuensis）及巴西曲霉（Aspergillus brasiliensis）albA基因。該研究結(jié)果表明啟動(dòng)子對(duì)sgRNA和Cas9蛋白表達(dá)影響較大，為提高基因編輯效率最好選用同源強(qiáng)啟動(dòng)子。

類似的，Katayama等［54］以pUNA質(zhì)粒為骨架，采用單質(zhì)粒構(gòu)建策略成功構(gòu)建了CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，其中amyB 啟動(dòng)子與Cas9基因連接，U6啟動(dòng)子與sgRNA連接。利用該系統(tǒng)成功敲除了米曲霉（Aspergillus oryzae）wA，yA，和pryG基因，但是敲除率不高，只有10%-20%。Fuller等［55］和Zhang等［56］兩個(gè)團(tuán)隊(duì)分別建立了煙曲霉（Aspergillus fumigatus）CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，前者對(duì)聚酮合酶基因pksP進(jìn)行了敲除，但是敲除效率只有25%-53%；后者對(duì)pksP基因及鈣調(diào)磷酸酶催化亞基cnaA分別進(jìn)行了敲除，敲除效率為63%-97%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于Fuller等研究結(jié)果。究其原因可能是載體構(gòu)建時(shí)選擇的啟動(dòng)子以及選擇的策略不同，Zhang等［56］研究結(jié)果表明雙質(zhì)粒系統(tǒng)比單質(zhì)粒系統(tǒng)編輯效率要高，另外使用gpdA或niiA等強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cas9的表達(dá)也能有效提高敲除效率。Arazoe等［57］采用單質(zhì)粒策略構(gòu)建稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，成功敲除了小柱孢酮脫水酶SDH基因。研究發(fā)現(xiàn)采用U6啟動(dòng)子，敲除效率為36.1-83.6%；采用tripC啟動(dòng)子時(shí)，敲除效率為9.8%-27.1%，這表明驅(qū)動(dòng)sgRNA表達(dá)的啟動(dòng)子不同，敲除效率也不同，在構(gòu)建CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)時(shí)要選擇合適的啟動(dòng)子。

Schuster等［58］在另外一種病原真菌玉米黑粉菌（Ustilago maydis）中采用單質(zhì)粒策略構(gòu)建了CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，利用該系統(tǒng)成功敲除了成絲和致病相關(guān)基因bE1和bW2，敲除效率高達(dá)70%-100%。為檢驗(yàn)CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的脫靶現(xiàn)象，對(duì)兩個(gè)敲除株進(jìn)行了基因組重測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)敲除株基因組中分別有84和60處特定變異，突變率是人類細(xì)胞的4倍，Schuster等［58］認(rèn)為脫靶率較高的原因可能是原生質(zhì)體制備時(shí)采用了混合的破壁酶。此外，2016年4月，Science雜志刊文介紹了賓夕法尼亞州立大學(xué)Yang Yinong團(tuán)隊(duì)利用CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)敲除了雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）基因組中6個(gè)多酚氧化酶（PPO）基因中的一個(gè)，使得PPO酶活降低30%，有效減緩了雙孢蘑菇的褐變現(xiàn)象［59］。雖然該文沒有公開其具體操作過程，但是這是第一個(gè)利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)大型真菌基因組進(jìn)行編輯的報(bào)道。

5 展望

隨著大規(guī)?；蚪M測(cè)序工作的開展，越來越多的真菌基因組信息被披露，闡明基因功能、解析代謝途徑必將成為真菌后基因組時(shí)代的重大課題。簡(jiǎn)單、高效、操作性強(qiáng)的基因功能研究方法無疑會(huì)給真菌基因功能組學(xué)研究帶來一場(chǎng)巨變。

相比于ZFNs和TALENs系統(tǒng)，CRISPR/Cas9系統(tǒng)有著無可比擬的優(yōu)勢(shì)：首先，CRISPR/Cas9系統(tǒng)應(yīng)用廣泛：該系統(tǒng)選擇靶位點(diǎn)的要求是具有PAM序列，這一序列在基因組中廣泛存在，在任意基因中都能找到數(shù)個(gè)靶位點(diǎn)，因此幾乎可以對(duì)所有基因進(jìn)行編輯［14］；其次，CRISPR/Cas9系統(tǒng)組成簡(jiǎn)單，載體組裝方便：sgRNA和Cas9蛋白是該系統(tǒng)的兩大組件，根據(jù)需要可將二者置于一個(gè)轉(zhuǎn)化載體上，也可將二者置于不同的轉(zhuǎn)化載體上，具有分子生物學(xué)背景的人員可快速完成［18］；第三，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以同時(shí)對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行編輯；可以將針對(duì)多個(gè)靶點(diǎn)的sgRNA與Cas9克隆于同一個(gè)轉(zhuǎn)化載體中，一次轉(zhuǎn)化就可能獲得多個(gè)位點(diǎn)突變的突變體，大大提高了基因編輯效率［28］。

當(dāng)然，CRISPR/Cas9系統(tǒng)也存在一定局限性。（1）CRISPR/Cas9技術(shù)的靶向編輯的效率有待提高：不同來源的Cas9基因，在不同細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平和活性是不同的，造成突變效率也不同。研究表明，Cas9基因表達(dá)水平與啟動(dòng)子強(qiáng)度、轉(zhuǎn)化的材料及轉(zhuǎn)化方法有關(guān)［53，57］。在真菌中，人們大多采用真菌偏好的密碼子對(duì)Cas9酶進(jìn)行優(yōu)化，并用gpdA、β-tubulin、tripC、amyB和U6等強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cas9基因的表達(dá)，而在轉(zhuǎn)化材料上大多采用原生質(zhì)體，以此來提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯效率。（2）存在一定的脫靶效應(yīng)：CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的特異性取決于sgRNA上的識(shí)別序列。然而，在復(fù)雜的生物基因組中，sgRNA的識(shí)別序列可能會(huì)與非靶點(diǎn)DNA發(fā)生局部匹配［60］。為降低 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)，研究者開發(fā)了許多專業(yè)軟件用于尋找CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)，如Cas-OFFinder、CRISPR Design等［61］。這些在線軟件可以輔助科研人員快速篩選特定基因序列所包含的所有 CRISPR/Cas9靶點(diǎn)，有針對(duì)性的避開可能脫靶的位點(diǎn)、突變效率較高的位點(diǎn)，從而降低甚至消除脫靶現(xiàn)象。

2016年，河北科技大學(xué)的韓春雨研究小組以CRISPR/Cas9系統(tǒng)為藍(lán)本，設(shè)計(jì)了NgAgogDNA 基因編輯系統(tǒng)，該系統(tǒng)包含格氏嗜鹽堿桿菌（Natronobacterium gregoryi）Argonaute蛋白和一段長(zhǎng)24 bp的5’磷酸化的單鏈引導(dǎo)DNA（gDNA）。在人類細(xì)胞中，其切割效率與CRISPR/Cas9系統(tǒng)相當(dāng)，但是該系統(tǒng)gDNA容錯(cuò)度更低，1個(gè)堿基錯(cuò)配會(huì)影響Argonaute蛋白的切割效率，3個(gè)堿基的錯(cuò)配將會(huì)終止Argonaute蛋白的切割［62］。該系統(tǒng)可有效解決脫靶效應(yīng)，為基因編輯技術(shù)的推廣和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

目前，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)僅在模式種釀酒酵母和少量真菌中得到應(yīng)用。隨著CRISPR/ Cas9技術(shù)的改進(jìn)和完善，以及NgAgo-gDNA 基因編輯系統(tǒng)的出現(xiàn)，可以預(yù)見真菌基因組的編輯將會(huì)越來越簡(jiǎn)單，這將為真菌功能基因挖掘、品種定向改良、發(fā)育相關(guān)基因定點(diǎn)突變以及創(chuàng)制新的種質(zhì)資源帶來突破性進(jìn)展。

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（責(zé)任編輯 狄艷紅）

CRISPR/Cas Genome Editing Technology and Its Application in Fungi

YIN Chao-min FAN Xiu-zhi SHI De-fang GAO Hong
（1. Institute of Agro-Products Processing and Nuclear-Agricultural Technology，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064；2. National R & D Center for Edible Fungi Processing，Wuhan 430064）

CRISPR/Cas system is a self-defense system against exogenous virus or plasmid in bacteria and archaea. CRISPR/Cas9，an expeditious genome editing technology，was developed according to the type II CRISPR/Cas system. Nowadays，the CRISPR/Cas9 genome editing technology has broadly utilized in gene function and genetic modification research in animal，plant and microorganism. Here，we briefly introduce the structure，mechanism and classification of CRISPR/Cas system，describe the application of CRISPR/Cas9 genome editing technology in fungi，and analyze the advantages，disadvantages as well as the prospect and application values of this technology. It is aimed at providing a useful reference for researchers in genetic modification of fungi.

fungi；genome editing technology；CRISPR/Cas9；gene function

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017.03.009

2016-09-01

湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院競(jìng)爭(zhēng)性科技計(jì)劃項(xiàng)目（2016jzxjh016）

殷朝敏，男，博士，助理研究員，研究方向：真菌分子生物學(xué)；E-mail：yinchaomin@163.com

高虹，男，博士，研究員，研究方向：生物活性物質(zhì)代謝調(diào)控；E-mail：highong@163.com